新疆塔城傳統(tǒng)酸奶中乳酸菌的多樣性及發(fā)酵特性分析

蔣艾廷,李寶坤,金 丹,喬傳麗,楊 婕,趙利利

(石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000)

新疆塔城傳統(tǒng)酸奶中乳酸菌的多樣性及發(fā)酵特性分析

蔣艾廷,李寶坤*,金 丹,喬傳麗,楊 婕,趙利利

(石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000)

本實驗通過觀測發(fā)酵液的pH與溴甲酚紫平板的變色時間,從新疆塔城傳統(tǒng)酸奶中篩選出產(chǎn)酸快的30株乳酸菌。通過形態(tài)特征觀察與生理生化鑒定等傳統(tǒng)方法,結(jié)合rep-PCR基因分型和16S rDNA基因序列分析對其進(jìn)行鑒定,并分析不同種屬之間乳酸菌的蛋白酶活性、自溶度與產(chǎn)酸特性的關(guān)系。結(jié)果表明:這30株乳酸菌分別為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)12株、海氏腸球菌(Enterococcushirae)9株、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)3株、發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)與屎腸球菌(Enterococcusfaecium)各2株、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)與糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)各1株。7種乳酸菌在牛乳中均能正常生長,可以降低牛乳的pH,蛋白酶活性在3～14 U之間,自溶度在3%～29%之間,其發(fā)酵特性與菌株的種屬有著密切的關(guān)系。

乳酸菌,16s rDNA,酸奶,多樣性,發(fā)酵特性

傳統(tǒng)酸奶是少數(shù)民族日常生活中不可或缺的一種食品,與市面工業(yè)化生產(chǎn)的酸奶相比,制作工藝過程更加生態(tài)、自然,其中的益生菌種類也更加豐富。一般是由當(dāng)?shù)剞r(nóng)家婦女制作將牛乳擠在羊胃中,放在陽光下晾曬,獲得發(fā)酵劑,隨后將發(fā)酵劑轉(zhuǎn)移至塑料桶中,將牛乳擠入桶中發(fā)酵3～5 d,獲得這種天然發(fā)酵乳制品。這些發(fā)酵乳制品中的微生物經(jīng)過幾千年的自然馴化,已經(jīng)適應(yīng)了這種生存環(huán)境并且有著不同的發(fā)酵特性[1]。2015年Xiao Ping[2]等人首次從腌制的茶葉中篩選出了8株產(chǎn)酸快的乳酸菌,經(jīng)鑒定均為植物乳桿菌,極大地縮短了發(fā)酵茶的生產(chǎn)周期。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)過程中,產(chǎn)酸快的乳酸菌可以縮短發(fā)酵時間,提高生產(chǎn)效率,從而降低生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟效益[3-4]。此外研究[5-6]發(fā)現(xiàn),乳酸菌的蛋白酶活性和自溶對發(fā)酵乳制品的發(fā)酵時間和凝乳質(zhì)地以及風(fēng)味形成也有一定關(guān)系。Hannon[7]等人發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有較高的蛋白酶活性與適當(dāng)?shù)淖匀芏瓤梢钥s短干酪的成熟周期,增加產(chǎn)品風(fēng)味。孫潔等[8]通過N+注入的誘變方式獲得了自溶度較高的唾液鏈球菌和德氏乳桿菌,對控制產(chǎn)品的成熟周期及感官品質(zhì)具有良好實用價值。目前,研究學(xué)者[9-11]針對發(fā)酵食品中某些優(yōu)良特性乳酸菌的篩選作了大量研究,但大多采用傳統(tǒng)的鑒定方法,操作相對復(fù)雜且成本過高。重復(fù)片段基因指紋分析(Repetitive-element PCR genome fingerprinting,rep-PCR)是一種以核糖核酸為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)分型方法[12],被廣泛地運用在許多農(nóng)業(yè)、環(huán)境與醫(yī)藥中[13]。Dirk等[14]發(fā)現(xiàn)rep-PCR能夠快速、可靠地對發(fā)酵食品中的乳桿菌和其他乳酸菌進(jìn)行基因分型。

本研究通過對傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中的乳酸菌的產(chǎn)酸能力進(jìn)行評價,篩選出在酸奶發(fā)酵過程中產(chǎn)酸快的菌株,采用生理生化實驗與現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法進(jìn)行種屬鑒定,探討傳統(tǒng)酸奶中產(chǎn)酸快乳酸菌的菌相構(gòu)成,分析不同種屬乳酸菌的產(chǎn)酸特性、自溶度、蛋白酶活性,為優(yōu)良發(fā)酵特性的發(fā)酵劑生產(chǎn)菌株的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 由石河子大學(xué)食品學(xué)院篩選并保藏;細(xì)菌基因組總DNA提取試劑盒 北京Trans Gen公司;瓊脂糖、溶菌酶 美國Sigma公司;2×Taq PCR Master Mix 廣州東盛生物有限公司;其他試劑及培養(yǎng)基均為國產(chǎn)分析純。

高速冷凍離心機(5417R) 德國Eppendorf公司;PCR擴增儀(TC-512) 英國Techne公司;凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國Binder公司;超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;電熱蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與產(chǎn)酸快菌株的篩選 采用液體MRS培養(yǎng)基將凍藏的乳酸菌活化兩次,稀釋涂布于含有0.06%溴甲酚紫指示劑的MRS瓊脂平板中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,觀察并篩選出使平板變黃的菌株。謝靜等[15]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌的產(chǎn)酸特性與生長周期有關(guān),處于對數(shù)期的乳酸菌生長與產(chǎn)酸的速率最大。將能使溴甲酚紫變黃的菌株活化后,接入MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)16 h到達(dá)對數(shù)生長末期,用pH計測定培養(yǎng)基的pH,ΔpH表示乳酸菌從0 h生長至16 h的產(chǎn)酸量。挑出ΔpH較大的菌株于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生理生化實驗 對篩選出來產(chǎn)酸快的乳酸菌進(jìn)行吲哚實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、葡萄糖產(chǎn)氣等生理生化實驗,實驗方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]、《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[17]。

1.2.3 16S rDNA 基因序列分析

1.2.3.1 乳酸菌基因組DNA的提取 應(yīng)用Gen Elute TM細(xì)菌總DNA提取試劑盒對乳酸菌分離菌株的DNA進(jìn)行提取,按照說明書操作。

1.2.3.2 rep-PCR指紋圖譜分析 rep-PCR所用的引物為單引物(GTG)5,序列為(5′-GTG GTG GTG GTG GTG-3′)[18],PCR反應(yīng)體系為25 μL,引物1 μL,DNA稀釋液1 μL,預(yù)混液12.5 μL,補充10.5 μL dd H2O至終體積為25 μL。擴增的反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性7 min;94 ℃變性30 s,40 ℃退火1 min,65 ℃延伸8 min,執(zhí)行35個循環(huán);65 ℃維持16 min。1.5%的瓊脂糖凝膠(含EB)電泳(電壓55 V,電泳時間2 h),檢測擴增結(jié)果,UVI凝膠成像系統(tǒng)照相,記錄條帶譜。

電泳結(jié)果通過比對每條條帶的有(1)或無(0)構(gòu)建n×t數(shù)據(jù)矩陣,如果條帶存在,則記為1，不存在,則記為0。數(shù)據(jù)矩陣使用Jaccard系數(shù)(Jaccard’s coefficient)檢測不同菌株間的相似性[19]。使用Ntsys 2.1軟件進(jìn)行非加權(quán)組平均法(unweighted pair groupmethod with arithmetic mean,UPGMA)歸類分析構(gòu)建樹形圖,并檢測共性分類相關(guān)系數(shù)。

1.2.3.3 16S rDNA基因序列測定 應(yīng)用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物對細(xì)菌16S rDNA的V6～V8區(qū)段進(jìn)行PCR擴增。上游引物為U968(5′-AACGCGAAGAACCTT AC-3′);下游引物為L1401(5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′)[20]。PCR反應(yīng)體系為25 μL,引物各1 μL,1 μL的DNA稀釋液,預(yù)混液12.5 μL,補充9.5 μL dd H2O至終體積為25 μL。PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min,30個循環(huán)(94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,

1.2.3.4 同源性分析 采用MEGA5.0中的鄰接法(Neighbour-joining)將測序所得序列與NCBI中BLAST獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.4 發(fā)酵牛乳實驗 將7株乳酸菌用MRS培養(yǎng)基活化2代,使其恢復(fù)活力,按4%的接種量已滅菌的牛乳中,每隔2 h測定pH。

1.2.5 自溶度的測定 活化菌株MRS肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期,離心收集菌體細(xì)胞(4000 r/min,10 min),以無菌水洗滌兩次,所得菌體細(xì)胞重懸于PBS緩沖液(50 mmol/L,pH6.5)中,調(diào)整菌液吸光值(OD650nm)至1.0左右,置于37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng),于0、24 h取樣測定。自溶度計算公式如下[21]。

式(1)

式(1)中:A1為菌液吸光值;A2為菌液初始吸光值。

1.2.6 蛋白酶活性測定 蛋白酶活性的檢測采用Folin酚法[22],于680 nm波長下測定吸光值,以不加酶液的體系設(shè)置空白對照。酶活力定義:在40 ℃、pH7.5條件下,1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量為一個酶活性單位U。計算公式為:

式(2)

式(2)中:ΔA為樣品與空白對照的吸光值之差;K為吸光常數(shù);n為反應(yīng)總體積,mL;t為反應(yīng)時間,min。根據(jù)本次實驗中酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定K=83.15。

表1 生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Result of identification physico-chemical properties

注：“+”代表陽性反應(yīng),“-”代表陰性反應(yīng),“N”代表未測定。)

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excle 2007與origin 2016軟件處理并制作圖表。

2 結(jié)果與分析

圖1 培養(yǎng)16h 發(fā)酵液pH的變化Fig.1 The changing of fermentation broth pH after culture 16 hours

2.1 產(chǎn)酸快乳酸菌的篩選

如圖1所示,培養(yǎng)16 h后,不同菌株的發(fā)酵液,ΔpH均增加1.0以上,說明大部分菌株都能產(chǎn)生有機酸,但產(chǎn)酸能力差異較大,產(chǎn)酸能力最弱的菌株為S219,ΔpH為1.04,產(chǎn)酸能力最強的菌株為B13,ΔpH為2.59。大多數(shù)菌株的ΔpH都集中在1.5～2.5。選取ΔpH>2.0的30株乳酸菌,近一步研究。

2.2 生理生化實驗特征

圖3 rep-PCR產(chǎn)物電泳條帶Fig.3 Electrophoresis banding of rep-PCR

圖4 基于rep-PCR指紋構(gòu)建的相關(guān)性樹狀圖Fig.4 Dendrogram representing relationships based on rep-PCR fingerprints

如圖2所示,平板中的菌落多為表面光滑、邊緣整齊、中央有凸起的白色或半透明狀。桿菌顯微形態(tài)為長桿狀或短桿狀,多數(shù)呈鏈狀排列。球菌呈圓形或卵圓形,一般以單個、成鏈或成片排列。如表1所示,16株桿菌經(jīng)過硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、H2S實驗,結(jié)果均為陰性,可初步鑒定為乳桿菌屬;其余14株球菌的實驗結(jié)果為:硝酸鹽還原實驗陰性、運動性實驗陰性、6.5%NaCl生長實驗陽性、10 ℃、45 ℃生長實驗陽性、葡萄糖產(chǎn)氣實驗陰性,初步確定為腸球菌屬。

圖2 乳酸菌顯微形態(tài)與菌落形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology and colony morphology of lactic acid bacteri

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 指紋圖譜相關(guān)性分析 圖譜共產(chǎn)生7種不同類型的可重復(fù)條帶(圖3),產(chǎn)生條帶最大為2000bp左右,最短長度為200 bp左右。實驗結(jié)果可以根據(jù)菌株的相關(guān)性樹狀圖(圖4)被分為7組,第一組為Y234、Y25、Y114、G28、Y15、B28、B13、B14、B11、Y27、G211與Y14,第二組為S157、S216、S155、E3、S162、11-6、G218、G215、TC10;第三組為G110、G315;第四組為S160;第五組為G311、EZH5;第六組為Y13、G25、B215第七組為Y28,其相關(guān)系數(shù)均在85%～100%之間。

2.3.2 16S rDNA PCR擴增 經(jīng)過DNA指紋圖譜聚類分析將30株乳酸菌分為7類,每一類選出1株菌作為代表菌株進(jìn)行16s rDNA擴增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得約450 bp的特異性擴增條帶(圖5),符合測序要求。

圖6 代表菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree establishment of representative Lactobacillus and standard strain 16S rDNA gene sequences

圖5 PCR擴增的16S r DNA序列瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 PCR amplification agarose gel electrophoresis of 16S rDNA partial sequenc

2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和乳酸菌的鑒定 從圖5可以看出菌株G215與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcushirae處于同一分支,且相似性為100%,故將其鑒定為Enterococcushirae。菌株Y13與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcusdurans處于同一分支,且相似性為99%,因此可將其歸為Enterococcusdurans。菌株G315與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcusfaecium處于同一分支,且相似性為99%,故將其鑒定為Enterococcusfaecium。

表2 產(chǎn)酸快乳酸菌的16S rRNA基因序列分析結(jié)果Table 2 Analysis results of 16S rRNA gene sequences from rapid acidification actic acid bacteria

菌株S160與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcusfaecalis處于同一分支,且相似性為100%,故將其鑒定為Enterococcusfaecalis。菌株B11與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillusplantarum處于同一分支,且相似性為99%,因此可將其歸為Lactobacillusplantarum。菌株Y28與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)ediococcusacidilactici處于同一分支,且相似性為100%,故將其鑒定為Pediococcusacidilactici。菌株EZH5與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillusfermentum處于同一分支,且相似性為99%,故將其鑒定為Lactobacillusfermentum。

2.4 產(chǎn)酸快乳酸菌的多樣性分析

由表2可知,新疆傳統(tǒng)酸奶中產(chǎn)酸快的乳酸菌主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)和片球菌屬(Pediococcus),在篩選出的30株產(chǎn)酸快的乳酸菌中,乳桿菌屬占46.7%,其中植物乳桿菌(Lb.plantarum)12株,發(fā)酵乳桿菌(Lb.fermentim)2株。腸球菌屬占50%,包括屎腸球菌(E.faecium)2株、糞腸球菌(E.faecalis)1株、耐久腸球菌(E.durans)3株和海氏腸球菌(E.hirae)9株。片球菌屬僅包含乳酸片球菌(P.acidilactici),所占比例最低為3.3%。

2.5 牛乳發(fā)酵實驗

如圖7所示,7種乳酸菌在牛乳中均能正常生長,由于種子液的活力較強,從發(fā)酵第0 h時,牛乳的pH開始急劇的下降,發(fā)酵16 h后牛乳的pH由6.55降低至4.7以下,形成凝乳但不同的菌株在牛乳中的產(chǎn)酸能力有一定的差異,發(fā)酵16 h后,接種植物乳桿菌B11的牛乳pH最低為4.21,其次是接種海氏腸球菌G215的牛乳,pH為4.28,接種發(fā)酵乳桿菌EZH5、糞腸球菌S160、乳酸片球菌Y28、耐久腸球菌Y13的牛乳pH分別為4.5、4.6、4.63、4.65,接種屎腸球菌G315 的牛乳pH最高為4.70。

圖7 不同乳酸菌在牛乳中的產(chǎn)酸能力Fig.7 Different lactic acid bacteria acid producing ability in milk

2.6 不同乳酸菌的自溶度與蛋白酶活性

如圖8所示,乳酸菌的自溶度和蛋白酶活性與菌株的種類有很大的關(guān)系。發(fā)酵乳桿菌的自溶度最高為28.5%,其次為乳酸片球菌與植物乳桿菌分別為18.3%與12.4%,海氏腸球菌、耐久腸球菌、屎腸球菌、糞腸球菌的自溶度均低于10%,其中耐久腸球菌的自溶度最低為3.8%,幾乎不發(fā)生自溶。植物乳桿菌的蛋白酶活性最高為13.71 U,其次是耐久腸球菌和屎腸球菌,其蛋白酶活性分別為7.16 U與7.07 U,海氏腸球菌與發(fā)酵乳桿菌的蛋白酶活性分別為5.41 U和5.33 U,糞腸球菌的蛋白酶活性為4.63 U,乳酸片球菌的蛋白酶活性最低為3.40 U。

圖8 不同乳酸菌的蛋白酶活性與自溶度Fig.8 The protease activity and autolysis of different lactic acid bacteria

3 結(jié)論與討論

新疆傳統(tǒng)酸奶是一個復(fù)雜的微生物體系,其中的乳酸菌資源具有無可比擬的生物多樣性和基因多樣性[23]。研究表明,傳統(tǒng)酸奶在發(fā)酵過程中起主要作用的乳酸菌屬主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬與乳球菌屬[24]。袁雪林等[25]通過傳統(tǒng)的方法分離了新疆喀什地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳中的乳酸菌,共56株7個種,分別為德氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雞乳桿菌、屎腸球菌與耐久腸球菌,其優(yōu)勢菌株為德氏乳桿菌。呼斯楞等[26]對內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的生物多樣性進(jìn)行了研究,分離出的24株乳酸菌分別屬于乳球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串株菌屬。本實驗篩選出的30株乳酸菌通過DNA指紋圖譜與序列分析共鑒定出3個屬7個種的快速產(chǎn)酸乳酸菌。其中植物乳桿菌、耐久腸球菌、發(fā)酵乳桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌與前人的研究相一致。此外,本實驗未檢測出德氏乳桿菌與嗜熱鏈球菌但檢測出了海氏腸球菌與乳酸片球菌,這可能與傳統(tǒng)酸奶的加工環(huán)境與地理位置有關(guān)。

在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中,乳酸菌除了對健康有益外,還具有酸化、形成特有組織結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)等功能[27]。不同乳酸菌組成的發(fā)酵劑的酸化能力、自溶度以及蛋白酶活性等發(fā)酵特性各不相同,Hebert[28]提出,快速產(chǎn)酸乳酸菌應(yīng)在16 h內(nèi)將牛乳pH降低至酪蛋白等電點并凝乳。本實驗篩選出的7種乳酸菌在牛乳中發(fā)酵的凝乳時間均小于16 h,屬于快速產(chǎn)酸乳酸菌,但不同種乳酸菌的蛋白酶活性與自溶度相差很大。實驗發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌的產(chǎn)酸速度最快且蛋白酶活性最高而乳酸片球菌的產(chǎn)酸速度最慢且蛋白酶活性最低,可能是在發(fā)酵牛乳過程中蛋白酶能夠?qū)⑴Ｈ橹写蠓肿拥鞍踪|(zhì)分解成小分子的多肽,有利于乳酸菌的生長。

本實驗通過微生物生理生化實驗與DNA指紋圖譜技術(shù)篩選出能快速產(chǎn)酸的30株7個種的乳酸菌,發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)酸奶的制作過程中植物乳桿菌與海氏腸球菌為優(yōu)勢菌種。乳酸菌株之間的特異性決定了其發(fā)酵特性,復(fù)合菌株發(fā)酵對發(fā)酵乳制品的品質(zhì)可能有一定的促進(jìn)作用。

[1]董曉婉,李寶坤,李開雄,等. 新疆蒙古族和哈薩克族傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌多樣性的比較[J]. 食品工業(yè)科技,2013,21(59):162-166.

[2]Xiao P,Huang Y,Yang W,et al. Screening lactic acid bacteria with high yielding-acid capacity from pickled tea for their potential uses of inoculating to ferment tea products[J]. J Food Sci Technol,2015,52(10):6727-6734.

[3]趙婧,李慧,張玉玉,等. 高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選、鑒定和生長特性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(3):173-176.

[4]Tetsuya Masuda,Ayako Hidaka,Naoko Kondo,et al. Intracellular Enzyme Activities and Autolytic Properties of Lactobacillus Acidophilus and Lactobacillus Gasseri[J]. Food Sci. Technol,2005,11(3):328-331.

[5]張爽,張?zhí)m威,韓雪. 乳酸菌蛋白酶與發(fā)酵乳制品質(zhì)量相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報,2015,55(12):1530-1536.

[6]孫卓,呂加平,張佳程,等. 乳酸菌自溶對切達(dá)干酪成熟中蛋白質(zhì)分解的影響[J]. 中國乳品工業(yè),2010,38(12):12-14.

[7]Hannon J A,Wilkinson M G,Delahunty C M,et al. Use of autolytic starter systems to accelerate the ripening of Cheddar cheese[J]. 2003,13(4):313-323.

[8]孫潔,呂加平,劉鷺,等. N+注入誘變高自溶度的乳酸菌突變株[J]. 核農(nóng)學(xué)報,2010,24(4):684-688.

[9]何捷,曾小群,呂鳴春,等. 新疆酸奶中高產(chǎn)蛋白酶與產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的篩選[J]. 食品科學(xué),2015,36(17):130-133.

[10]王剛,田豐偉,劉小鳴,等. 2株具有優(yōu)良體外抗氧化能力乳酸菌的篩選與鑒定[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(15):149-153.

[11]張旭,趙斌,張香美,等. 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及細(xì)菌素相關(guān)基因的分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2013,18(4):168-177.

[12]Dombek P E. Use of repetitive DNA sequences and the pcr to differentiate Escherichia coli isolates from human and animal sources[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(6):2572-2577.

[13]Ishii S,Sadowsky M J. Applications of the rep-PCR DNA fingerprinting technique to study microbial diversity,ecology and evolution[J]. Environ Microbiol,2009,11(4):733-740.

[14]Dirk Gevers. Applicability of rep-PCR fingerprinting for identification of Lactobacillus species[J]. FEMS Microbiology Letters,2001,205(1):31-36.

[15]謝靜,熊善柏,曾令彬,等. 分離自臘魚的乳酸菌生長及產(chǎn)酸特性[J]. 食品科學(xué),2012,33(11):147-150.

[16]凌代文. 乳酸菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,1999:1-25.

[17]東秀珠,蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京:科學(xué)出版社,2001:289-294.

[18]Versalovic J,Schneider M,De Bruijin F J,et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction[J].Methods in Molecular and Cellular Biology,1994,5(1):25-40.

[19]Waltenbury,D.R,L. Leduc,G. Ferrooni. The use of RAPD genomic fingerprinting to study reatedness in strains of Acidithiobacillus ferrooxidans[J]. Journal of micoobiological methods,2005,62(1):103-112.

[20]Pelt-Verkuil,Elizabeth van,Belkum,et al. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification[M]. Springer Netherlands,2008:63-90.

[21]Ken-ji Yokoia b,Ken-Ichi Kawasakib,Akira Taketoc,et al.Characterization of lytic activities of Latobacillus gasseri. with special reference to autolysis[J]. Int J Food Microbiol,2004,96(03):273-279.

[22]盧燕云,林建國,李明. 復(fù)合誘變選育酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株[J]. 中國釀造,2009,202(1):49-51.

[23]Cludia N,Manuel A C,Jorge S,et al. Study of the volatile components of a candied plum and estimation of their contribution to the aroma[J]. Food Chemistry,2008,111(4):897-905.

[24]Beukes,Elisabeth M. Bester,Bernie H. Mostert,et al.The microbiology of South African traditional fermented milks[J]. International Journal of Food Microbiology,2001,63(3):189-197.

[25]袁雪林,楊潔,胡敏,等. 新疆喀什地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳中乳酸菌多樣性的初步分析[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(10):202-204.

[26]呼斯楞,劉紅新,于潔,等. 內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌的多樣性分析[J]. 微生物學(xué)通報,2016,43(5):984-990.

[27]孟祥晨. 乳酸菌與乳品發(fā)酵[M]. 北京:科學(xué)出版社,2009:350-360.

[28]Hebert E M,Raya R R,Tailliez P,et al. Characterization of natural isolates of Lactobacillus strains to be used of Lactobacillus strains to be used as starter cultures in dairy fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology,2000,59(2):19-27.

Analysis of the diversity and fermentation characteristics of lactic acid bacteria in traditional yogurts from TaCheng,Xinjiang

JIANG Ai-ting,LI Bao-kun*,JIN Dan,QIAO Chuan-li,YANG Jie,ZHAO Li-li

(College of Food Engineering,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

In this experiment,30 lactic acid bacterias with fast acid-producting capacity were screened from the traditional yogurt of Tacheng in Xinjiang by observing the pH of the fermentation broth and the discoloration time of bromocresol purple plate. Identified them in different ways,for example,morphological characteristics,physiological and biochemical identification,rep-PCR genotyping,16S rDNA gene sequence analysis and so on,and furtherly analysised the relationship between the acid production characteristics and protease activity and autolysis rates of different kinds of lactic acid bacteria. The results showed that there were 12 strains ofLactobacillusplantarum,9 strains ofEnterococcushirae,3 strains ofEnterococcusdurans,2 strains ofLactobacillusfermentumandEnterococcusfaeciumrespectively,1 strain ofPediococcusacidilacticiandEnterococcusfaecalisrespectively. It was worth mentioning that all of 7 kinds of lactic acid bacteria could normally grow in the milk and reduce the pH of milk,the protease activity was between 3 and 14 U,the autolysis rates was between 3% and 29%,and there was a close relationship between the fermentation characteristics and the species of strains.

Lactic acid bacteria;16s rDNA;yogurt;finger printing;fermentation characteristics

2017-02-21

蔣艾廷(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：乳制品加工與安全，E-mail:jiangaitingw@163.com。

*通訊作者:李寶坤(1979-),男，博士，副教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與安全，E-mail:libaokun1998@163.com。

國家自然科學(xué)基金地區(qū)項目(31560444);石河子大學(xué)重點科技攻關(guān)(gxjs2014-2dggo7)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)15-0122-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.024