Tim- 3通過(guò)膽固醇酯水解酶影響巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程的機(jī)制

劉菲菲 李晨光 孫大鵬 張鳳香

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

·基礎(chǔ)研究·

Tim- 3通過(guò)膽固醇酯水解酶影響巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程的機(jī)制

劉菲菲 李晨光 孫大鵬 張鳳香

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

目的 觀察Tim- 3是否通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇脂水解酶(CEH)的表達(dá)干擾泡沫化細(xì)胞的形成，進(jìn)而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。方法 Western印跡檢測(cè)CEH蛋白的表達(dá)；液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定THP- 1 巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出情況；HPLC檢測(cè)胞內(nèi)脂質(zhì)含量；油紅O染色顯示胞內(nèi)脂滴情況；ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)- α、MIF、白細(xì)胞介素(IL)- 10的分泌情況。結(jié)果 Ad- Tim- 3組細(xì)胞中CEH的表達(dá)被明顯抑制，胞內(nèi)膽固醇流出減少，胞內(nèi)總膽固醇(TC)、膽固醇酯(CE)及游離膽固醇(FC)的含量明顯增加，TNF- α和MIF分泌增多，IL- 10的分泌減少；Ad- CEH組和Ad- Tim- 3+Ad- CEH組細(xì)胞中CEH的表達(dá)水平被明顯增強(qiáng)，胞內(nèi)膽固醇流出增加，胞內(nèi)TC、CE及FC的含量明顯減少，TNF- α和MIF分泌減少，IL- 10分泌增多。結(jié)論 Tim- 3可以通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞內(nèi)CEH的活性抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

膽固醇酯水解酶；巨噬細(xì)胞；Tim- 3

Tim是一組表達(dá)在巨噬細(xì)胞表面的受體蛋白家族，Tim- 3是TIM家族成員之一，屬于適應(yīng)性免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控分子，早期研究發(fā)現(xiàn)Tim- 3主要在Th1細(xì)胞上表達(dá)，與炎癥性疾病的發(fā)病有關(guān)，可通過(guò)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性干擾動(dòng)脈粥樣硬化(AS)等炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔1，2〕。膽固醇酯水解酶(CEH)又叫膽鹽刺激脂酶，在AS斑塊發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。它能催化膽固醇酯(CE)水解為游離膽固醇(FC)，降低斑塊內(nèi)纖維組織含量，減少CE在細(xì)胞內(nèi)聚積，抑制巨噬細(xì)胞形成和T細(xì)胞浸潤(rùn)〔3，4〕。本研究主要探討Tim- 3對(duì)巨噬細(xì)胞上CEH表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可能機(jī)制，進(jìn)而為AS的防治提供新靶點(diǎn)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人單核巨噬細(xì)胞THP- 1(上海生命科學(xué)研究院); ox- LDL(北京生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人CEH抗體、鼠抗人Tim- 3抗體(上海生工)；小鼠抗β- actin抗體、山羊抗鼠 IgG (中杉金橋公司)；ECL發(fā)光試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、泡沫化處理 將人THP- 1細(xì)胞以每孔1.0×106個(gè)細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清(FBS)，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基的六孔板中，在 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。加入100 ng/ml佛波醇12肉- 豆蔻酸酯13- 乙酸酯(PMA)，作用72 h，細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。在50 mg/ml ox- LDL， 0.3%牛血清白蛋白(BSA)的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基中共同孵育48 h，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為Control組、Ad- CEH組、Ad- Tim- 3+Ad- CEH組、Ad- Tim- 3組，按分組分別作用各組泡沫細(xì)胞48 h。

1.3 油紅O染色 培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛脫水- PBS中固定10 min。60%異丙醇漂洗，用0.3%油紅O在60%異丙醇中染色巨噬細(xì)胞10 min，再用60%異丙醇洗滌; 然后用蘇木精復(fù)染巨噬細(xì)胞3 min。 用水充分洗滌后，用顯微鏡以400倍放大倍數(shù)拍攝巨噬細(xì)胞。

1.4 膽固醇流出測(cè)定 培養(yǎng)上述細(xì)胞，然后用0.2 μCi/ml〔3H〕膽固醇標(biāo)記。 72 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，并在含有0.1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的RPMI 1640培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜，使所有細(xì)胞庫(kù)中的〔3H〕膽固醇平衡。 平衡的〔3H〕膽固醇標(biāo)記的細(xì)胞用PBS洗滌，并在含有RPMI 1640培養(yǎng)基和0.1%BSA的2 ml流出培養(yǎng)基中孵育。 在指定的時(shí)間獲得150 μl流出介質(zhì)樣品，并通過(guò)0.45 μm過(guò)濾器除去任何浮動(dòng)細(xì)胞。 單層在PBS中洗滌2次，并用異丙醇提取細(xì)胞脂質(zhì)。 然后通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量培養(yǎng)基和細(xì)胞相關(guān)的〔3H〕膽固醇。 通過(guò)公式計(jì)算流出百分比：〔總培養(yǎng)基計(jì)數(shù)/(總細(xì)胞計(jì)數(shù)+總培養(yǎng)基計(jì)數(shù))〕×100%。

1.5 HPLC分析 細(xì)胞用PBS洗滌3次。 將0.5%NaCl加入約50～200 μg細(xì)胞蛋白/ml。 使用超聲處理器將細(xì)胞超聲處理2 min。 使用BCA試劑盒測(cè)量細(xì)胞溶液中的蛋白質(zhì)濃度。 使用0.1 ml等分試樣細(xì)胞溶液(含有5～20 μg蛋白質(zhì))測(cè)量FC，另一等分試樣用于總膽固醇(TC)檢測(cè)。 FC溶于異丙醇(1 mg膽固醇/ml)，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆?。蛋白沉淀，并?5℃下以1 500 r/min離心10 min。 將10 μl上清液樣品應(yīng)用于HLPC柱。使用異丙醇∶正庚烷∶乙腈(35∶13∶52)以1 ml/min的流速洗脫柱8 min。

1.6 Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞溶液作用48 h后，冷PBS清洗2次，提取細(xì)胞總蛋白，按照試劑盒說(shuō)明書用BCA法定量。電泳分離后通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h。分別加入1∶500 Tim- 3抗體、 1∶1 000 CEH單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗鼠 IgG (1∶200)緩沖液，4℃孵育2 h。洗膜3次后凝膠成像。

1.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況 具體步驟均按照ELISA試劑盒說(shuō)明操作。誘導(dǎo)后泡沫細(xì)胞接種于24孔板中，按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞PMA的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后，PBS洗3遍，在分組處理48 h后收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液。揭去封板膜后室溫孵育30 min，期間配置洗滌液，洗滌液洗滌后棄去、甩干，重復(fù)5次。最后加入顯色劑，15 min后加入終止液終止，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)順序測(cè)定各孔吸光度(OD值)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，所有數(shù)據(jù)均采用ANOVA方法進(jìn)行處理，計(jì)量資料分析采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Tim- 3對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)CEH表達(dá)的影響 與Control組(93.231±2.129)比較，Ad- Tim- 3組巨噬細(xì)胞內(nèi)CEH的表達(dá)(50.736±2.706)被明顯抑制，而Ad- Tim- 3+Ad- CEH組(127.023±5.895)和Ad- CEH組(126.442±5.561)巨噬細(xì)胞內(nèi)CEH的表達(dá)均被明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 Ad- Tim- 3和Ad- CEH對(duì)巨噬細(xì)胞中CEH表達(dá)的影響

2.2 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響 各組作用細(xì)胞48 h后，油紅O染色結(jié)果顯示，Control組細(xì)胞陽(yáng)性率為45.76%±2.95%；Ad- Tim- 3組細(xì)胞陽(yáng)性率為67.82%±4.02%；Ad- Tim- 3+Ad- CEH組細(xì)胞陽(yáng)性率為26.31%±2.12%；Ad- CEH組細(xì)胞陽(yáng)性率為27.26%±2.87%。

2.3 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的影響 Control組膽固醇流出(9.25±0.41),Ad- Tim- 3組明顯抑制膽固醇流出(6.24±0.25)；而Ad- Tim- 3+Ad- CEH組(16.11±0.30)和Ad- CEH組(14.76±0.53)顯著增加巨噬細(xì)胞膽固醇流出。

2.4 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響 與Control組比較，Ad- Tim- 3組細(xì)胞內(nèi)CE、FC、TC含量均明顯增加(P<0.05)；而Ad- Tim- 3+Ad- CEH組和Ad- CEH組細(xì)胞內(nèi)CE、FC、TC含量明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 HPLC分析各組膽固醇代謝結(jié)果

與Control組比較：1)P<0.05

2.5 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH對(duì)巨噬細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子分泌的影響 與Control照組比較，Ad- Tim- 3組細(xì)胞上清中TNF- α和MIF的分泌均明顯增多，而IL- 10的分泌均被明顯抑制(P<0.05)；Ad- Tim- 3+Ad- CEH組和Ad- CEH組細(xì)胞上清中TNF- α和MIF的分泌被明顯抑制，而IL- 10的分泌明顯增多(P<0.05)。 見(jiàn)圖2。

與Control組比較：1)P<0.05 圖2 Ad- Tim- 3和Ad- CEH對(duì)THP- 1 巨噬細(xì)胞上清中TNF- α、MIF、IL- 10分泌的影響

3 討 論

巨噬細(xì)胞是AS形成的主要效應(yīng)細(xì)胞，其影響AS形成的機(jī)制是通過(guò)吞噬血液中的大量脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，而形成的泡沫細(xì)胞繼續(xù)聚集脂質(zhì)，不斷大量蓄積的脂質(zhì)又可以進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎癥因子分泌增加，而分泌的炎癥因子可進(jìn)一步加速AS的形成〔5〕。

Tim- 3表達(dá)在CD4+Th1細(xì)胞上,可調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞反應(yīng)，在自身免疫性疾病、AS、抗感染等中發(fā)揮一定作用〔6，7〕。另外，Tim- 3可促進(jìn)TNF- α、IL- 6分泌及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞共刺激分子表達(dá)，即影響炎癥介質(zhì)如 TNF- α、MIF、IL- 10的釋放〔8〕。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)〔9，10〕，CEH在AS的形成過(guò)程中起到十分重要的作用，CEH的表達(dá)水平與AS的易感性呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的Tim- 3可以明顯抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)CEH的表達(dá)，但當(dāng)CEH的表達(dá)被增強(qiáng)時(shí)Tim- 3的這種抑制作用不再存在。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，增加Tim- 3的表達(dá)可以進(jìn)一步加強(qiáng)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，增加CE在巨噬細(xì)胞內(nèi)的聚集，減少 FC 的流出。但當(dāng)增強(qiáng)CEH的表達(dá)時(shí)Tim- 3的這種促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成和抑制膽固醇外流的作用卻被明顯降低。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，Tim- 3可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)CEH的表達(dá)來(lái)影響TNF- α、MIF和IL- 10細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而進(jìn)一步影響AS的形成與發(fā)展。

綜上，Tim- 3可能是通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)CEH的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積來(lái)影響AS病變的發(fā)生發(fā)展。但其在 AS 形成過(guò)程中的作用還需進(jìn)一步研究。

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〔2017- 01- 17修回〕

(編輯 李相軍)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81541099);遼寧省自然科學(xué)基金(2016010330- 301)

張鳳香(1978- )，女，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。

劉菲菲(1982- )，女，碩士，醫(yī)師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。

R33

A

1005- 9202(2017)15- 3641- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.001