桑葉茯磚茶“金花”菌的分離鑒定

邵元元 肖建中 李飛鳴 李一平 張 俊 鄒湘月 龍?zhí)浦?黃仁志 顏新培

(湖南省蠶?？茖W(xué)研究所，湖南長沙 410127)

桑葉茯磚茶“金花”菌的分離鑒定

邵元元 肖建中 李飛鳴 李一平 張 俊 鄒湘月 龍?zhí)浦?黃仁志 顏新培

(湖南省蠶?？茖W(xué)研究所，湖南長沙 410127)

從桑葉茯磚茶中分離出“金花”菌，經(jīng)過繼代純化，以長勢較好的桑葉茯磚茶“金花”菌作為供試菌株，用傳統(tǒng)微生物形態(tài)學(xué)鑒定方法，觀察其形態(tài)特征與生長特性等；運用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的有性型和無性型形態(tài)，并在掃描電鏡下觀察菌株的子囊孢子、分生孢子等，同時結(jié)合ITS測序，在分子水平上對分離菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：桑葉茯磚茶中分離的“金花”菌，菌株的形態(tài)特征和生長特性、光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡顯微特征與冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)相似，通過ITS序列分析，確認(rèn)該桑葉茯磚茶“金花”菌株為冠突散囊菌。試驗鑒定為借鑒傳統(tǒng)茯磚茶的相關(guān)研究成果開展桑葉茯磚茶品質(zhì)形成機(jī)理、功能性作用及其加工工藝比較研究奠定了基礎(chǔ)。

桑葉茯磚茶；“金花”菌；冠突散囊菌；分離培養(yǎng)；形態(tài)學(xué)鑒定

茯磚茶是以三級或四級黑毛茶為原料，經(jīng)過篩分、拼配、汽蒸、渥堆、筑制、發(fā)花、干燥和成品包裝等工藝制成的黑茶產(chǎn)品[1]。茯磚茶內(nèi)生長著大量特征性優(yōu)勢益生菌——冠突散囊菌，冠突散囊菌的閉囊殼色澤金黃，俗稱“金花”?！敖鸹ā本貌璐u內(nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，抑制其它微生物的生長繁殖[2]，產(chǎn)生各種胞外酶[3-5]和生物活性物質(zhì)[6-7]，賦予了茯磚茶獨特的品質(zhì)和較強(qiáng)的降脂、降壓以及調(diào)節(jié)糖類代謝等功效[8]，并對人體沒有毒副作用[9]，因此“金花”的數(shù)量和質(zhì)量己成為判斷茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要標(biāo)志[10]。

茯磚茶一直以來以茶科茶屬的茶樹葉為原料，2013年湖南省蠶?？茖W(xué)研究所桑葉黑茶創(chuàng)新團(tuán)隊，首次以桑葉毛茶為原料，接種培養(yǎng)從安化茯磚茶中分離得到的“金花”菌株制作茯磚茶獲得成功。李飛鳴等[11]和邵元元等[12]進(jìn)行了以?？粕俚纳Ｈ~和黑毛茶制作桑葉茯磚茶和復(fù)配桑葉茯磚茶的工藝研究及其他有關(guān)桑葉茯磚茶的研究。本文釆用微生物經(jīng)典鑒定法[13-14]，對桑葉茯磚茶“金花”菌株的形態(tài)特征進(jìn)行了光學(xué)顯微鏡與掃描電鏡分析研究，并在微生物分類學(xué)上對桑葉茯磚茶“金花”菌進(jìn)行了鑒定，期望為桑葉茯磚茶的發(fā)花工藝、品質(zhì)形成機(jī)理與功能性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試桑葉茯磚茶 2014年安化云天閣茶葉有限公司生產(chǎn)的桑葉茯磚茶。

1.1.2 供試藥劑 硝酸鈉(分析純)、硫酸亞鐵(分析純)，均為臺山市化工有限公司產(chǎn)品；磷酸氫二鉀(分析純)、氯化鉀(分析純)、蔗糖(分析純)、石炭酸(分析純)，均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；七水硫酸鎂(分析純)，西隴化工股份有限公司產(chǎn)品；乳酸(分析純)，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司產(chǎn)品；瓊脂，Biosharp公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物試劑盒、擴(kuò)增引物ITS1、擴(kuò)增引物ITS4，均為生工生物工程有限公司產(chǎn)品；棉蘭染色劑，羅基生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 LRH-150培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；AL204型電子天平，梅特勒-托利多(中國)儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；JSM-6380LV型電子顯微鏡，日立電子株式會社產(chǎn)品；SS3型多功能液晶數(shù)碼顯微鏡，深圳市愛科學(xué)數(shù)碼科技有限公司產(chǎn)品；電子萬用爐，鄭州中天儀器有限公司產(chǎn)品；XC-750型中藥粉碎機(jī)，深圳雷粵機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，加拿大BBI公司產(chǎn)品；BCD-208K/A型海爾冰箱，海爾公司產(chǎn)品；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Gene Genius公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 (1)普通察氏固體培養(yǎng)基的制備：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。(2)20%高糖察氏固體培養(yǎng)基的制備：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖200 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 000 mL。將瓊脂煮沸攪拌均勻，其余的藥品用蒸餾水溶解，再將2者混合定容，封口后高壓滅菌備用。

1.2.2 培養(yǎng)基平板和斜面的澆制 (1)固體培養(yǎng)基平板的澆制。分別將配制好的普通察氏固體培養(yǎng)基、20%高糖察氏固體培養(yǎng)基和玻璃培養(yǎng)皿在121 ℃條件下滅菌20 min，滅菌完畢后培養(yǎng)基在超凈工作臺上冷卻至50 ℃，培養(yǎng)皿在烘箱內(nèi)70 ℃烘干，準(zhǔn)備完畢后開始澆制平板，每個平板倒入培養(yǎng)皿容量三分之一左右的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿水平放置待培養(yǎng)基完全冷卻凝固制成普通察氏固體培養(yǎng)基平板和20%高糖察氏固體培養(yǎng)基平板(用于菌落的分離純化培養(yǎng))后放入冰箱4 ℃冷藏備用。(2)固體培養(yǎng)基斜面的澆制。將配制好的普通察氏培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管約裝10 mL培養(yǎng)基，蓋上硅膠塞，每7只試管為1捆，用皮筋扎好，然后用牛皮紙包好，在121 ℃條件下滅菌20 min，滅菌完成后15°傾斜放置在超凈工作臺上，冷卻凝固制成普通察氏固體培養(yǎng)基斜面(用于純化菌種的繁殖保種)后放入冰箱4 ℃冷藏備用。

1.2.3 桑葉茯磚茶“金花”菌(S1)的分離、純化 取桑葉茯磚茶25 g，放置在盛有玻璃珠和225 mL無菌水的500 mL錐形瓶中，在搖床中恒溫震蕩，相關(guān)參數(shù)為溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，時間20 min，使菌落分散，用紗布過濾除去殘渣，以濾液為10-1液。在超凈工作臺上，用滅菌水進(jìn)行梯度稀釋，將濾液分別稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6液，每個梯度溶液取0.5 mL分別涂布于普通察氏固體培養(yǎng)基平板上，做好標(biāo)記并封口，靜置10 min后，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。待長出單個菌落后觀察其生長情況，適時對長勢較好的“金花”菌菌落進(jìn)行劃線分離，經(jīng)多次劃線分離，待菌種純化后轉(zhuǎn)接到普通察氏固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 S1的培養(yǎng)與菌落形態(tài)觀察 在超凈工作臺上將4 ℃冰箱保存的純化后菌種取出，在常溫下復(fù)蘇24 h后，分別接種于普通察氏固體培養(yǎng)基平板和20%高糖察氏固體培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長狀況，并做好記錄、拍照。

1.2.5 S1的光學(xué)顯微鏡觀察 采用直接插片觀察和形態(tài)學(xué)觀察的方法[15]。普通察氏固體培養(yǎng)基平板接種時，將滅菌的蓋玻片靠近接種點5 mm處呈45°～50°斜插入普通察氏固體培養(yǎng)基平板中；從第3天起，每隔1 d對S1菌落的菌株生長情況進(jìn)行觀察。待菌絲擴(kuò)展至蓋玻片處(蓋玻片上有明顯的菌絲體覆蓋)時將其取下，在載玻片上滴1滴棉蘭染色液(棉蘭染色液的配方如下：石炭酸10 g，乳酸10 mL，蒸餾水10 mL，加棉藍(lán)染色劑0.22 g)，小心將蓋玻片有菌絲體的一面正對著載破片上的棉蘭染色液，輕輕蓋上避免產(chǎn)生氣泡，染色5 min后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 S1的掃描電鏡觀察 取普通察氏固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)7～14 d的S1菌落，從中挑取少許S1菌落制成標(biāo)本并固定，按常規(guī)方法制片后在掃描電鏡下觀察。

1.2.7 S1的DNA序列分析 挑取少量S1菌落，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，擴(kuò)增引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，擴(kuò)增S1菌株的ITS區(qū)序列，用PCR產(chǎn)物試劑盒回收和純化，最后送交生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。其順序的相似性在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中使用BLAST工具進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 S1的菌落形態(tài)和生長特性

S1在普通察氏固體培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)7 d，菌落直徑為18～25 mm，菌落較致密，邊緣淡黃色，中央部分為淺褐色，呈不規(guī)則圓形，菌落周圍和背面開始產(chǎn)生色素，有黃色暈圈(圖1 S1-A左)。在20%高糖察氏固體培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)7 d，生長較快，菌落直徑達(dá)40～55 mm，呈不規(guī)則圓形，菌落周圍和背面沒有明顯的色素產(chǎn)生，邊緣金黃色(圖1 S1-A右)。在普通察氏固體培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)14 d，菌落直徑為28～35 mm，呈圓形或近圓形，菌落邊緣呈淺黃色，中間呈淺褐色或褐色，均開始產(chǎn)生褐色暈圈(圖1 S1-B)。在普通察氏固體培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)21 d，菌落直徑為46～62 mm，呈金黃色或淺黃色，表面無液滴滲出，菌落致密，平、薄無隆起，整個平板充滿茶褐色色素(圖1 S1-C)。

S1-A.左為普通察氏固體培養(yǎng)基，右為20%高糖察氏固體培養(yǎng)基(28 ℃，7 d)；S1-B.普通察氏固體培養(yǎng)基(28 ℃，14 d)；S1-C. 普通察氏固體培養(yǎng)基(28 ℃，21 d)。圖1 普通與高糖察氏固體培養(yǎng)基平板的S1菌落形態(tài)

2.2 S1的光學(xué)顯微鏡顯微特征

由圖2可以看出，在光學(xué)顯微鏡下S1的分生孢子向外呈放射狀生長，鏈簇在一起，呈掃把狀(圖2 S1-D)。S1的分生孢子頭均呈疏松放射形，頂囊較大(圖2 S1-E)。其有性生殖結(jié)構(gòu)以閉囊殼為主，在光學(xué)顯微鏡下觀察S1的染色閉囊殼，發(fā)現(xiàn)S1的閉囊殼為球形、扁球形或橢球形，大小100～175 μm，閉囊殼里可以清晰看到子囊(圖2 S1-F)。S1的未染色閉囊殼叢生在菌絲體中間，均為球形，顏色為金黃色(圖2 S1-G)。

S1-D.S1的分生孢子，S1-E.S1的分生孢子及頂囊，S1-F.S1的染色閉囊殼，S1-G.S1的未染色閉囊殼。圖2 S1的光學(xué)顯微鏡顯微特征

2.3 S1的掃描電鏡顯微特征

由圖3可以看出，在掃描電鏡下S1的閉囊殼為近球形，存在于黃色具飾菌絲網(wǎng)中，直徑為100～150 μm，S1的閉囊殼無規(guī)律破裂釋放出子囊(圖3 S1-H)；S1的每個子囊內(nèi)均含有8個子囊孢子，直徑為9～14 μm(圖3 S1-I)。S1的子囊孢子呈雙凸鏡形，“赤道”部分具有明顯的溝和2個明顯的縱向雞冠狀凸起，寬約為0.8～1.1 μm，S1的子囊孢子體大小為5.2～6.3 μm×4.3～5.1 μm，凸面較粗糙，具有尖疣(圖3 S1-J)。S1的菌絲體為有分枝的絲狀長管，有隔，每隔有細(xì)胞核；菌絲體周圍布滿小絲(圖3 S1-K)。

S1-H.S1的閉囊殼釋放子囊，S1-I.S1的子囊，S1-J.S1的子囊孢子，S1-K.S1的菌絲體。圖3 S1的掃描電鏡顯微特征

2.4 S1的分子鑒定結(jié)果

利用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增S1菌株的ITS區(qū)序列，該序列片段為426 bp,在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行對比，結(jié)果顯示擴(kuò)增S1菌株的ITS片段與數(shù)據(jù)庫中的冠突散囊菌[Eurotiumcristatum(Accession：NO.KR812327.1)]有100%的相似性，由此確認(rèn)該桑葉茯磚茶“金花”菌株S1為冠突散囊菌。

3 小結(jié)與討論

桑葉是國家衛(wèi)生部門認(rèn)定的藥食同源植物葉，桑葉茯磚茶是茯磚茶家族的創(chuàng)新品種。本試驗以形態(tài)結(jié)構(gòu)為主要分類依據(jù)，首次對S1進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過普通光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對其菌落形態(tài)、分生孢子、閉囊殼、子囊孢子等進(jìn)行觀察，從菌落形態(tài)和生長特性、光學(xué)顯微鏡與掃描電鏡顯微特征可以看出，S1具有下述特征：菌落周邊黃色，或近于橄欖淺黃色，中心部分顏色較深，近于褐色；閉囊殼量大，黃色。在普通察氏固體培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)21 d菌落顏色變成橄欖褐或丁香褐，菌落背面黑褐色。在20%高糖察氏固體培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)生長較快，閉囊殼和子囊球形或近球形；子囊孢子雙凸鏡形，具有2個明顯的縱向雞冠狀突起，凸面表面明顯粗糙，具尖疣。對照《中國真菌志》(第五卷)[13]，S1具有冠突散囊菌的典型特征，結(jié)合DNA序列分析，根據(jù)相關(guān)學(xué)者關(guān)于不同親緣關(guān)系研究成果[14-18]，可以判斷桑葉茯磚茶“金花”菌S1為真菌門(Fungi)子囊菌綱(Ascomy cetes)真子囊菌亞綱(Euascomycetes)曲霉目(Eurotiales)曲霉科(Eurotiaceae)散子囊菌屬(EurotiumLink ex Fires )冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)。

傳統(tǒng)茶葉茯磚茶是在前期渥堆時通過曲霉、青霉、根霉、酵母菌等多種微生物的發(fā)酵作用轉(zhuǎn)化黑毛茶的內(nèi)含成分后，再經(jīng)人工控制發(fā)酵條件使“金花”菌成為優(yōu)勢菌，最終形成其獨特的品質(zhì)[19]。冠突散囊菌能分泌胞外酶并與茶葉本身的酶協(xié)同作用，分解黑毛茶中的單寧和淀粉等，使茶黃素(TF)、茶紅素(TR)和茶褐素(TB)含量升高，蔗糖、茶多酚、兒茶素總量逐漸減少，從而完成茯磚茶風(fēng)味物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，形成茯磚茶特有的滋味；“金花”菌菌絲體本身含有豐富的、幾乎所有人體必需的氨基酸，具有濃郁的菌花香且能分泌水溶性色素，在增強(qiáng)茶營養(yǎng)及其風(fēng)味的同時，還能改善茶湯的顏色和香氣[20-27]。本試驗開展S1的鑒定，為借鑒傳統(tǒng)茯磚茶茶葉的相關(guān)研究成果，開展桑葉茯磚茶品質(zhì)形成機(jī)理、功能性作用及其加工工藝比較研究奠定了基礎(chǔ)。不僅為桑資源利用和茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展開辟了新的途徑，也為桑、茶跨學(xué)科深入研究搭建了廣闊舞臺。

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2017-04-03;接受日期：2017-07-19

湖南省科技重點研發(fā)計劃項目(編號2015NK3054)。

信息：邵元元(1987—)，女，湖南常德，碩士，助理研究員。 Tel：0731-84692978，E-mail:amiliyayuan@163.com

信息：顏新培(1966—)，男，湖南南縣，博士，研究員。 Tel：13755179825，E-mail:yanxinpei@sina.com

S886.9

A

1007-0982(2017)03-0011-05