Caspase-3蛋白在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

曹斌校

Caspase-3蛋白在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

曹斌校

目的：探討含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)蛋白在人結直腸癌組織中的表達及其臨床意義。方法：采用免疫組織化學SP法檢測48例腸癌組織及配對癌旁組織中Caspase-3蛋白表達水平，并探討其表達水平與臨床病理學特征及預后的關系。結果：Caspase-3主要表達于胞漿，其在腸癌組織中的陽性表達率為27.08%，癌旁組織陽性率為58.33%，癌組織顯著低于癌旁組織(P＜0.05)；Caspase-3陽性表達與腫瘤分期(P＜0.05)和病理分級(P＜0.05)有關。Caspase-3陽性患者中位無疾病進展生存時間為32.4個月，陰性患者為24.8個月(P＞0.05)。結論：Caspase-3蛋白在人結直腸癌組織中表達率較低，可能結直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關。

結直腸癌；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶；免疫組織化學；臨床特征；生存期

含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)是1994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表達序列標記數據庫中找到一段與ICE/CED-3活性中心同源的序列，并從cDNA文庫中克隆而得到的一個基因[1]。該基因編碼分子量為32kD的半胱氨酸蛋白酶被命名為Caspase-3[2]。目前研究顯示，Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細胞殺傷機制的重要組成部分[3]，Caspase-3在多種腫瘤組織中低表達并與患者的預后不良有關[4-5]。2011年1月—2016年2月，我們采用免疫組織化學SP法檢測我院普外科48例結直腸癌組織及癌旁組織中Caspase-3表達水平，探討其與患者臨床特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入標準：年齡大于18周歲；組織病例學證實為結直腸癌；臨床病例資料完整，并有完整隨訪數據；組織病理標本檢測經患者或家屬書面同意。排除標準：術前接受過新輔助放化療者；無隨訪數據；合并其他系統惡性腫瘤。本組共48例，平均年齡（58.66±18.75）歲。男26例，女22例；病理類型乳頭狀腺癌19例，管狀腺癌22例，其他7例。高中分化者21例，低分化者27例。

1.2 儀器與試劑 顯微鏡（購自日本奧林巴斯公司）、電熱恒溫箱（上海榮珂檢測儀器有限公司生產）、微波爐，臺式離心機（購自BechmanCoulter公司）；石蠟切片機（購自德國徠卡公司）。

1.3 主要試劑 鼠抗人Caspase-3單克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司；即用型免疫組織化學法試劑盒，購自上海美軒生物科技公司；DAB顯示試劑盒，購自北京中山生物科技有限公司。

1.4 Caspase-3免疫組化檢測 組織蠟塊連續(xù)切片，烤干，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%雙氧水常溫孵育10 min，去除內源性的過氧化氫酶，抗原修復2 min，。滴加Caspase-3單克隆抗體，4℃孵育過夜，滴加生物素化二抗及過氧化物標記的抗體，DAB顯色，脫水透明封片。用已知陽性組織切片作陽性對照，用PBS溶液代替一抗作為空白對照，然后顯色，最終封片鏡檢。

1.5 陽性結果判定 采用雙盲法對染色結果進行判定，在400倍顯微鏡下每張載玻片計數5個視野，計數每個視野中細胞總數及Caspase-3陽性的細胞數。陽性細胞均以細胞質中出現棕黃色顆粒為主，極少部分見于細胞核。陽性細胞＜5%為(-)；陽性細胞5%～25%為(+)；陽性細胞25%，50%為(++)；陽性細胞＞50%為(+++)[6]。

1.6 統計分析 采用STATA12.0軟件進行統計學處理，計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗或者Fisher確切概率檢驗；生存分析采用風險比例模型Log-rank檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在癌組織及癌旁組織中的表達 Caspase-3主要表達與胞漿（圖1），其在腸癌組織中的陽性表達率為27.08%，癌旁組織陽性率為58.33%，癌組織顯著低于癌旁組織(P＜0.05)。

圖1 Caspase-3蛋白在癌組織中的表達(A:陰性；B：陽性)

2.2 Caspase-3表達與臨床病理特征關系 臨床病例特征分析顯示，caspase-3陽性表達與患者的腫瘤分期(P＜0.05)和病理分級(P＜0.05)有關。見表1。2.3 Caspase-3表達與預后 Caspase-3陽性患者的中位無疾病進展生存時間為32.4個月，陰性患者為24.8個月。HR=1.67,95%CI:0.68-3.89(P＞0.05)。見圖2。

表1 Caspase-3表達與臨床病理特征關系

圖2 Caspase-3表達陽性與陰性患者生存曲線

3 討論

結直腸癌是臨床上較為常見的一類消化系統腫瘤[7]。來自北美的流行病學研究顯示，2012年全美新發(fā)結直腸癌患者約14萬例，因結直腸癌死亡的人數為5萬例[8]。我國缺乏結直腸腫瘤確切的流行病學數據，但各個地方的結直腸癌發(fā)病率顯示，其發(fā)病率位于肺癌、乳腺癌、胃癌之后[9]。結直腸癌的確切病因目前并不完全清楚，大多數研究認為與腫瘤家族史、結腸腺瘤、高脂高蛋白飲食及運動量降低有關[10]。

隨著分子生物學的研究進展，結直腸癌的病因及發(fā)病機制逐漸明晰。大多數研究認為，結直腸癌是一個涉及多個基因、多步驟的生物學過程[11]。在此過程中存在癌基因的激活、抑癌基因的失活及細胞凋亡的抑制[12-13]。近年來的研究顯示，細胞凋亡程序的抑制在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14-15]。而Caspase-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用。曾浩然等[16]探討了Caspase-3基因在大腸癌、大腸腺瘤中的表達及其與細胞凋亡的關系，顯示大腸癌、大腸腺瘤中Caspase-3基因表達與細胞凋亡指數密切相關，陽性表達的細胞平均凋亡指數明顯高于陰性表達的平均凋亡指數，而正常黏膜組織中二者無顯著性差異。研究認為，腫瘤早期階段的細胞凋亡異常和過度增生,可能是大腸癌的發(fā)病原因之一，作為細胞凋亡的調控因子,Caspase-3可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。馬穎等[6]采用免疫組織化學法檢測了大腸癌中PTEN和Caspase-3的表達情況，發(fā)現常黏膜組織Caspase-3的表達高于大腸腺瘤和大腸癌，且Caspase-3陽性表達隨腫瘤分化程度的降低而降低。上述研究雖然證實了Caspase-3在腸癌組織與正常腸黏膜中存在差異表達，且與患者臨床病理特征存在相關性，但未對Caspase-3表達水平與患者預后的關系進行討論。

在本研究中，我們發(fā)現Caspase-3在癌旁正常腸黏膜中的表達水平顯著高于腸癌組織，且Caspase-3表達與患者的腫瘤分期和和病理分級有關。分期晚和病理級別低的組織中Caspase-3陽性頻率低，提示Caspase-3表達水平可能與患者的腫瘤病理特征存在相關性。因此，理論上Caspase-3陽性患者預后應好于陰性患者。但關于Caspase-3如何參與腸癌的惡性轉化及增殖和侵襲能力等生物學行為仍不十分清楚。

在本研究中，我們采用風險比例模型對比了陰性組與陽性組患者中位無疾病進展生存時間，兩者并無統計學差異。分析原因，可能與入組患者例數較少，統計效能較低有關。因此，應加大樣本量，延長隨訪時間，進一步探討Caspase-3表達水平與結直腸癌患者的預后關系。

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（收稿：2016-12-06 修回：2017-06-02）

（責任編輯 馬東旺）

The Clinical Significance of Caspase-3 Expression in Colorectal Cancer

CAO Bin-xiao
Department of General Surgery,Peoples’Hospital of Fenghua City in Zhejiang Province,Fenghua(315500),China

Objective To assess the clinical significance of Caspase-3 expression in colorectal cancer. Methods Forty eight patients with colorectal cancer were included in this study.The Caspase-3 expression was assayed by immunohistochemistry method for the cancer tissue and corresponding para-cancer tissue.The associations between Casepase-3 expression and clinical characteristics,prognosis were evaluated. Results Caspase-3 was mainly expressed in cytoplasm with the positive rate of 27.08%in cancer tissue and 58.33%in normal colorectal tissue.The positive rate in normal colorectal tissue was significant higher than that of cancer tissue with statistical difference(P＜0.05).Caspase-3 expression was associated with the tumor stage(P＜0.05) and pathology grading(P＜0.05).The disease free survival for positive and negative patients were 32.4 and 24.8 months with statistical difference HR=1.67,95%CI:0.68-3.89(P＞0.05). Conclusion The expression rate of Caspase-3 protein in human colorectal cancer tissue is low,which may be related to the occurrence and develop?ment of colorectal cancer.

Colorectal cancer;Caspase-3;immunohistochemistry;clinical characteristics;survival

R735.3+7

：A

：1007-6948(2017)04-0353-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.04.004

浙江省奉化市人民醫(yī)院普外一科（寧波 315500）

曹斌校，E-mail:caobinxiao_fh@126.com