一例豬黃疸檢出戊型肝炎病毒的案例報(bào)道

李幽幽，龔雙燕，李小璟，毛汐語，鄧益超，朱 玲，2，徐志文，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川 成都 611134；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611134）

一例豬黃疸檢出戊型肝炎病毒的案例報(bào)道

李幽幽1，龔雙燕1，李小璟1，毛汐語1，鄧益超1，朱 玲1，2，徐志文1，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川 成都 611134；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611134）

戊型肝炎（Hepatitis E,HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）感染引起的一種人畜共患病。豬戊型肝炎可分為臨床型和亞臨床型及健康型。臨床型即病豬有典型的特征性黃疸表現(xiàn)。病豬發(fā)病急，體溫比正常豬的體溫高0.5～1℃，咳嗽、鼻塞、呼吸困難、精神沉郁、食欲下降，嚴(yán)重的食欲廢絕，有的出現(xiàn)嘔吐、腹痛、腹脹、腹瀉，尿液呈淺黃色。少數(shù)豬可視黏膜有黃染，如眼結(jié)膜、鞏膜、口腔黏膜均黃染。懷孕母豬還會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎。亞臨床型即患豬無臨床癥狀，但有肝炎的病理變化。

2017年4 月上旬，四川綿陽某規(guī)模化豬場發(fā)生一起以2～3月齡保育豬呼吸困難、體溫升高、黃疸等為主要特征的傳染病。該病的發(fā)生給養(yǎng)豬場造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、剖檢病變觀察及實(shí)驗(yàn)室檢查確診為豬戊型肝炎病毒感染，現(xiàn)將診斷結(jié)果報(bào)告如下。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)試劑

DL 2 000 DNA Marker，SYBR Green Premix Ex TaqⅡ，2×Taq PLR Master Mix均購自天根生化科技（北京）有限公司。DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）、pMD19-T Simple Vecfor、質(zhì)粒抽提試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。異丙醇（Isopropylalcohol）、三氯甲烷（Trichloromethane）均由四川西隴化工有限公司生產(chǎn)。TSA培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室配置保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)器材

手術(shù)刀，止血鉗，手術(shù)剪，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，培養(yǎng)箱等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

根據(jù)現(xiàn)場調(diào)查和詢問管理員，獲得豬場相關(guān)信息，例如：存欄量、免疫程序、發(fā)病初期癥狀以及死亡率等情況，初步掌握豬場的流行病學(xué)情況。

2.2 剖檢病變

對(duì)送檢的3頭2～3月齡的病豬進(jìn)行剖檢，觀察各器官組織的病理變化。

2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.3.1 細(xì)菌學(xué)診斷 無菌取病死豬心臟、肝臟及肺臟病料在TSA瓊脂平板上劃線，于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～72 h，觀察細(xì)菌生長情況。

2.3.2 豬戊型肝炎病毒RT-nPCR檢測 取3頭病豬的糞便用PBS稀釋成10%的糞便懸液，12 000 r/ min離心10 min，取上清液采用Trizol法提取病料總RNA樣本。

引物由上海生工公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增150bp（表1）。

表1 HEV的巢式PCR引物

cDNA的合成用Trizol法提取樣品中總RNA，按照Prime ScriptTn'RTreagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為 10 μL：5×Prime ScriptTM RT Buffer 2.0 μL，Prime ScriptTn'RT Enzyme MixⅠ0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，外引物E2 0.5 μL，Total RNA 3.0 μL，RNase Free dH2O 3.5 μL；反應(yīng)程序：42℃，30 min；85℃，5 min。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第一輪PCR擴(kuò)增：以cDNA為模板，使用檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μL：模板cDNA 1.0 μL；2×Master Mix 5.0 μL，外引物上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)條件：95.0℃預(yù)變性4min；95.0℃變性30 s；53.0℃退火30 s，72.0℃延伸30 s；35個(gè)循環(huán)；72.0℃延伸10 min。

第二輪PCR擴(kuò)增：以一輪PCR產(chǎn)物為模板，使用檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板cDNA 1.0 μL；2×Master Mix 5.0 μL，內(nèi)引物上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)條件：95.0℃預(yù)變性4 min；95.0℃變性30 s；53.0℃退火30 s，72.0℃延伸30 s；35個(gè)循環(huán)；72.0℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

3 試驗(yàn)結(jié)果

流行病學(xué)調(diào)查了解該豬場保育豬存欄量為1 000頭。其免疫程序嚴(yán)格按照春、秋兩防給豬群免疫接種了豬瘟、偽狂犬病等疫苗，在疫病流行期間，發(fā)病豬表現(xiàn)為體溫先升高后正常，并伴隨呼吸道病癥狀，眼結(jié)膜、鞏膜、口腔黏膜、皮膚等均黃染，死亡豬100頭，死亡率達(dá)10%（100/1 000）。

剖檢結(jié)果顯示，胃底腺體區(qū)觀察到彌漫性出血點(diǎn)；喉頭、腎、盲腸黏膜、回盲瓣區(qū)域均有針尖大的出血點(diǎn)，并伴有腸脹氣現(xiàn)象；脾臟邊緣呈鋸齒狀；皮膚、皮下脂肪均呈較嚴(yán)重的黃染現(xiàn)象；肝臟無明顯病理變化。

無菌取病死豬心臟、肝臟及肺臟病料在TSA瓊脂平板上劃線，于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～72 h，結(jié)果并未分離出致病菌。

利用RT-nPCR方法檢測病豬的糞便中是否有戊型肝炎病毒，經(jīng)凝膠電泳顯示出150 bp左右大小的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖1。將PCR產(chǎn)物送往公司測序結(jié)果為HEV，說明該豬場存在豬戊型肝炎病毒感染的情況。

圖1 PCR檢測結(jié)果電泳

4 分析及討論

戊型肝炎病毒是一種人畜共患病，并在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家流行，然而，該病的流行主要發(fā)生在亞洲、非洲及墨西哥等發(fā)展中國家。近年來，該病在我國的發(fā)病率也有所提高。

本試驗(yàn)對(duì)發(fā)病豬場進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢后，對(duì)發(fā)病豬有嚴(yán)重黃疸情況尤其關(guān)注，推測發(fā)病豬可能有肝部疾病，結(jié)合臨床癥狀和病理變化，對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行了病毒的核酸鑒定，檢測病豬是否攜帶有HEV。結(jié)果顯示，HEV為陽性，但是值得關(guān)注的是，HEV造成的病變并不能導(dǎo)致10%如此高的死亡率，所以筆者推測可能是與其他病毒病混合感染才造成了病豬的死亡。令人感興趣的是，該豬場的工作人員是否也有可能已經(jīng)感染了HEV，由于條件所限未能驗(yàn)證，值得后續(xù)關(guān)注。

（編輯：柳青）

鍛煉可緩解慢性疲勞綜合征

【英國《每日電訊報(bào)》網(wǎng)站6月22日?qǐng)?bào)道】一項(xiàng)新的研究顯示，每天加強(qiáng)鍛煉可能有助于慢性疲勞綜合征患者減少疲勞感和改善精神狀態(tài)。

倫敦大學(xué)瑪麗皇后學(xué)院的科學(xué)家召集200人參加了一項(xiàng)為期12周的計(jì)劃：他們要么在一名理療醫(yī)師的鼓勵(lì)下每天少許延長散步的時(shí)間；要么接受一項(xiàng)包括用藥物治療抑郁癥、疼痛和失眠的醫(yī)療計(jì)劃。

3個(gè)月后，以百分制計(jì)，鍛煉小組的疲勞值平均評(píng)分比對(duì)照組低了4分。研究人員稱這是一種適度但具有意義的影響。鍛煉小組的身體功能評(píng)分也比對(duì)照組高出6分。鍛煉小組中有1/5的人還自訴感覺“好多了”或“好太多了”。

論文第一作者露西·克拉克說：“我們發(fā)現(xiàn)，在治療師指導(dǎo)下以自助方式進(jìn)行的分級(jí)鍛煉計(jì)劃是安全的，并對(duì)某些慢性疲勞綜合征患者降低疲勞有幫助。這表明它也許可以作為一種有益的幫助患者控制慢性疲勞綜合征癥狀的初始治療。我們現(xiàn)在將觀察這些效果在12周之后是否能得到維持。我們的目的是小心翼翼地逐步取得改善，而不是過度催促實(shí)驗(yàn)對(duì)象加大強(qiáng)度直至遭遇挫折?！?/p>

大約0.7%的人患有慢性疲勞綜合征，這種疾病的特征是在缺乏其他診斷情況下表現(xiàn)出的長期的極度疲勞。

這項(xiàng)自助鍛煉計(jì)劃的內(nèi)容是患者在形成每天運(yùn)動(dòng)的習(xí)慣后，慢慢增加身體活動(dòng)的強(qiáng)度，并由一名理療醫(yī)師通過電話或通信軟件對(duì)其進(jìn)行全程支持。這項(xiàng)研究發(fā)表在英國《柳葉刀》周刊上。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2017-06-25）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)04-0097-02

2017-06-26

四川省科技支撐計(jì)劃（2014NZ0043）；國家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2015BAD12B04-2.3）

李幽幽（1992-），女，四川江油人，在讀碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)方向的研究.

E-mail:sclyy@hotmail.com

朱 玲，教授，博士.E-mail:abtcxzl72@126.com