某規(guī)模化肥育豬場(chǎng)呼吸道疾病的診斷與防控

陳同煜，秦四海，彭 濤，王玉超，古金元，胡東方，劉思當(dāng)

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000；2.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

某規(guī)?；视i場(chǎng)呼吸道疾病的診斷與防控

陳同煜1，秦四海2，彭 濤1，王玉超1，古金元1，胡東方1，劉思當(dāng)1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000；2.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

山東某規(guī)模化肥育豬場(chǎng)于2016年12月通過(guò)長(zhǎng)途運(yùn)輸購(gòu)進(jìn)某種豬公司60日齡左右的仔豬1 000多頭，進(jìn)場(chǎng)1周豬群即出現(xiàn)咳嗽、氣喘、發(fā)熱并伴有拉稀病癥，發(fā)病率20%，病死率10%，是一起傳播迅速的急性呼吸道病疫情。通過(guò)病死豬剖檢診斷、細(xì)菌分離鑒定、組織病理學(xué)檢查、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)，確診為一起由應(yīng)激繼發(fā)的呼吸道細(xì)菌感染，并導(dǎo)致豬群對(duì)重要病毒病抵抗力下降。通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇敏感藥物，對(duì)豬群實(shí)施了合理的藥物防治，并對(duì)相關(guān)病毒性疾病進(jìn)行了免疫，該豬場(chǎng)疫情得以迅速控制，避免了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

豬；呼吸道疾?。辉\斷；防控

豬呼吸道疾病是危害豬場(chǎng)穩(wěn)定生產(chǎn)的首要疾病，因其致病因素復(fù)雜，涉及細(xì)菌、病毒、支原體、寄生蟲、不良環(huán)境及飼養(yǎng)管理等眾多因素，往往難究其根源，稱為呼吸道病綜合征（PRDC）。隨著疫苗制品質(zhì)量的提高和養(yǎng)殖戶免疫意識(shí)的增強(qiáng)，豬場(chǎng)病毒性疾病的防控效果越來(lái)越好，但卻忽視了細(xì)菌性疾病對(duì)豬呼吸道的危害。近年來(lái)豬場(chǎng)PRDC頻發(fā)，尤其是許多中小規(guī)模豬場(chǎng)或散養(yǎng)戶，由于引種或外購(gòu)仔豬肥育使該病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，多數(shù)豬場(chǎng)在購(gòu)豬1個(gè)月內(nèi)即出現(xiàn)不同程度的疫情。通過(guò)多起病例檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在危害豬呼吸道的細(xì)菌性疾病病原中，支原體、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌以及巴氏桿菌占據(jù)了主導(dǎo)位置，該類病菌通常條件下以隱性感染居多，在冷熱交替、天氣突變、長(zhǎng)途運(yùn)輸或飼料改變等應(yīng)激狀態(tài)下易誘發(fā)PRDC，?；彀l(fā)或并發(fā)病毒性疾病使病情復(fù)雜化。下面介紹一起規(guī)?；瘜I(yè)肥育豬場(chǎng)呼吸道病的診斷與防治，為豬場(chǎng)呼吸道疾病的診斷防控提供參考。

1 發(fā)病背景

山東省某規(guī)?；瘜I(yè)肥育豬場(chǎng)于2016年12月1日遠(yuǎn)距離引進(jìn)某種豬公司1 600頭20～30 kg保育豬肥育，進(jìn)場(chǎng)1周后豬群即出現(xiàn)部分仔豬發(fā)燒（體溫升高達(dá)39.5～40.5℃）、咳嗽、氣喘并伴有拉稀病癥，有的病豬表現(xiàn)為耳朵發(fā)紺、被毛粗亂、消瘦，以呼吸道病癥狀最為明顯，短時(shí)間內(nèi)發(fā)病率高達(dá)20%，病死率10%，保育豬前期免疫程序不明。發(fā)病后緊急投服氟苯尼考、阿莫西林及柴胡注射液中藥針劑，效果不佳，遂前往實(shí)驗(yàn)室就診。

2 綜合診斷

2.1 病豬臨床檢查

送檢病豬主要表現(xiàn)為咳嗽、氣喘，呈明顯腹式呼吸，被毛粗亂、精神沉郁、瘦弱、耳朵發(fā)紺等。

2.2 剖檢病變

下頜及肺門淋巴結(jié)腫大出血，腹股溝及腸系膜淋巴結(jié)顯著腫大（圖1-A）；肺臟硬實(shí)暗紅色腫脹，小葉間質(zhì)水腫增寬，有的被膜附有纖維蛋白滲出物（圖1-B）；有的發(fā)生纖維素性心包炎，心臟呈“絨毛心”樣變（圖1-C）；胸腔、腹腔積液（圖1-D、圖1-E）；肝臟淤血并附有纖維素性滲出物；有的病豬結(jié)腸黏膜出血、潰瘍（圖1-F）。

圖1 病豬剖檢病變

2.3 組織病理學(xué)病變

對(duì)剖檢豬的淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、心臟、肺臟、腦組織采樣，用10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)方法制作石蠟切片，H.E染色，鏡檢。結(jié)果可見淋巴結(jié)毛細(xì)血管充血、漿液滲出，呈漿液性淋巴結(jié)炎病變（圖2-A）；脾臟充血、出血，呈敗血脾病變（圖2-B）；肺間質(zhì)充血，肺泡內(nèi)大量漿液、纖維素滲出，呈大葉性肺炎病變（圖2-C）；腎間質(zhì)淤血、腎小管上皮細(xì)胞變性壞死（圖2-D）；心肌纖維呈現(xiàn)空泡變性（圖2-E）；腦血管充血，神經(jīng)元空泡變性、壞死（圖2-F）。

圖2 病豬組織病理學(xué)變化

2.4 病原學(xué)和血清學(xué)檢查

因該場(chǎng)豬群發(fā)病率和死亡率均較高，首先懷疑是否有藍(lán)耳病野毒感染，除對(duì)病死豬剖檢，采集腦、脾臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié)及扁桃體組織液氮保存，同時(shí)隨機(jī)采集發(fā)病豬群血清18份離心，-20℃?zhèn)浯?。將凍存于液氮中的組織病料解凍后取適量組織加入滅菌PBS液并研磨成勻漿，9 000 r/min離心4 min，取上清液，同時(shí)18份血清每份吸出20 μL折合1份樣品，使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA kit（批號(hào)為K10314）提取病毒核酸。根據(jù)GenBank中公布的序列設(shè)計(jì)豬藍(lán)耳病病毒片段為372 bp的特異性引物（表1），用PCR/RT-PCR方法擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外凝膠成像儀下?lián)l帶位置判定病豬的病原感染狀況，結(jié)果顯示，病料和血清中藍(lán)耳病病毒均為陰性（圖3）。

表1 藍(lán)耳病病毒引物序列

圖3 PRRSV 1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

使用韓國(guó)金諾試劑盒對(duì)備存血清進(jìn)行豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病病毒gE、圓環(huán)病毒2型抗體水平檢測(cè)，4種病毒檢測(cè)均按照說(shuō)明書步驟嚴(yán)格規(guī)范操作。判定標(biāo)準(zhǔn)是豬瘟病毒（CSFV）：阻斷率≥40%為陽(yáng)性；阻斷率＜40%為陰性。豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）：S/P值≥0.40為陽(yáng)性；S/P值＜0.40為陰性。豬偽狂犬病病毒gE（PRV gE）：S/N≤0.6為陽(yáng)性；S/N＞0.6為陰性。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）：S/P≥0.4為陽(yáng)性；S/P＜0.3為陰性，之間為可疑。檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 4種病毒血清抗體檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，部分豬只豬瘟抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性，且均勻度較差，豬瘟免疫狀態(tài)差，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較大。藍(lán)耳病病毒抗體全部陽(yáng)性且離散度大，結(jié)合病原檢測(cè)結(jié)果和臨床發(fā)病情況推知該外購(gòu)仔豬群很可能免疫過(guò)藍(lán)耳病疫苗，導(dǎo)致藍(lán)耳病病毒抗體離散度不均是因?yàn)樯贁?shù)或部分弱豬抗體水平差，另外長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激也是導(dǎo)致豬只體內(nèi)抗體水平參次不齊的一個(gè)因素，說(shuō)明藍(lán)耳病病毒在豬群中有一定的活躍度，存在發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。偽狂犬病病毒gE抗體陽(yáng)性率較高，雖病豬未表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，但嚴(yán)重的呼吸道病癥狀與之不無(wú)關(guān)系。圓環(huán)病毒2型抗體幾乎全部陽(yáng)性，由于該豬群免疫過(guò)1次圓環(huán)病毒疫苗，鑒于發(fā)病豬腹股溝及腸系膜淋巴結(jié)顯著腫大，不能排除豬群存在圓環(huán)病毒感染，導(dǎo)致豬只體質(zhì)下降，從而促使呼吸道疾病的發(fā)生。

2.5 細(xì)菌分離鑒定及藥物敏感試驗(yàn)

采集不同病豬肺組織分別劃線接種于含新生牛血清（終濃度10%）和NAD（終濃度20 g/mL）的TSA培養(yǎng)基及鮮血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24～48 h后TSA培養(yǎng)基可見針尖大小、無(wú)色透明、光滑濕潤(rùn)的菌落形態(tài)，鮮血瓊脂平板可見淡灰色、圓形、濕潤(rùn)、露珠樣小菌落。革蘭氏染色鏡檢，觀察到TSA培養(yǎng)基菌體呈革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，有多種不同形態(tài)，從單個(gè)球桿菌到細(xì)絲桿菌不等（圖4）；鮮血瓊脂平板菌體為革蘭氏陰性短桿菌或球桿菌，散在或成雙（圖5）。初步診斷疑似副豬嗜血桿菌（HP）與巴氏桿菌（PM）混合感染。同時(shí)，挑取細(xì)小單菌落接種于含新生牛血清（終濃度10%）和NAD（終濃度20 g/mL）的TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌，37℃12 h后挑取菌液進(jìn)行副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌特異性PCR鑒定（表3）。結(jié)果顯示，該豬群存在副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌混合感染（圖6）。

表3 副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌引物序列

圖4 副豬嗜血桿菌分離菌株革蘭氏染色（200×）

圖5 巴氏桿菌分離菌株革蘭氏染色（200×）

圖6 HPS和PM 1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

分別挑取副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌及培養(yǎng)基其他形態(tài)菌落均勻涂布于新鮮血瓊脂平板上，選取頭孢噻呋鈉、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、阿莫西林、慶大霉素、丁胺卡那霉素、磺胺間甲氧嘧啶8種藥敏片，每片藥物含量10 μg，用無(wú)菌鑷子將藥敏片按一定間隔分別平貼于培養(yǎng)基表面，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)抑菌圈直徑（φ）判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感程度，判定標(biāo)準(zhǔn)為：φ≥25 mm為極度敏感；15 mm≤φ＜25 mm為高度敏感；10 mm≤φ＜15 mm為中度敏感；φ＜10 mm為低度敏感；無(wú)抑菌圈則為耐藥。結(jié)果顯示：細(xì)菌對(duì)頭孢噻呋鈉、恩諾沙星極度敏感，對(duì)丁胺卡那霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶高度敏感，對(duì)氟苯尼考、阿莫西林中度敏感，強(qiáng)力霉素低度敏感（表4）。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 疾病診斷

綜合分析實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致本次疫情的主要原因是長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激誘發(fā)的以副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌為主的細(xì)菌急性感染、以大葉性肺炎為主要病變特征的重癥PRDC，且不排除支原體、傳染性胸膜肺炎放線桿菌及魏氏梭菌的參與。另外，冬季寒冷、豬舍飼養(yǎng)密度大、通風(fēng)不良也是引發(fā)本次疫情的重要原因。因豬群運(yùn)輸應(yīng)激并造成了呼吸道細(xì)菌性疾病的暴發(fā)，進(jìn)而造成對(duì)藍(lán)耳病、豬瘟、偽狂犬病抵抗力下降，豬群存在暴發(fā)上述疫病的風(fēng)險(xiǎn)很大。

4 防治措施

結(jié)合該豬場(chǎng)流行病學(xué)、病原學(xué)、血清學(xué)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果，制定以下治療方案。

4.1 隔離病豬

及時(shí)隔離發(fā)病豬只單獨(dú)飼養(yǎng)，切斷傳染源；禁止不同圈舍飼養(yǎng)人員和外來(lái)人員交互串訪，切斷傳播媒介。

4.2 衛(wèi)生消毒

選用刺激性較小的過(guò)氧化劑類消毒液全群緊急消毒，包括豬舍所有空間，發(fā)病期間肥育舍和病豬隔離舍每日消毒1次。

4.3 改善飼養(yǎng)環(huán)境

降低圈舍飼養(yǎng)密度，加強(qiáng)豬舍防寒保暖，及時(shí)清理糞污，豬舍經(jīng)常通風(fēng)，以保持圈舍清潔干燥及空氣新鮮。

4.4 藥物防治與疫苗加強(qiáng)免疫

4.4.1 對(duì)發(fā)病豬只應(yīng)用頭孢噻呋鈉針劑5 mg/kg體重，肌肉注射，每日1次，連用5 d。

4.4.2 全群用包被恩諾沙星20 g/100 kg和硫酸新霉素20 g/100 kg飼料，拌料，發(fā)病豬用量加倍，連用5 d。

4.4.3 全群用電解質(zhì)、維生素C或黃芪多糖飲水，增強(qiáng)豬只抵抗力，減少應(yīng)激反應(yīng)。

4.4.4 待疫情穩(wěn)定后，全群普免1次高效豬瘟細(xì)胞疫苗，間隔2周普免偽狂犬病弱毒疫苗，以平衡豬群抗體均勻度，減少隱性感染豬只排毒，減輕臨床癥狀。

實(shí)施以上防治措施，該豬場(chǎng)疫情得到有效控制，短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)穩(wěn)定生產(chǎn)。

（編輯：富春妮）

S858.28

A

1002-1957(2017)04-0121-03

2017-05-12收稿，2017-05-16修回

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“豬重要疫病免疫防控新技術(shù)研究”子課題“規(guī)?；i場(chǎng)科學(xué)合理的免疫程序的研究（2017YFD0500605）”

陳同煜（1990-），男，山東廣饒人，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物臨床病理學(xué).E-mail:chentongyu123@126.com

劉思當(dāng)（1961-），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物臨床病理學(xué)及獸藥毒理學(xué).E-mail:liusid@sdau.edu.cn