杜洛克種豬抗腹瀉新品系選育研究

熊勝利，龍清孟，陳大芳，甘 霖，譚曉山，李 俊，尹楊莎，李建偉，王 燕，冉雪琴（.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州 貴陽 55008；.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 55005）

遺傳育種

杜洛克種豬抗腹瀉新品系選育研究

熊勝利1，龍清孟1，陳大芳1，甘 霖1，譚曉山1，李 俊1，尹楊莎1，李建偉1，王 燕1，冉雪琴2（1.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州 貴陽 550018；2.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是引起斷乳前后仔豬腹瀉的主要致病菌，試驗(yàn)利用分子檢測(cè)技術(shù)鑒別MUC13基因型，選育具有腹瀉抗性基因型群體，在種豬世代選育中培育抗腹瀉專門化新品系，從種源上提高新生仔豬及斷奶前后仔豬抗腹瀉能力，降低新生仔豬及斷奶前后仔豬腹瀉率，最大限度挖掘并提高豬場(chǎng)斷奶仔豬成活率的潛能，提高豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益和國外引進(jìn)種豬的使用價(jià)值。試驗(yàn)地點(diǎn)為貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心豬場(chǎng)，試驗(yàn)豬群為貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心2007年從美國引進(jìn)的杜洛克種豬。2016年，對(duì)美系杜洛克種豬父母本按照2種組合進(jìn)行選配：1）GG♂×GG♀，從9窩不同父母本選配所生的F1代中，每窩選留符合種用要求仔豬1～2頭，共11頭，采耳組織樣作MUC13基因型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，11頭均為腹瀉抗性有利基因GG型個(gè)體，腹瀉有利基因GG型檢出率100%（11/11），進(jìn)一步將F1代按照GG♂×GG♀選配，從1窩F2代仔豬中選出符合種用要求的5頭仔豬作為選留后備豬，抗腹瀉基因檢測(cè)結(jié)果5頭均為GG型基因個(gè)體，說明父母本按照GG♂×GG♀選配方案，其后代可以穩(wěn)定遺傳抗腹瀉基因GG型。2）GA♂×GA♀，采用常規(guī)選留方法，從1窩杜洛克仔豬中選出符合種用要求的8頭作為選留后備豬，抗腹瀉基因檢測(cè)結(jié)果8頭均為GA型，未檢測(cè)出GG、AA型個(gè)體。

杜洛克；腸毒性大腸桿菌（ETEC）；MUC13基因型；組合選配；抗腹瀉新品系

斷奶前后仔豬腹瀉是養(yǎng)豬業(yè)中的一種常見疾病。腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac是引發(fā)新生仔豬和斷奶前后仔豬腹瀉的最主要致病菌[1]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)4ac型是ETEC（F4）菌毛3種血清型（F4ab型、F4ac型、F4ad型）中致病性最強(qiáng)、流行性最廣的一類[2-3]。據(jù)報(bào)道，在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的瑞典、英國和丹麥，新生仔豬腹瀉的發(fā)生率分別為 75.0%、50.5%和36.6%[3-5]。我國仔豬腹瀉的發(fā)生率也很高，2012年對(duì)國內(nèi)某省4 118個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)戶進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率高達(dá)18.31%、死亡率在10.44%～57.01%之間不等[6-7]。早年在豬流行性腹瀉病毒還沒被大量報(bào)道之前，我國仔豬腹瀉的發(fā)生率全年平均高達(dá)為46.5%[8]，個(gè)別地區(qū)甚至更高。近年來更是出現(xiàn)豬流行性腹瀉病毒和ETEC混合感染導(dǎo)致仔豬大面積發(fā)生腹瀉和死亡的事件。

在種豬常規(guī)選種選育的基礎(chǔ)上，利用基因檢測(cè)鑒定技術(shù)輔助育種，在世代選育中，選留體型外貌和生產(chǎn)性能優(yōu)秀的個(gè)體，逐漸加大純合抗性個(gè)體的選留比例，逐步淘汰雜合、純合易感基因型個(gè)體，提高育種群中有利基因頻率，培育具有一定抗性專門化品系的方法在種豬育種生產(chǎn)中得到研究和運(yùn)用。2012年起，我中心開展了種豬抗腹瀉相關(guān)基因檢測(cè)及抗腹瀉后代選育研究，對(duì)美系杜洛克種豬父母本按照2種組合進(jìn)行選配，即GG♂×GG♀、GG♂×GA♀，在相同的飼養(yǎng)環(huán)境條件下，跟蹤觀察其哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率、腹瀉致死率、其他原因致死率、斷奶成活率，結(jié)果表明，這2種組合選配所生仔豬在哺乳期（27 d斷奶）的腹瀉發(fā)生率分別為2.97%（3/101）、26.09%（12/46），平均腹瀉發(fā)生率10.20%（15/147）；哺乳仔豬腹瀉致死率分別為0.99%（1/101）、13.04%（6/46），平均死亡率4.76%（7/147）；哺乳仔豬其他原因致死率分別為1.98%（2/101）、4.35%（2/46），平均為2.72%（4/147）；哺乳仔豬斷奶成活率分別為97.03%（98/101）、82.61%（38/46），平均斷奶成活率為92.52%（136/147）[9]。試驗(yàn)表明，GG♂×GG♀選配后代哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率、腹瀉致死率、哺乳仔豬斷奶成活率優(yōu)于GG♂×GA♀選配后代。2016年進(jìn)一步研究GG♂×GG♀、GA♂×GA♀兩種選配組合后代抗腹瀉基因在選留后備種豬中分布，以期在杜洛克種豬抗腹瀉后代中采取較合理的基因型選配組合，提高GG型抗腹瀉后代選留成功率。

1 材料與方法

1.1 樣品

本試驗(yàn)在美系杜洛克2種選配組合（GG♂×GG♀、GA♂×GA♀）后代中，選留體型外貌符合杜洛克種用要求的后代（包括F1代、F2代）24頭，于2016年8月3日采耳組織樣2～3 g，放入75%乙醇的離心管中冷鏈保存，送貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗腹瀉基因的檢測(cè)研究。樣品-20℃保存，采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒制備基因組DNA，作為PCR檢測(cè)的模板。

1.2 主要試驗(yàn)儀器設(shè)備

①離心機(jī)（Avanti-J30I），美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)；②制冰機(jī)（banshen），美國Grant公司生產(chǎn)；③凝膠成像系統(tǒng)（GelDocXR），美國Bio-rad公司生產(chǎn)；④熒光定量PCR儀（MyCycler），美國Bio-rad公司生產(chǎn)；⑤標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)（SW-CJ-IFD），上海錦星科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；⑥電泳儀（DYY．III2穩(wěn)壓電泳儀），北京六一儀器廠生產(chǎn)；⑦-80℃超低溫冰箱，美國Thermo公司生產(chǎn)；⑧水浴恒溫鍋（SHZ-82），中國金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的豬MUC13基因序列設(shè)計(jì)4條特異性的引物（表1），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 引物序列

PCR反應(yīng)體系為10 μL：2×PCR mix 5.0 μL，引物（10 pmol/L）各0.5 μL，基因組DNA（100 ng/μL）1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足10 μL體積。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃/63℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因型檢測(cè)結(jié)果

將得到的特異性173 bp條帶定為A基因，83 bp條帶定為G基因；那么得到1個(gè)173 bp條帶的樣品則定義為AA基因型，得到1個(gè)83 bp條帶的樣品定義為GG基因型，如得到2個(gè)條帶即為雜合的AG基因型。檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 GG基因型（左）和AA基因型（右）

2.2 克隆測(cè)序

將得到的目的173 bp和83 bp兩種條帶分別切膠回收，連接T-載體，送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行基因克隆測(cè)序，證實(shí)擴(kuò)增片段確為MUC13基因，位于內(nèi)含子7當(dāng)中，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型為G或A。

2.3 基因型頻率和基因頻率

由表2可知，結(jié)果檢出GG型個(gè)體16頭（3公13母），GA型個(gè)體8頭（5公3母），AA型個(gè)體0頭。

表2 杜洛克種豬不同配種方案后代初選后備豬抗腹瀉基因檢測(cè)結(jié)果

從表2可以看出，按照GA♂×GA♀組合選配方案，采用常規(guī)選留方法—即體型外貌和生長(zhǎng)發(fā)育狀況，從1窩斷奶仔豬中初步選留8頭為后備豬，對(duì)選留的8頭后備豬進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，檢出GA型個(gè)體8頭，未檢出GG、AA型個(gè)體。檢測(cè)結(jié)果提示，選擇此配種方案，其后代常規(guī)選留仔豬檢出抗腹瀉基因GG型個(gè)體幾率相對(duì)小。按照GG♂×GG♀方案選配，從9窩不同父母本選配所生F1代中，每窩選留符合種用要求的后代1～2頭，共計(jì)11頭種豬，采樣作MUC13基因型檢測(cè)，選留11頭均為腹瀉抗性有利基因GG型個(gè)體；將F1代按照GG♂×GG♀方案選配，所生的1窩F2代仔豬中選留符合種用要求的5頭仔豬為后備豬，檢測(cè)結(jié)果顯示5頭均為腹瀉抗性有利基因GG型個(gè)體，說明父母本按照GG♂×GG♀選配方案，其后代可以穩(wěn)定遺傳抗腹瀉基因GG型。

由表3可知，GG基因型頻率為66.67%（16/24）、GA基因型頻率為33.33%、AA基因型頻率為0；G基因頻率為83.33%、A基因頻率為16.67%。

表3 基因型頻率和基因頻率

3 分析與討論

3.1 建立杜洛克種豬抗腹瀉新品系的思路

抗性育種是種豬育種發(fā)展的重要方向，優(yōu)質(zhì)抗病種豬新品種（系）的培育是一項(xiàng)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，傳統(tǒng)的常規(guī)選育技術(shù)難以獲得有效的遺傳進(jìn)展。根據(jù)近年來對(duì)杜洛克種豬抗腹瀉新品系選育研究總結(jié)分析，選育種豬抗性新品系選育時(shí)，對(duì)杜洛克后備種豬和基礎(chǔ)種豬進(jìn)行選擇時(shí)，可以采用如下方法進(jìn)行。

3.1.1 組建杜洛克種豬抗腹瀉基礎(chǔ)群 了解試驗(yàn)豬群腹瀉基因有利基因型GG、有利基因G頻率，該試驗(yàn)豬群于2007年從美國引進(jìn)，經(jīng)純繁擴(kuò)群。2009年底，采基礎(chǔ)豬群耳組織樣，送往江西農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，結(jié)果表明，在MUC13基因的抗性等位基因頻率方面，該試驗(yàn)豬場(chǎng)杜洛克群體中基礎(chǔ)豬群腹瀉有利基因GG型頻率高達(dá)86.05%（37/43），G基因頻率為0.91，而在長(zhǎng)白、大約克群體腹瀉有利基因GG型頻率、G基因頻率分別為40.74%（11/27）、0.70和16.79%（23/137）、0.61[9-10]。顯然，杜洛克豬群比大約克、長(zhǎng)白豬群較容易選育純合腹瀉抗性GG型個(gè)體。因此，在摸清豬場(chǎng)杜洛克基礎(chǔ)繁殖群MUC13基因型比例的情況下，我們?cè)诟篂a抗性新品系選育前期，對(duì)杜洛克種豬基礎(chǔ)群全部采樣，進(jìn)行腹瀉基因檢測(cè)，盡可能選留腹瀉抗性基因GG型個(gè)體，組建杜洛克種豬抗腹瀉基礎(chǔ)群（包括種公豬及種母豬），根據(jù)系譜將符合選配計(jì)劃的種豬按照GG♂× GG♀選配，其所生的仔豬均為腹瀉抗性GG型個(gè)體，從中選留優(yōu)良個(gè)體作為后備豬進(jìn)行擴(kuò)繁，最終建立杜洛克抗腹瀉專門化新品系。

3.1.2 培育出的新品系應(yīng)有豐富的血統(tǒng)及優(yōu)良的生產(chǎn)性能 在新品系選育中，種豬選留必須充分考慮血統(tǒng)、繁殖性能、體型外貌等指標(biāo)，為保證培育的新品系有豐富的血統(tǒng)及優(yōu)良的生產(chǎn)性能表現(xiàn)，必須盡可能保留繁殖性能較為優(yōu)秀的GA、AA基因型個(gè)體，按照GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、GG♂×AA♀、AA♂×GG♀等選配組合進(jìn)行配種，在不同選配組合F1代或F2代甚至F3代仔豬中，對(duì)符合種用條件的仔豬采樣檢測(cè)抗腹瀉基因，逐漸選留出不同血統(tǒng)的抗腹瀉后代，再逐步淘汰腹瀉易感型基因型GA和AA的父母本。因此選育多個(gè)血統(tǒng)純種抗腹瀉新品系所需的時(shí)間更長(zhǎng)。

3.2 抗性新品系建立后及時(shí)導(dǎo)入新的血緣

建立健全抗性新品系后，要及時(shí)引種導(dǎo)入新的血緣，避免近交導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。對(duì)新引進(jìn)的種豬進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，加大抗腹瀉基因GG型個(gè)體選育力度，將GG基因型的優(yōu)良個(gè)體引入新品系中。在美系杜洛克豬群中選育抗腹瀉專門化新品系較大約克、長(zhǎng)白豬群容易。實(shí)際生產(chǎn)中，豬場(chǎng)引種并非是一件容易的事，需要花費(fèi)較高的費(fèi)用，尤其是在新品系培育后及時(shí)引種導(dǎo)入新的血緣，要保證引進(jìn)種豬攜帶有純合抗腹瀉GG基因型，且生產(chǎn)性能、體型外貌等指標(biāo)優(yōu)良，需要對(duì)引進(jìn)種豬進(jìn)行一次抗腹瀉GG型選育，這就需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能完成抗性新品系的培育。在實(shí)際育種生產(chǎn)中，如果整窩仔豬都進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，并且只選留GG型的個(gè)體作為后備豬，選留的后備豬生長(zhǎng)發(fā)育到配種階段，體型外貌、生長(zhǎng)發(fā)育可能發(fā)生改變，不一定能滿足留種要求，這不僅增加基因檢測(cè)成本，無形中也增加新品系選育的飼養(yǎng)成本。如果是按照常規(guī)選育，根據(jù)體型外貌、繁殖性能表現(xiàn)等選留優(yōu)秀個(gè)體作為后備豬，在配種前對(duì)優(yōu)秀個(gè)體進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，所預(yù)留的后備豬中也不一定都檢出抗腹瀉基因GG型個(gè)體，或許只有一定比例的后備豬檢出抗腹瀉GG型，因此，采用這種常規(guī)選留后備豬的方案，就要按照選留計(jì)劃選留足夠數(shù)量的后備豬。因此制定科學(xué)的選配方案，對(duì)提高后代抗腹瀉基因GG基因型頻率及G基因頻率是至關(guān)重要的，可加快抗性新品系選育進(jìn)程。

3.3 抗腹瀉杜洛克種豬在雜交生產(chǎn)中利用

杜洛克抗性腹瀉新品系種豬在二元及三元雜交生產(chǎn)中，雜交后代抗腹瀉情況有待于進(jìn)一步深入研究。

[1]Shepard S M,Danzeisen J L,Isaacson R E,et al.Genome sequences and phylogenetic analysis of K88 and F18-positive porcine enterotoxigenic Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology,2012,194(2):395-405.

[2]Joller D,Jorgensen C B,Bertschinger H U,et al.Vogeli P Refined localization of the Escherichia coli F4ab/F4ac receptor locus on pig chromosome 13[J].Animal Genetics,2009,40(5): 749-752.

[3]Ren J,Yah X,Ai H,et al.Susceptibility towards enterotoxigenic Escherichia coli F4ac diarrhea is governed by the MUC13 gene in pigs[J].PLoS One,2012,7(9):e44573.

[4]Pearce G P.Epidemiology of entericdisease in grower-finisherpigs:apostal survey of pig producers in England[J].The Veterinary record,1999,144:338-342.

[5]Johansen M,Alban L,Kj?rsgaard H D,et al.Factors Influencing the Weight Gain of Piglets[C]//Proceedings of the 17th International Pig Veterinary Society Congress(Iowa,U.S.A),2002,1:227.

[6]趙明軍，閏若潛，盛敏，等.仔豬腹瀉病流行形勢(shì)與防控措施[J].養(yǎng)豬，2013（2）：109-110.

[7]龍清孟，熊勝利，龔菲，等.從規(guī)?；i場(chǎng)仔豬死亡數(shù)據(jù)分析研究提高仔豬成活率對(duì)策[J].豬業(yè)科學(xué)，2014（8）：113-116.

[8]王紅寧.仔豬腹瀉成因及綜合防治技術(shù)措施[J].中國畜牧雜志，2006，42（6）：58-60.

[9]熊勝利，龍清孟，陳大芳，等.抗病育種技術(shù)在引進(jìn)美國SPF種豬后代選育中應(yīng)用探究[J].養(yǎng)豬，2014（3）：73-74.

[10]龍清孟，熊勝利，龔菲，等.引進(jìn)美國SPF杜洛克種豬抗腹瀉基因檢測(cè)及后代選育研究[J].養(yǎng)殖與飼料，2013（12）：11-12.

（感謝貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院冉雪琴教授對(duì)項(xiàng)目研究的大力幫助?。?/p>

（編輯：富春妮）

練太極可緩解抑郁癥

【美國每日科學(xué)網(wǎng)站5月25日?qǐng)?bào)道】題：太極顯著緩解華裔美國人的抑郁癥狀

在沒有接受其他任何治療的情況下，一項(xiàng)為期12周的接受指導(dǎo)和習(xí)練中國太極的計(jì)劃讓從事這項(xiàng)中國武術(shù)運(yùn)動(dòng)的華裔美國人的抑郁癥狀出現(xiàn)顯著緩解。美國馬薩諸塞綜合醫(yī)院研究人員開展的這一試點(diǎn)研究招募了一些患有輕度到中度抑郁癥的波士頓華人居民，研究結(jié)果刊登在《臨床精神病學(xué)雜志》上。

研究報(bào)告的第一作者、該醫(yī)院精神病學(xué)科抑郁癥臨床與研究計(jì)劃的艾伯特·楊說：“雖然此前的一些研究表明太極可能有助于治療焦慮和抑郁，不過在大多數(shù)情況下，它是作為治療其他疾病的輔助手段，而不是用來針對(duì)抑郁癥患者。發(fā)現(xiàn)太極可能有效治療抑郁癥這一點(diǎn)意義重大，因?yàn)槿A人群體的患者在文化上認(rèn)同這種運(yùn)動(dòng)，而且他們往往不愿采取常規(guī)的精神病學(xué)療法?！?/p>

參與者是通過廣告招募的，研究人員在與他們進(jìn)行當(dāng)面溝通并對(duì)他們的總體健康狀況及抑郁癥狀進(jìn)行評(píng)估后，才確定他們是否能夠參與這項(xiàng)研究。入選條件包括：普通話或粵語流利、是華裔成年人、被確診患有輕度到中度的抑郁癥、沒有其他精神病史、近期沒有習(xí)練過太極或其他身心療法、當(dāng)時(shí)沒有接受其他精神疾病治療。

參與者被隨機(jī)分成三組：第一組接受太極療法；第二組采取參與教育課程的主動(dòng)形式，其中包括就壓力、心理健康和抑郁展開討論；還有就是被動(dòng)“等待”的第三組，僅在研究期間及之后一再地接受評(píng)估。

太極療法是在12周里每周練習(xí)兩次，在此期間參與者會(huì)學(xué)習(xí)并習(xí)練一些基礎(chǔ)的太極動(dòng)作。他們每周要在家里練三次太極，而且將習(xí)練過程記錄下來。第二組的參與者在12周里每周有兩次課。在最初的研究階段過后，第二組和第三組的成員都可以免費(fèi)參與太極課程；這一點(diǎn)在研究之初就已告知他們。

成功度過為期12周的干預(yù)期的50名參與者當(dāng)中，17人在太極組，14人在教育組，還有19人在等待組。12周后的評(píng)估表明，太極組的抑郁癥狀比另外兩組都有明顯改善。24周以后的后續(xù)評(píng)估顯示，太極組抑郁癥狀在持續(xù)改善，明顯不同于等候組。

楊說：“如果這一研究結(jié)果在其他地方的更大規(guī)模研究中得到證實(shí)，就表明太極有可能是幾乎不到心理健康機(jī)構(gòu)就醫(yī)的中國患者及華裔美國患者治療抑郁癥的重要方法，而且可能有助于解決心理健康醫(yī)師短缺的問題。我們還應(yīng)研究太極是否會(huì)對(duì)其他種族和民族的人群產(chǎn)生類似的影響，并弄清產(chǎn)生這些有益影響的是太極的哪些方面?！?/p>

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2017-05-28）

S828.8

A

1002-1957(2017)04-0049-04

2017-06-06收稿，2017-07-03修回

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)課題[黔科合NY字（2012）3061號(hào)]；貴州省農(nóng)委2009年立項(xiàng)—引進(jìn)美國良種豬場(chǎng)口蹄疫、豬瘟等重大傳染性疾病防控技術(shù)研究

熊勝利（1967-），男，貴州畢節(jié)人，高級(jí)畜牧師，主要從事育種及技術(shù)推廣研究工作.E-mail:xshli@163.com

冉雪琴（1968-），女，重慶人，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物生理學(xué)與分子生物學(xué).E-mail:rxueq@yahoo.com.cn