辣椒疫霉菌效應(yīng)因子RxLR23克隆與基因敲除體系建立

姜海濱,李 京,許海青,陳茹雪,張修國

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,山東省蔬菜病蟲生物學(xué)省級重點實驗室,山東 泰安 271018

辣椒疫霉菌效應(yīng)因子RxLR23克隆與基因敲除體系建立

姜海濱,李 京,許海青,陳茹雪,張修國*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,山東省蔬菜病蟲生物學(xué)省級重點實驗室,山東 泰安 271018

在辣椒疫霉侵染寄主的過程中，病原菌能夠分泌大量的RxLR效應(yīng)因子，協(xié)助病原菌干擾寄主植物的抗病反應(yīng)。長期以來，由于缺乏有效的定向誘變和基因置換的技術(shù)嚴(yán)重阻礙了關(guān)于疫霉菌的致病性的遺傳研究。為了深入開展辣椒疫霉RxLR效應(yīng)因子的功能研究，本項研究以辣椒疫霉菌株SD33總DNA為模板，設(shè)計引物，克隆出基因RxLR23的序列。以RxLR23基因序列為模版設(shè)計sgRNA構(gòu)建pYF2.3G-ribo-sgRNA重組載體以及設(shè)計構(gòu)建同源修復(fù)供體載體pBluescript II KS+重組載體。利用CRISPR/cas9系統(tǒng)敲除基因RxLR23，經(jīng)G418抗性篩選和PCR擴增驗證，成功獲得了基因RxLR23的4個敲除突變體。

辣椒疫霉;效應(yīng)因子;CRISPR/cas9;基因敲除

辣椒疫霉菌是一種在世界范圍內(nèi)廣泛引起辣椒疫病的土壤兼性寄生菌，其分布廣泛，主要寄主是包括辣椒、茄子、西紅柿、黃瓜等在內(nèi)的多種茄科和葫蘆科植物[1]。同時，它還能夠侵染模式植物本氏煙和擬南芥，是卵菌遺傳學(xué)，生理學(xué)和病理學(xué)研究的模型研究中的重要的模式材料[2,3]。長期以來，由于缺乏有效的定點突變和基因替換技術(shù)，疫霉菌的致病性研究在分子水平上進(jìn)展緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來多個卵菌物種基因組測序工作相繼完成和CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用為卵菌基因結(jié)構(gòu)和功能研究的奠定了基礎(chǔ)。衍生自細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫機制的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年發(fā)展的一種準(zhǔn)確、高效進(jìn)行生物基因組編輯的新技術(shù)。其中II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)是自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）改造而來，其依賴于一段短的sgRNA序列指導(dǎo)核酸酶Cas9靶標(biāo)到靶DNA序列進(jìn)行DNA的識別和切割，從而實現(xiàn)對特定生物的靶基因進(jìn)行定點突變[4,5]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成功應(yīng)用于酵母、果蠅、鼠、人等生物以及煙草、擬南芥、水稻、小麥等多種植物中[6-10]。但是，在卵菌中，該技術(shù)還處于起步階段，2016年Fang[11]將該技術(shù)應(yīng)用于大豆疫霉小種P6497并成功敲除Avr4/6，在辣椒疫霉中尚未有報道將該系統(tǒng)應(yīng)用于基因敲除。

在辣椒疫霉侵染寄主的過程中，病原菌能夠分泌大量的RxLR效應(yīng)分子[12]。當(dāng)寄主植物不含有相應(yīng)的抗病蛋白時，效應(yīng)分子通過干擾或者破壞植物的防衛(wèi)反應(yīng)從而促進(jìn)病原菌的侵染；當(dāng)寄主植物含有效應(yīng)分子對應(yīng)的抗病蛋白，寄主植物識別相應(yīng)的效應(yīng)分子引發(fā)效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(Effector-triggered immunity，ETI)。鑒于目前在辣椒疫霉菌中對效應(yīng)分子的功能與機制報道較少，本研究克隆了辣椒疫霉菌中的1個RxLR效應(yīng)分子，通過對其基因序列的分析設(shè)計和構(gòu)建了2個sgRNA序列，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)[13-15]成功實現(xiàn)了對效應(yīng)因子的基因替換，為開展辣椒疫霉效應(yīng)分子的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)條件

辣椒疫霉菌株SD33由本實驗室分離鑒定，在10%V8培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)。

1.2 供試試劑

（1）0.8 M mannitol：稱取145.76 g mannitol（sigma M-1902）定容至1 L，高壓滅菌。

（2）酶解水：將超純水高壓滅菌，4℃放置，備用。

（3）0.5 M CaCl2：稱取7.35 g CaCl2·2H2O（sigma C3306）定容至100 mL，過濾除菌。

（4）0.5 M MES-KOH：4.88 g MES(sigma M2933)加40 mL，用KOH調(diào)pH至5.7，過濾除菌。

（5）0.5 M KCl：3.7275 g KCl（sigma P9541）定容至100 mL，高壓滅菌。

（6）PEG：分別加入3.75 mL 0.8 M mannitol，3 mL H20，3 mL 0.5 M CaCl2，過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用，冰上放置。

（7）酶解液：10 mL 0.8 M mannitol，8 mL H20,400 μL 0.5 M CaCl2，800 μL 0.5 M KCl，800 μL 0.5 M MES，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（8）W5 solution：稱取 0.1488 g KCl（sigma P9541），7.36 g CaCl2·2H2O（sigma C3306），3.6 g Nacl，12.48 g葡萄糖（sigma G8270）定容至400 mL，高壓滅菌。

（9）MMg solution：18.22 g mannitol，0.76 g MgCl·6H2O（sigma），2 mL 0.5 M MES（pH=5.7）加水定容至250 mL，高壓滅菌。

（10）G418（50 mg/mL）溶液：稱取1 g G418粉末溶于20 mL去離子水中，用0.22μm的細(xì)菌過濾器過濾除菌，分裝，于-20℃保存。

1.3 辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR23基因克隆

用DNAMAN設(shè)計一對特異擴增效應(yīng)因子RxLR23引物RxLR23FCCACAACCAGACT CTTGAGG；RxLR23-R：CACAAACTCCTTCTTGGCA，以辣椒疫霉SD33菌株總DNA為模版進(jìn)行RxLR23基因克隆。

反應(yīng)體系：10×EasyTaqBuffer 5μL，dNTP 4μL，引物（10μmol/L）各1μL，EasyTaq 0.5μL，無菌水補足至50μL。反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃30 s，55℃1.3 min，72℃30 s，共30個循環(huán)；72℃10 min。

1.4 辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR23敲除

利用CRISPR/cas9系統(tǒng)，使用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)同時將三種質(zhì)粒pYF2-PsNLS-hSp Cas9、pYF2.3G-Ribo-sgRNA、HDR供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染辣椒疫霉原生質(zhì)體，其中HDR供體質(zhì)粒采用pBl uescriptII KS+載體，pYF2-PsNLS-hSpCas9、pYF2.3G-Ribo-sgRNA由福建省農(nóng)科院植保所提供。

1.4.1 構(gòu)建質(zhì)粒sgRNA

1.4.1.1 sgRNA的設(shè)計 將基因RxLR23的序列導(dǎo)入網(wǎng)站http://grna.ctegd.uga.edu/，然后根據(jù)給出的結(jié)果來選擇合適的sgRNA。首先根據(jù)總得分及脫靶效應(yīng)進(jìn)行初篩，然后將初篩得到的sgRNA加上PAM位點（NGG）構(gòu)成的23 bp的序列，在FungiDB上進(jìn)行再次篩選，其原則為：匹配到的序列除目的基因以外，存在匹配到的堿基序列在含有NGG的同時位于NGG前的12 nt堿基序列同初篩得到的sgRNA最后12 nt堿基序列完全一致，則該初篩得到的sgRNA應(yīng)當(dāng)舍棄不用。

1.4.1.2 sgRNA的合成 (1)按照Fang Yufeng 2016年報道的方法設(shè)計sgRNA對應(yīng)的兩條單鏈寡核苷酸，并送至合成；(2)將合成的oligos使用Annealing Buffer for DNA Oligo(5×)（碧云天）進(jìn)行退火，退火體系（100μL）：Nuclease-Free Water 40μL，Annealing Buffer for DNAOligo(5×)20μL，Sense oligo20μL，Anti-sense oligo 20μL，100℃孵育10 min，緩慢降至室溫，4℃存放。用NheⅠ/BsaⅠ酶切載體PYF2.3G-ribo，回收酶切產(chǎn)物；（3）連接，反應(yīng)體系：pYF2.3G-Ribo-sgRNA3μL，sgRNA7μL，solutionⅠ10μL，16℃連接4 h，轉(zhuǎn)化。

1.4.2 構(gòu)建同源修復(fù)（HDR）供體質(zhì)粒pBluescript II KS+重組載體

1.4.2.1 RxLR23上游1 kb堿基序列及下游1 kb堿基序列擴增及測序 將基因RxLR23的序列導(dǎo)入FungiDB尋找RxLR23在LT1534菌株中同源序列的上游1 kb堿基序列及下游1 kb堿基序列，并以其為模板設(shè)計引物進(jìn)行RxLR23上游序列和下游序列的擴增。RxLR23上游1 kb堿基序列擴增引物為Z-F：GTCGTTCTCGTTGGTCCTGA；Z-R：AACAAAAGCGTGGCTTGACT。RxLR23下游1 kb堿基序列擴增引物為Y-F：TTTCGGTTTAGGATTAATTACCT；Y-R：GGGGAGTTTTGGATTCTTTG。

1.4.2.2 HDR供體質(zhì)粒構(gòu)建 將5’-RxLR23上游1 kb序列-mRFP序列-RxLR23下游1 kb序列3’作為模板送至公司合成，并將該片段插入質(zhì)粒pBluescript II KS+構(gòu)建重組載體。

1.4.3 使用CRISPR/cas9體系進(jìn)行RxLR23基因敲除

1.4.3.1 質(zhì)粒提?。?）配制3瓶1L的LB液體培養(yǎng)基，搖菌，4000 rpm收菌6 min；（2）均按Endo-Free Plasmid Mix Kit試劑盒的方法法提取pYF2-PsNLS-hSpCas9，pYF2.3G-Ribo-sgRNA、pBluescript II KS+重組載體三種質(zhì)粒，調(diào)整質(zhì)粒終濃度為1.0～1.5μmol/L。

1.4.3.2 辣椒疫霉培養(yǎng) （1）在V8固體培養(yǎng)基25℃黑暗培養(yǎng)辣椒疫霉SD33菌株4～5 d，使用直徑1 cm的打孔器切取菌落邊緣菌絲塊，轉(zhuǎn)移至NOB固體培養(yǎng)基上繼續(xù)25℃黑暗培養(yǎng)4～5 d；（2）在無菌條件下，將150 mL液體NOB平均分到3個三角瓶中，使用直徑1 cm的打孔器切取在固體NOB培養(yǎng)基上培養(yǎng)的辣椒疫霉若干塊，每個三角瓶中放入25個菌塊，于25℃黑暗培養(yǎng)2 d，備用。

1.5.3.3 PEG介導(dǎo)的辣椒疫霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（1）取出培養(yǎng)2 d的菌，用無菌的包有雙層紗布的100 mL的燒杯過濾，收集菌絲，放入50 mL的滅菌離心管內(nèi)；（2）加入35 mL的0.8 M mannitol漂洗菌絲后再用上述燒杯過濾，擠干，再將菌絲收集放回離心管內(nèi)；（3）再加入35 mL的0.8 M mannitol，混勻，在搖架上25℃搖洗10 min；（4）將漂洗的菌絲用無菌的帶有紗布50 mL的燒杯過濾，盡量將菌絲所帶溶液擠干，放入新的50 mL的滅菌離心管內(nèi)，加入現(xiàn)配的酶解液，慢慢混勻，放在搖架上使離心管水平方向放置，25℃酶解45 min；（5）取下離心管，用無菌的包有雙層micra-cloth的50 mL的燒杯過濾過濾，盡量將液體擠干，將液體緩慢倒入新50 mL滅菌離心管內(nèi)，4℃1500 rpm離心6 min；（6）離心完畢后將產(chǎn)生肉眼可見的原生質(zhì)體沉淀，棄上清，加入35 mL W5 solution，輕輕重懸原生質(zhì)體，于4℃1500 rpm離心6 min，棄上清，再加入6 mL W5 solution輕輕懸起原生質(zhì)體，冰上放置30 min；（7）4℃1500 rpm 離心6 min，棄上清，加入6 mL MMg solution輕輕懸起沉淀，25℃靜置10 min；（8）冰上放置6支新的50 mL滅菌離心管，標(biāo)記為1～6號，向各離心管管底加入pYF2-PsNLS-hSpCas9、pYF2.3G-Ribo-sgRNA、pBluescript II KS+重組載體三種質(zhì)粒各20～30μL并使每個離心管中的三個質(zhì)粒摩爾數(shù)一致；（9）依次向1～6號50 mL的滅菌離心管中加入1 mL的原生質(zhì)體，每管間隔1.5 min；待每個離心管中原生質(zhì)體在冰上靜置滿10 min時，向該離心管中加入1.74 mL的PEG，輕輕轉(zhuǎn)動離心管使管中物質(zhì)混勻；（10）待每個離心管中原生質(zhì)體在冰上靜置滿20 min時，向該離心管中加入2 mL的含有50μg/mLAmp的液體PM培養(yǎng)基，冰上靜置2 min；再向該管中加入8 mL的含有50μg/mLAmp的液體PM培養(yǎng)基，冰上靜置2 min；最后再向該管中加入10 mL的含有50μg/mLAmp的液體PM培養(yǎng)基，輕柔地顛倒混勻；（11）將6支離心管放于25℃培養(yǎng)箱中，過夜黑暗靜置培養(yǎng)（12～16 h為宜）；（12）第二天，將6支離心管于25℃1500 rpm離心6 min，棄大部分上清，留5～10 mL培養(yǎng)基,輕輕重懸原生質(zhì)體；（13）溶解固體PM培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基溫度合適后加入抗生素Amp和G418，使Amp的終濃度為50μg/mL，G418的終濃度為12.5μg/mL。向每支離心管加入固體PM培養(yǎng)基至35 mL，輕柔混勻，分別倒入無菌的培養(yǎng)皿中，于25℃黑暗培養(yǎng)；（14）培養(yǎng)3 d后，開始觀察培養(yǎng)基上有無菌絲生長。若有菌絲生長則將菌絲轉(zhuǎn)移到含有相同濃度的G418固體V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)；（15）CTAB法提取疑似敲除轉(zhuǎn)化子總DNA，在mRFP4序列5’端設(shè)計前引物F1，RxLR23下游堿基序列大于1000 bp的位置設(shè)計后引物R1，使用該對引物PCR擴增進(jìn)行初步驗證；（16）對疑似轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)游動孢子，涂布于Amp的終濃度為50μg/mL，G418的終濃度為12.5μg/mL的V8培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)待其生長成為菌落。將得到的菌落重復(fù)該步驟一次；（17）CTAB法提取疑似敲除轉(zhuǎn)化子，SD33以及空載轉(zhuǎn)化子（方法同上，轉(zhuǎn)入兩種質(zhì)粒：pYF2-PsNLS-hSpCas9、pYF2.3G-Ribo）的總DNA，分別基因RxLR23的引物及引物F1/R1、F2/R2，進(jìn)行PCR驗證。其中引物F1：CTAACCAAAGCAACTTCTCAGCA，R1：TTAGGCGCCGGTGGAGTGG；F2：ATGGCCTCCTCCGAGGACGT；R2：CAGCTTCGTGTCTGTCATGAGA。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR23的基因克隆與基因序列結(jié)構(gòu)分析

以辣椒疫霉菌株SD33總DNA為模板，利用特異性引物RxLR23-F/RxLR23-R對效應(yīng)分子RxLR23進(jìn)行PCR擴增，得到長度為1155 bp左右的DNA片段（見圖1），

圖1 基因RxLR23 PCR擴增結(jié)果Fig.1 The results of RxLR23 PCR gene amplificationM：Marker；1-2：基因 RxLR23。M：Marker；1-2：The gene of RxLR23

辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR23基因序列全長為1155 bp，完整的開放閱讀框ORF為1152 bp，編碼一個384個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測的編碼產(chǎn)物大小為43.271 kDa，等電點為10.03（見圖2）。經(jīng)生物信息學(xué)在線預(yù)測網(wǎng)站Signal P，預(yù)測出RxLR23前18個氨基酸為其信號肽序列。

圖2 RxLR23核苷酸序列和氨基酸序列Fig.2 RxLR23 nucleotide sequence and amino acid sequence

2.2 辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR23敲除結(jié)果

2.2.1 sgRNA設(shè)計結(jié)果 按照Fang Yufeng 2016年報道的方法設(shè)計sgRNA,選取兩條sgRNA序列，s gRNA-482：AGGGCGAACAGATGAAACTC，sgRNA-891：GCAGAATCCGTACGCTCACA，并根據(jù)序列按Fang所報道的方法設(shè)計寡核苷酸序列送至公司合成，其合成序列分別為：(1)482-F：CTAGC CGCCCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCAGGGCGAACAGATGAAACTC，482R：AAACGAGTTTCATCTGTTCGCCCTGACGAGCTTACTCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCA GAGGGCGG；(2)891-F：CTAGCTTCTGCCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCG TCGCAGAATCCGTACGCTCACA，891-R：AAACTGTGAGCGTACGGATTCTGCGACGAGCTTAC TCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGCAGAAG。

2.2.2 SD33菌株中RxLR23上游1 kb堿基序列及下游1 kb堿基序列測序結(jié)果 根據(jù)RxLR基因在FungiDB上查找出該基因的上下游各1000 bp（見圖3、圖4）。

圖3 RxLR23上游1 kb堿基序列Fig.3 Upstream 1 kb base sequence of RxLR23

圖4 RxLR23下游1 kb堿基序列Fig.4 Downstream 1 kb base sequence of RxLR23

2.2.3 RxLR23辣椒疫霉敲除轉(zhuǎn)化子驗證結(jié)果 利用基因RxLR23的引物驗證，以辣椒疫霉菌株SD33及空載轉(zhuǎn)化子為對照，驗證篩選到的4個獨立的RxLR23敲除轉(zhuǎn)化子（見圖5）。

圖5 敲除轉(zhuǎn)化子PCR驗證結(jié)果Fig.5 Result of PCR knockout transformants verification

利用設(shè)計的兩對引物F1/R1、F2/R2，驗證敲除轉(zhuǎn)化子，以辣椒疫霉菌株SD33及空載轉(zhuǎn)化子為對照。結(jié)果顯示SD33及空載轉(zhuǎn)化子無條帶，敲除轉(zhuǎn)化子有條帶，大小與所設(shè)計片段大小一致，表明mRFP4成功替換效應(yīng)因子RxLR23，RxLR23敲除成功（見圖6、圖7）。根據(jù)F1/R1，F(xiàn)2/R2引物設(shè)計位置示意圖及條帶測序結(jié)果，結(jié)果表明位于基因組中的RxLR23被mRFP4標(biāo)簽完全置換（圖8）。

圖6 引物F1/R1 PCR驗證結(jié)果Fig.6 Primer F1/R1 PCR verification results

圖7 引物F2/R2 PCR驗證敲除轉(zhuǎn)化子結(jié)果Fig.7 Primer F2/R2 PCR validation of knockout transformants results

圖8 測序結(jié)果表明RxLR23完全地被mRFP4同源置換Fig.8 The sequencing results showed RxLR23 was completely homologous replacement to mRFP4

3 結(jié)論與討論

本研究以辣椒疫霉菌株SD33總DNA為模板克隆基因RxLR23的序列，設(shè)計sgRNA并對RxLR23上游1 kb堿基序列及下游1 kb堿基序列進(jìn)行測序。構(gòu)建pYF2.3G-Ribo-sgRNA載體、HDR供體載體pBluescript II KS+，利用CRISPR/cas9系統(tǒng)，同時轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒：pYF2-PsNLS-hSpCas9、pYF2.3G-Ribo-sgRNA、pBluescript II KS+。其中sgRNA引導(dǎo)cas9切割目的基因RxLR23，并根據(jù)同源修復(fù)的原理以mRFP4同源替換掉目的基因RxLR23，然后再設(shè)計引物對疑似的敲除轉(zhuǎn)化子加以驗證，從而獲得基因RxLR23敲除突變體。

盡管CRISPR/cas9系統(tǒng)對于基因編輯較為簡便，但實驗過程中仍有一些問題需要注意：（1）sgRNA的脫靶效應(yīng)在設(shè)計sgRNA的過程中盡量選擇得分高，且無脫靶效應(yīng)的幾個sgRNA，放在FungiDB上進(jìn)行特異性比對，盡量選擇特異性高的sgRNA；（2）G418的含量中不同辣椒疫霉的菌株加入G418的量是不同的，必須要根據(jù)所用的菌株的種類對G418的加入量進(jìn)行優(yōu)化，否則，菌絲很難在G418含量很高的培養(yǎng)基上生長。

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Cloning of RxLR23 and Establishment of Gene Knockout System ofPhytophthora Capsici

JIANG Hai-bin,LI Jing,XU Hai-qing,CHEN Ru-xue,ZHANG Xiu-guo*
College of Plant Protection,Key Laboratory of Vegetable Pest and Biology of Shandong Province/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China

In the process of infection ofPhytophthora capsici,pathogenic bacteria can secrete a large number of RxLR effect factors to help pathogens interfering with the disease resistance of host plants.For a long time,the lack of efficient techniques for directed mutagenesis and gene replacement has seriously hampered genetic study on pathogenicity ofPhytophthorapathogenicity.In order to understand the function of RxLR effectors inPhytophthora capsici,using the Phytophthora capsici bacterial strain SD33DNA as template,we designed primers to clone the sequence of gene RxLR23，and it was used as the template to design sgRNA to construct pYF2.3G-ribo-sgRNA recombinant vector and to design the homologous recombinant donor vector pBluescript II KS+recombinant vector.The CRISPR/Cas9 system was used to knockout gene RxLR23,after G418 resistance screening and PCR amplification verification,4 knockout mutants of gene RxLR23 were obtained successfully.

Phytophthora capsici;effector;CRISPR/cas9;gene knockout

S436.418.1+2

A

1000-2324(2017)04-0491-06

2017-01-07

2017-04-09

國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-25-03B)

姜海濱(1991-),男,在讀碩士研究生.研究方向:植物病原真菌學(xué)和真菌資源利用.

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:zhxg@sdau.edu.cn