蓮子心化學成分及其抑制蛋白二硫鍵異構酶活性研究

楊勇 李希珍 張慶賀+盧丹

[摘要]蛋白質二硫鍵異構酶既能抑制腫瘤細胞凋亡，又能促進腫瘤細胞浸潤轉移，在腫瘤的發(fā)展進程中具有關鍵作用。為了研究中藥蓮子心是否對該酶活性有影響，該文首先對蓮子心的化學成分進行了提取分離，得到12個單體化合物，其中N甲基烏藥堿、山柰酚、金圣草素7O新橘皮糖苷和甘露醇為首次從該藥材中分離得到。隨后該文研究了蓮子心中主要的生物堿成分N甲基烏藥堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿對蛋白質二硫鍵異構酶活性的影響，首次發(fā)現(xiàn)它們均具有抑制蛋白二硫鍵異構酶活性的作用，其中N甲基烏藥堿活性最強（IC50 14 μmol·L-1）。

[關鍵詞]蓮子心； 生物堿； 蛋白二硫鍵異構酶； 抗腫瘤

Studies on the chemical components of Nelumbinis Plumula and

the inhibitory activity on protein disulfide isomerase

YANG Yong1， LI Xizhen1，2， ZHANG Qinghe1， LU Dan1*

（1 School of Pharmaceutical Science， Jinlin University， Changchun 130021， China；

2 Cangzhou Medical College， Cangzhou 061000， China）

[Abstract]Increasing evidence suggested that protein disulfide isomerase supported the survival and progression of several cancers Nelumbinis Plumula is a Chinese traditional herb which showed antitumor activity To find if the Nelumbinis Plumula affect protein disulfide isomerase activity， we studied its chemical constituents， and 12 monomeric compounds were isolated by means of solvent extraction， silica gel column chromatography， preparative HPLC and recrystallization Among them， Nmethylcoclaurine， kaempferol， chrysoeriol7Oneohesperidoside and mannitol were obtained for the first time Following， we tested the compounds inhibitory activity on protein disulfide isomerase The results showed that Nmethylcoclaurine， neferine， liensinine and isoliensinine could inhibit the activity of protein disulfide isomerase in vitro， their IC50 values were 14， 29， 40 and 54 μmol·L-1， respectively

[Key words]Nelumbinis Plumula； alkaloid； protein disulfide isomerase； antitumor

蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）是一類在內質網中催化二硫鍵形成、斷裂、重組的氧化還原酶。研究表明PDI在淋巴癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、雄性生殖細胞癌、腦和中樞神經系統(tǒng)癌癥中的表達顯著增高[12]。PDI在腫瘤的發(fā)展進程中具有關鍵作用，既能抑制腫瘤細胞凋亡[35]，又能促進腫瘤細胞浸潤轉移[67]。因此，以PDI為靶點研發(fā)新的抗癌藥物日益引起重視。蓮子心Nelumbinis Plumula是睡蓮科水生植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn的成熟種子中的幼葉及胚根經干燥而得。為2015年版《中國藥典》收錄藥材。研究表明，蓮子心主要活性成分為生物堿類化合物[810]，具有抗腫瘤[1113]、保護心血管功能[1416]、抑制肝纖維化[1718]等藥理作用。本研究利用溶液萃取和硅膠柱色譜、制備高效液相色譜法和重結晶等方法對蓮子心乙醇提取物中的化學成分進行了分離純化和結構確證，共得到12個單體化合物，其中N甲基烏藥堿、山柰酚、金圣草素7O新橘皮糖苷、甘露醇為首次從蓮子心中分離得到。通過研究N甲基烏藥堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿對PDI活性的影響，首次發(fā)現(xiàn)這些芐基異喹啉類生物堿具有抑制PDI活性的作用，即進一步說明了蓮子心的抗腫瘤作用機制，又為尋找新的PDI抑制劑提供了科學依據。

1材料

11儀器

Waters Model 500制備型高效液相色譜儀；Shodex R1201示差檢測器，N2000色譜工作站數(shù)據處理系統(tǒng)；YMC半制備色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）；WRS2A型熔點測定儀（上海軒澄儀器有限公司）；ZF7 型手提式紫外檢測燈（上海寶山顧村電光儀器廠）；ARX600型和ARX500型核磁共振儀（德國Bruker公司）；Synergy H1全功能微孔板檢測儀（美國Bio Tek），Gen5 209數(shù)據分析軟件，GraphPad Prism 7數(shù)據分析軟件。

12試藥

薄層色譜硅膠G（青島海洋化工有限公司），柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司），十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS，北京綠百草科技發(fā)展有限公司），蓮心堿高氯酸鹽（批號111696200501，中國食品藥品檢定研究院），牛肝蛋白質二硫鍵異構酶（P3818，Sigma），牛胰島素（I4011，Sigma），二硫蘇糖醇（DTT，D9779，Sigma），試劑為分析純，水為純凈水。蓮子心，購于長春中藥批發(fā)市場，經吉林大學藥學院王廣樹教授鑒定為蓮子心。

2方法

21提取與分離

取蓮子心10 kg，粉碎，用80%乙醇室溫浸提3次，乙醇用量分別為10，8，8倍，浸提時間分別為48，24，24 h，合并提取液，過濾，回收溶劑至無醇味，得到蓮子心提取物（21 kg）。提取物適當稀釋后用石油醚萃取，回收溶劑得石油醚層（2712 g）和水層。水層濃縮至每毫升含有04 g生藥，用9%鹽酸溶液調節(jié)pH 1～2，靜置，至析出沉淀不再增多，抽濾，得沉淀（109 g）和濾液。濾液用氨水調節(jié)pH 9～10，用氯仿萃取數(shù)次，回收氯仿得蓮子心總生物堿（1062 g）。

取石油醚部分100 g，經過硅膠柱色譜分離（石油醚乙酸乙酯65∶1～1∶1），得到55個流分Fr1～55，根據TLC檢測結果合并為12個組分，其中Fr7經硅膠柱色譜（石油醚氯仿60∶1～1∶1；石油醚乙酸乙酯30∶1～1∶1）和甲醇重結晶得到化合物11（197 mg）。

取總生物堿106 g，經過硅膠柱色譜（石油醚乙酸乙酯二乙胺60∶1∶1～1∶1∶1）得到98個流分，根據TLC檢測結果合并成21個組分，其中Fr4經硅膠柱色譜（石油醚氯仿二乙胺60∶1∶1～1∶1∶1）和甲醇重結晶得到化合物1（204 mg）；組分Fr10采用硅膠柱色譜（石油醚氯仿二乙胺60∶1∶1～1∶1∶1；石油醚乙酸乙酯二乙胺20∶1∶1～1∶1∶1）、反相硅膠柱色譜（甲醇水60∶40～100∶0）、半制備高效液相（YMC 20 mm×250 mm，5 μm；流動相甲醇水二乙胺800∶200∶01～750∶250∶01；流速10 mL·min-1；示差檢測器）進行分離純化，甲醇重結晶，得到化合物2（208 mg）、化合物3（228 mg）和化合物4（215 mg）；組分Fr18經硅膠柱色譜（石油醚氯仿二乙胺60∶1∶1～1∶1∶1）和甲醇重結晶得化合物12（214 mg）。

取沉淀部分100 g，蒸餾水洗至中性，甲醇溶解，過濾，濾液濃縮至每毫升含有02 g生藥，經D101型大孔樹脂柱純化，依次用蒸餾水、10%乙醇、50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，蒸干（685 g），經硅膠柱色譜（氯仿甲醇水40∶1∶1～1∶1∶1）得30個流分，F(xiàn)r7和Fr9經甲醇重結晶得化合物10（218 mg）；和化合物8（178 mg）；Fr14經硅膠柱色譜（乙酸乙酯甲醇水55∶1∶1～1∶1∶1，25∶1∶1～1∶1∶1）和甲醇重結晶得化合物5（184 mg）、化合物6（225 mg）、化合物7（231 mg）、化合物9（198 mg）。

進一步研究化合物N甲基烏藥堿（Nmethycoclaurine，1）、甲基蓮心堿（neferine，2）、異蓮心堿（isoliensinine，3）和蓮心堿（liensinine，4）對PDI活性作用的影響。化合物結構式見圖1。

22生物活性研究

221儲備液制備

取適量牛胰島素用01 mol·L-1 HCl溶液溶解制成濃度為13 mmol·L-1儲備液，4 ℃冰箱保存。取適量DTT加去離子水制成05 mol·L-1 DTT儲備液，-18 ℃凍存。含01 mol·L-1磷酸二氫鉀和2 mmol·L-1 EDTA的pH 70的緩沖鹽儲備液，常溫保存。取適量PDI加上述緩沖液制成58 g·L-1 PDI儲備液，-18 ℃凍存。

222實驗步驟

2221配制α溶液取1 μL DTT儲備液，加水999 μL稀釋至05 mmol·L-1，混勻，即得，置于冰浴中。

2222配制β溶液按照59∶1的比例，分別量取緩沖鹽儲備液與α溶液，混勻，即得，置于冰浴中。

2223配制γ溶液量取PDI儲備液適量，加β溶液稀釋至PDI濃度為16 μmol·L-1的溶液，混勻，即得，置于冰浴中。

2224配制δ溶液按照10∶1∶189的比例，依次量取胰島素儲備液、DTT儲備液、β溶液，輕輕混勻至溶液澄清，即得，置于冰浴中。

2225測定取黑色底透384孔板，在垂直相鄰的2個孔中分別加入β溶液39 μL，在接著垂直相鄰的2個孔中分別加入β溶液31 μL，在接著垂直相鄰的2個孔中分別加入γ溶液31 μL，在接著垂直相鄰的孔（Sample）中分別加入γ溶液31 μL，加入個數(shù)等于供試品溶液的個數(shù)的2倍。在前3對反應中加入DMSO 1 μL，在其他反應中加入供試品溶液1 μL。37 ℃孵育1 h。取出，除第1反應的2個孔外，其余孔中分別加入δ溶液8 μL。立即置Bio Tek微孔板監(jiān)測儀620 nm下測定吸光值，每5 min讀數(shù)1次，檢測2 h。

23實驗原理

胰島素的A，B 2條鏈是通過2個二硫鍵連接在一起的，PDI還原酶破壞二硫鍵，A鏈保持溶解狀態(tài)，B鏈發(fā)生聚合導致吸光度（540～650 nm）增加。因此通過檢測反應液吸光度可測定PDI的活性。

3結果

31PDI抑制活性

該4種生物堿均能抑制PDI活性，并且25 μmol·L-1的抑制效果都是最好，更接近只加胰島素組的吸收值，見圖1。而031 μmol·L-1時，4種生物堿抑制活性明顯低于其他濃度，但依然有明顯的抑制效果。其中Nmethycolaurine組中，當濃度為25 μmol·L-1時（IP+25 μmol·L-1曲線），其吸收曲線與單純加入insulin的曲線基本重合，表明25 μmol·L-1的Nmethycolaurine可以把實驗體系中的PDI活性基本完全抑制，見圖2A。當藥物濃度遞減時，抑制程度也遞減。Neferine組中，IP+25 μmol·L-1曲線雖然沒有與Insulin曲線重合，但也非常接近?？梢娖涓邼舛纫种菩Ч^好。Liensinine組中，031，091 μmol·L-1抑制效果接近；而83 μmol·L-1曲線與25 μmol·L-1曲線幾乎重合，暗示濃度超過83 μmol·L-1時，liensinine對PDI的抑制效果已經飽和。

為量化上述4種生物堿在抑制PDI活性中的差異，計算上述4種生物堿分別在031，093，83，25 μmol·L-1下的抑制效率，通過5個點模擬濃度與抑制程度的曲線，見圖3。其中Nmethycolaurine曲線在給定濃度下，均在其他3個曲線上方，其抑制效果最好（與圖2推斷一致），IC50也是4組數(shù)據中最小。根據本次實驗的數(shù)據顯示，4種生物堿對PDI的抑制強度由高到低可能是Nmethycoclaurine（IC50 14 μmol·L-1），neferine（IC50 29 μmol·L-1），liensinine（IC50 40 μmol·L-1）以及 isoliensinine（IC50 54 μmol·L-1）。其中Nmethycoclaurine與isoliensinine之間的差異具有統(tǒng)計學差異（P=003）。

32化合物提取分離和結構鑒定

本研究從蓮子心乙醇提取物中分離鑒定了12個單體化合物。首次分離出N甲基烏藥堿、山柰酚、金圣草素7O新橘皮糖苷以及甘露醇。

化合物1白色粉末（甲醇），mp 180～182 ℃。TLC檢測，置紫外光燈（365 nm）下檢視為藍色熒光，改良的碘化鉍鉀為顯色劑，105 ℃加熱顯色，日光下檢視為橘黃色斑點。ESIMS m/z 300 [M+H]+。1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：363（2H，m，H1），277（1H，m，H3a），313（1H，m，H3b），268（1H，m，H4a），272（1H，m，H4b），652（1H，s，H5），638（1H，s，H8），273（1H，m，H11a），302（1H，m，H11b），699（2H，d，J=84 Hz，H2′，6′），669（2H，d，J=84 Hz，H3′，5′），364（3H，s，OCH3），243（3H，s，NCH3），915（1H，s，7OH），871（1H，s，4′OH）；13CNMR（DMSOd6，150 MHz） δ：641（C1），465（C3），245（C4），1144（C5），1452（C6），1443（C7），1115（C8），1303（C9），1261（C10），395（C11），1280（C1′），1301（C2′，6′），1149（C3′，5′），1551（C4′），552（OCH3），423（NCH3）。經與文獻數(shù)據[19]對比，確定化合物1為N甲基烏藥堿（Nmethycoclaurine）。

化合物2淡黃色粉末（甲醇），mp 59～61 ℃，易溶于甲醇、氯仿，微溶于石油醚。TCL檢測，置紫外光燈（364 nm）下檢視為藍色熒光，改良的碘化鉍鉀為顯色劑，105 ℃加熱日光燈下檢視為橘黃色斑點。ESIMS m/z 626 [M+H]+。13CNMR（CDCl3，150 MHz）δ：644（C1），423（2NCH3），468（C3），254（C4），1290（C4a），1111（C5），1473（C6），558（6OCH3），1483（C7），1122（C8），1303（C8a），406（C9），1317（C10），1302（C11），1132（C12），1442（C13），555（C13OCH3），1133（C14），1302（C15），647（C1′），426（2′NCH3），474（C3′），258（C4′），1257（C4′a），1110（C5′），1464（C6′），549（6′OCH3），1472（C7′），556（7′OCH3），1194（C8′），1299（C8′a），403（C9′），1298（C10′），1226（C11′），1439（C12′），1576（C13′），1171（C14′），1244（C15′）。經與文獻數(shù)據[20]對比，確定化合物2為甲基蓮心堿（neferine）。

化合物3淡黃色粉末（甲醇），mp 70～72 ℃，易溶于甲醇、氯仿，微溶于石油醚。TCL檢測，置紫外光燈（365 nm）下檢視為藍色熒光，改良的碘化鉍鉀為顯色劑，105 ℃加熱日光燈下檢視為橘黃色斑點。ESIMS m/z 612 [M+H]+。13CNMR（CDCl3，150 MHz）δ：642（C1），422（2NCH3），460（C3），249（C4），1304（C4a），1109（C5），1445（C6），549（6OCH3），1455（C7），1133（C8），1312（C8a），402（C9），1314（C10），1302（C11），1132（C12），1427（C13），552（C13OCH3），1140（C14），1302（C15），645（C1′），424（2′NCH3），469（C3′），258（C4′），1253（C4′a），1122（C5′），1433（C6′），555（6′OCH3），1453（C7′），1191（C8′），1301（C8′a），396（C9′），1316（C10′），1110（C11′），1487（C12′），1576（C13′），1157（C14′），1251（C15′）。經與文獻數(shù)據[20]對比，確定化合物3為異蓮心堿（isoliensinine）

化合物4白色無定形粉末（甲醇），mp 96～98 ℃，易溶于甲醇、氯仿，微溶于石油醚。以蓮心堿標準品為對照，進行TLC檢驗。分別以3個溶劑系統(tǒng)展開：氯仿甲醇二乙胺（20∶1∶1）、乙酸乙酯甲醇二乙胺（18∶1∶1）和丙酮甲醇二乙胺（30∶1∶1），以改良的碘化鉍鉀為顯色劑。化合物4色譜中，在與蓮心堿對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；置紫外光燈（365 nm）下檢視，顯相同的熒光斑點，Rf分別為053，039，051。因此確定化合物4為蓮心堿（liensinine）。

化合物5黃色粉末（甲醇），mp 188～190 ℃。三氯化鐵鐵氰化鉀反應陽性，提示結構中有酚羥基存在；鹽酸鎂粉反應陽性，Molish 反應陽性。ESIMS m/z 612 [M+H]+。13CNMR（CD3OD，125 MHz）δ：1594（C2），1356（C3），1795（C4），1632（C5），1010（C6），1663（C7），948（C8），1586（C9），1056（C10），1232（C1′），1176（C2′），1458（C3′），1499（C4′），1160（C5′），1235（C6′）1047（Glc1），787（Glc2），758（Glc3），714（Glc4），773（Glc5），685（Glc6），1024（Rha1），723（Rha2），722（Rha3），741（Rha4），689（Rha5），179（Rha6）。經與文獻數(shù)據[21]對比，確定化合物5為蘆?。╮utin，quercetin3Orutinoside）。

化合物6黃色針晶（甲醇），mp 329～331 ℃。三氯化鐵鐵氰化鉀反應呈陽性，提示結構中有酚羥基存在；鹽酸鎂粉反應呈陽性。ESIMS m/z 287[M+H]+。1HNMR（C5D5N，500 MHz）δ：694（1H，s，H3），673（2H，s，H6，H8），792（1H，d，J=25 Hz，H2′），730（1H，d，J=80 Hz，H5′），754（1H，d，J=80 Hz，H6′）；DEPTQSP（C5D5N，125 MHz）δ：1659（C2），1050（C3），1838（C4），1595（C5），1009（C6），1668（C7），958（C8），1642（C9），1060（C10），1206（C1′），1156（C2′），1487（C3′），1526（C4′），1179（C5′），1240（C6′）。經與文獻數(shù)據[22]對比，確定化合物6為木犀草素（luteolin，3′，4′，5，7tetrahydroxyflavone）。

化合物7黃色粉末（甲醇），mp 218～222 ℃。鹽酸鎂粉反應呈陽性，Molish反應呈陽性。ESIMS m/z 465[M+H]+。1HNMR（CD3OD，600 MHz）δ：622（1H，s，H6），641（1H，s，H8），761（1H，d，J=84 Hz，H2′），689（1H，d，J=84 Hz，H5′），760（1H，dd，J=84，20 Hz，H6′），527（1H，d，J=77 Hz，Glc1）；13CNMR（CD3OD，150 MHz）δ：1570（C2），1342（C3），1781（C4），1616（C5），985（C6），1646（C7），933（C8），1576（C9），1043（C10），1216（C1′），1146（C2′），1445（C3′），1484（C4′），1161（C5′），1218（C6′），1029（Glc1），743（Glc2），769（Glc3），698（Glc4），767（Glc5），611（Glc6）。經與文獻數(shù)據[23]對比，確定化合物7為金絲桃苷（hyperoside，quercetin3Ogalactoside）。

化合物8黃色無定形粉末（甲醇），mp 268～270 ℃。三氯化鐵鐵氰化鉀反應陽性，提示結構中有酚羥基存在；鹽酸鎂粉反應陽性，Molish 反應陽性。ESIMS m/z 433[M+H]+。1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：678（1H，s，H3），628（1H，s，H6），802（2H，d，J=90 Hz，H2′，6′），689（2H，d，J=90 Hz，H3′，5′），500（1H，d，J=108 Hz，Glc1），378（1H，d，J=102 Hz，Glc2），460（1H，m，Glc3），384（1H，t，J=90 Hz，Glc4），354（1H，m，Glc5），498（1H，d，J=102 Hz，Glc6），479（1H，d，J=102 Hz，Glc6）；13CNMR（DMSOd6，150 MHz）δ：1644（C2），1029（C3），1826（C4），1616（C5），986（C6），1631（C7），1045（C8），1565（C9），1051（C10），1221（C1′），1294（C2′），1163（C3′），1609（C4′），1162（C5′），1294（C6′），738（Glc1），713（Glc2），791（Glc3），710（Glc4），823（Glc5），618（Glc6）。經與文獻數(shù)據[24]對比，確定化合物8為牡荊苷（vitexin，apigenin8CβDglucopyranoside）。

化合物9黃色粉末（甲醇），mp 226～228 ℃。三氯化鐵鐵氰化鉀反應陽性，提示結構中有酚羥基存在；鹽酸鎂粉反應陽性。ESIMS m/z 285[M-H]-。13 CNMR（DMSOd6，150 MHz）δ：1468（C2），1357（C3），1759（C4），1607（C5），982（C6），1640（C7），935（C8），1562（C9），1030（C10），1217（C1′），1295（C2′），1154（C3′），1592（C4′），1154（C5′），1295（C6′）。經與文獻數(shù)據[25]對比，確定化合物9為山柰酚（kaempferol，3，4′，5，7tetrahydroxyflavone）。

化合物10淡黃色粉末（甲醇），mp 128～129 ℃，易溶于甲醇，不溶于氯仿、乙酸乙酯。三氯化鐵鐵氰化鉀反應陽性，提示結構中含有酚羥基；鹽酸鎂粉反應陽性。ESIMS m/z 609[M+H]+。1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：693（1H，s，H3），636（1H，d，J=24 Hz，H6），681（1H，d，J=24 Hz，H8），752（1H，d，J=24 Hz，H2′），751（1H，dd，J=90，2，4 Hz，H5′），691（1H，d，J=90 Hz，H6′），383（3H，s，3′OCH3），516（1H，d，J=78 Hz，Glc1），528（1H，d，J=60 Hz，Rha1），115（3H，d，J=66 Hz，Rha6）；13 CNMR（DMSOd6，150 MHz）δ：1641（C2），1034（C3），1819（C4），1600（C5），993（C6），1625（C7），946（C8），1569（C9），1054（C10），1212（C1′），1103（C2′），1508（C3′），559（3′OCH3），1480（C4′），1157（C5′），1203（C6′），979（Glc1），771（Glc2），770（Glc3），696（Glc4），763（Glc5），604（Glc6），1004（Rha1），704（Rha2），703（Rha3），718（Rha4），682（Rha5），179（Rha6）。經與文獻數(shù)據[26]對比，確定化合物10為金圣草素7O新橘皮糖苷（chrysoeriol7Oneohesperidoside）。

化合物11白色無定型粉末（甲醇），溶于甲醇、乙醚等有機溶劑，不溶于水。1HNMR（CDCl3，600 MHz）δ：088（3H，t，J=78 Hz，CH3），126（26H，m，13×CH2），159（2H，br s，CH2CH2Cl），342（2H，s，CH2Cl）；13CNMR（CDCl3，150 MHz）δ：178（C1），232（C2），334（C3），297（C4～13），319（C14），227（C15），141（C16）。經與文獻數(shù)據[27]對比，確定化合物11為氯代正十六烷（1chlorohexadecane）。

化合物12白色斜方狀針晶（甲醇），mp 166～168 ℃，易溶于水，略溶于乙醇。1HNMR（D2O，500 MHz）δ：372（4H，m，H1，6），361（2H，dd，J=10，61 Hz，H2，5）、361（2H，dd，J=130，70 Hz，H3，4）。13CNMR（D2O，125 MHz）δ：645（C1，C6），706（C2，C5），724（C3，C4）。經與文獻數(shù)據[30]對比，確定化合物12為甘露醇（Dmannitol）。

4討論

芐基異喹啉類生物堿是生物堿中一類重要生理活性極強的生物堿，因其獨特的結構，在抗腫瘤方面顯示了較強的活性[31]。蓮子心中的生物堿屬于此類生物堿，蓮子心的抗腫瘤活性已有很多報道[1113]，蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）參與腫瘤的病理過程也已得到證實[17]。為了了解PDI是否與來源于蓮子心的生物堿有相互作用，研究了蓮子心中的N甲基烏藥堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿對PDI的抑制效果，其中N甲基烏藥堿為首次從蓮子心中分離得到。

研究發(fā)現(xiàn)上述4種生物堿均有抑制PDI活性的作用。通過計算IC50，發(fā)現(xiàn)4種生物堿對PDI的抑制強度由高到低可能是N甲基烏藥堿，甲基蓮心堿，蓮心堿以及異蓮心堿。目前數(shù)據顯示N甲基烏藥堿與異蓮心堿之間存在顯著的統(tǒng)計學差異（

P<005）。從化學結構上看只有N甲基烏藥堿是單芐基異喹啉型生物堿，甲基蓮心堿，蓮心堿以及異蓮心堿均為雙芐基異喹啉型生物堿，但由于數(shù)據量的局限，無法確定單芐基異喹啉型生物堿對PDI抑制活性強于雙芐基異喹啉型生物堿。研究表明，N甲基烏藥堿等可以作為PDI活性的體外模型中的抑制劑。然而，在體內病理環(huán)境下，N甲基烏藥堿能否依然抑制PDI活性而達到治療效果還需要更多的深入研究。

[參考文獻]

[1]Shili Xu， Saranya Sankar， Nouri Neamati Protein disulfide isomerase： a promising target for cancer therapy [J] Drug Discov Today， 2014， 19（3）： 222

[2]Alaiya A A， Almohanna M， Aslam M， et al Proteomicsbased signature for human benign prostate hyperplasia and prostate adenocarcinoma [J] Int J Oncol， 2011， 38（4）： 1047

[3]Hoffstrom B G， Kaplan A， Letso R， et al Inhibitors of protein disulfide isomerase suppress apoptosis induced by misfolded proteins [J] Nat Chem Biol， 2010， 6（12）： 900

[4]Lovat P E， Corazzari M， Armstrong J L， et al Increasing melanoma cell death using inhibitors of protein disulfide isomerases to abrogate survival responses to endoplasmic reticulum stress [J] Cancer Res， 2008， 68（13）： 5363

[5]Xu S， Butkevich A N， Yamada R， et al Discovery of an orally active smallmolecule irreversible inhibitor of protein disulfide isomerase for ovarian cancer treatment [J] Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（4）： 16348

[6]Sipes N J， Miller D A， Bascom C C， et al Altered regulation of protein disulfide isomerase in cells resistant to the growthinhibitory effects of transforming growth factor beta 1 [J] Cell Growth Differ， 1990， 1（5）： 241

[7]Khan M M， Simizu S， Suzuki T， et al Protein disulfide isomerasemediated disulfide bonds regulate the gelatinolytic activity and secretion of matrix metalloproteinase9 [J] Exp Cell Res， 2012， 318（8）： 904

[8]李萍，楊光明，張玉玲，等 蓮子心脂溶性生物堿的分離、鑒定 [J] 食品與生物技術學報，2016，35（1）：19

[9]張京梅，李鵬越，王嵐，等 蓮子心總生物堿的提取分離及藥效學初步研究 [J] 中國實驗方劑學雜志，2009，15（6）：26

[10]邵建，劉艷麗，李笑然，等 蓮子心化學成分的研究 [J] 中草藥，2016，47（10）：1661

[11]周靜，李國兵，鄭怡，等 蓮心堿對乳腺癌細胞MDAMB231自噬功能的影響 [J] 第三軍醫(yī)大學學報，2016，37（7）：629

[12]徐斌，張?zhí)煊?，譚寧，等 蓮心堿促進膀胱癌5637細胞凋亡增強Caspase7表達及活化 [J] 天津醫(yī)藥，2015，43（7）：724

[13]周雅君，時菁，田耕，等 甲基蓮心堿體外抑制人肝癌細胞增殖和侵襲的作用機制研究 [J] 中國藥理學通報，2016，32（11）：1539

[14]Dong Z X， Zhao X， Gu D F， et al Comparative effects of liensinine and neferine on the human etheragogorelated gene potassium channel and pharmacological activity analysis [J] Cell Physiol Biochem， 2012， 29（3/4）： 431

[15]蘇偉，龔少愚，高楓，等 蓮子心對不穩(wěn)定心絞痛患者生活質量及基質金屬蛋白酶9和基質金屬蛋白酶抑制因子1 mRNA表達水平的影響 [J] 中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（8）：2640

[16]周代星，占成業(yè)，何雪心 甲基蓮心堿對AngII誘導血管平滑肌細胞增殖及ERK /NFκB通路的影響[J] 中國新藥雜志，2009，18（15）：1440

[17]施京紅，趙秋菊，丁輝，等 蓮子心對肝纖維化大鼠的抗脂質過氧化作用研究 [J] 中藥材，2016，39（8）：1871

[18]劉志勇，易堅，鄒小明蓮子心萃取物抑制大鼠肝纖維化的作用機制研究 [J] 中國臨床藥理學雜志，2015，31（17）：1749

[19]雷雨，吳立軍，畢丹，等 野獨活莖化學成分的分離與鑒定 [J] 沈陽藥科大學學報，2009，26（2）：104

[20]潘揚，楊光明，蔡寶昌 核磁共振譜分析蓮子心中酚性生物堿的結構 [J] 南京中醫(yī)藥大學學報，2005，21（6）：371

[21]文靜，袁小紅，劉卓 夾竹桃的化學成分研究 [J] 安徽農業(yè)科學，2015，43（9）：65

[22]胡峻 荊芥（穗）有效部位化學成分及其質量標準研究 [D] 北京：北京中醫(yī)藥大學，2005

[23]趙小亮 荷葉化學成分和黃山藥皂苷類化學成分及生物活性的研究 [D] 北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2011

[24]劉旭陽 多枝霧水葛化學成分研究 [D] 廣州：廣東藥學院，2014

[25]陳海芳 沙棘葉總黃酮提取工藝和化學成分研究 [D] 楊凌：西北農林科技大學，2006

[26]馬雙剛，袁紹鵬，侯琦，等 山香圓葉中黃酮苷類成分及其抗炎活性研究 [J] 中國中藥雜志，2013，38（11）：1747

[27]朱云，沈衛(wèi)平，金紅梅 正十六烷基磺酰氯的合成 [J] 合成化學，2001， 9（1）：70

[28]尹偉，宋祖榮，劉金旗，等 桂花的化學成分研究 [J] 中國中藥雜志，2015，40（4）：679

[29]陶冉蓮子心非酚性成分化學和酚性生物堿藥理研究 [D] 南京：南京中醫(yī)藥大學，2008

[30]付東興 羅漢果塊根內生真菌及其次級代謝產物研究 [D] 南寧：廣西大學，2012

[31]李學哲，樸惠順 異喹啉類生物堿的抗腫瘤作用及機制的研究進展 [J] 華西藥學雜志，2014，29（1）：94

[責任編輯丁廣治]