糖尿病腎臟疾病患者血清miR-16-5p水平變化及其意義

張琳，唐平易，周俊，劉立亞，唐東興

(1南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽(yáng) 421001；2衡陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院(南院)；3湖南醫(yī)藥學(xué)院)

糖尿病腎臟疾病患者血清miR-16-5p水平變化及其意義

張琳1，唐平易2，周俊1，劉立亞3，唐東興1

(1南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽(yáng) 421001；2衡陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院(南院)；3湖南醫(yī)藥學(xué)院)

目的 觀察糖尿病腎臟疾病(DKD)患者血清微小RNA-16-5p(miR-16-5p)的水平變化，并探討其意義。方法 DKD患者53例(觀察組)，其中尿蛋白正常者16例、DKD Ⅲ期者19例、Ⅳ期者12例、Ⅴ期者6例，另選50例健康體檢者作為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)血清miR-16-5p，ROC曲線分析血清miR-16-5p水平對(duì)DKD的診斷價(jià)值，Pearson相關(guān)分析法分析其與空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、尿白蛋白/肌酐比值(UACR)、24 h尿白蛋白量的相關(guān)性。結(jié)果 觀察組及對(duì)照組血清miR-16-5p水平分別為0.45±0.25、1.00±0.30，兩組比較，P<0.01。觀察組尿蛋白正常者及DKD Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期者血清miR-16-5p水平分別為0.65±0.29、0.32±0.22、0.30±0.16、0.48±0.12，尿蛋白正常者、DKDⅤ期者與DKDⅢ期者、Ⅳ期者比較，P均<0.05。血清miR-16-5p水平預(yù)測(cè)DKD的ROC曲線下面積為0.931(95%CI：0.883～0.980)，以miR-16-5p水平0.665為截?cái)帱c(diǎn)，其診斷DKD的靈敏度為86.0%、特異度為88.7%。觀察組血清miR-16-5p與FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.71、-0.43、-0.53、-0.72，P均<0.01)。結(jié)論 DKD患者血清miR-16-5p水平降低，且隨病情嚴(yán)重程度變化而變化，檢測(cè)此指標(biāo)有助于DKD的診斷及病情嚴(yán)重程度判斷。

糖尿??；糖尿病腎臟疾??；微小RNA-16-5p

糖尿病腎臟疾病(DKD)是糖尿病患者最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，如未能有效控制，疾病發(fā)展到中后期腎功能將呈進(jìn)行性下降。目前，DKD已成為發(fā)達(dá)國(guó)家終末期腎臟病(ESRD)的首要原因。DKD在我國(guó)的比率也日益升高，約占ESRD病因的16.4%[1]。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNA通過(guò)與靶mRNA結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解，從而導(dǎo)致翻譯抑制，影響靶mRNA的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)miRNA有一個(gè)龐大的小分子調(diào)控RNA家族，它們參與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老及疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[2,3]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是慢性腎臟疾病病情進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)記[4,5]，其異常表達(dá)參與DKD的發(fā)病[6]。miR-16-5p與糖尿病高血糖、高胰島素及胰島素抵抗密切相關(guān)[7,8]，然而其在DKD患者血清中的表達(dá)情況及其與腎臟病情的相關(guān)性目前鮮有報(bào)道。本研究觀察了DKD患者血清miR-16-5p的水平變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6～9月南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的DKD患者53例(觀察組)，男31例，女22例；年齡46～76(54.2±7.2)歲；尿蛋白正常者(病程超過(guò)10年無(wú)DKD及DKD Ⅰ～Ⅱ期)16例、DKD Ⅲ期者19例、DKD Ⅳ期者12例、DKD Ⅴ期者6例；BMI(25.2±3.4)kg/m2；血壓(124±22)/(80±12)mmHg。DKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床分期標(biāo)準(zhǔn)參考DKD Mogensen分期標(biāo)準(zhǔn)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2013版)》。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)其他急慢性腎病，嚴(yán)重血液、心、肺、肝、神經(jīng)系統(tǒng)疾病者，急慢性感染、器官移植、腫瘤、自身免疫性疾病者。另選取同期健康體檢者50例作為對(duì)照組，男30例，女20例；年齡43～72(55.7±6.7)歲；BMI(24.8±3.5)kg/m2；血壓(119±20)/(78±11)mmHg。本研究征得所有研究受試者本人知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 觀察方法 ①miR-16-5p：受試者均于早晨空腹采用普通生化管抽取肘靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，取1 mL血清用于miR-16-5p檢測(cè)。使用TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-16-5p。按照miR-16-5p序列5′-UAGCAGCACGUAAAUAU-UGGCG-3′設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA-

CCGCCAA-3′。PCR上游引物：5′-CTCGCTAGCAG-CACGTAAATA-3′，下游引物：5′-TCCAGTGCAGGGT-CCGAGGT-3′。以Cel-39為內(nèi)參，內(nèi)參引物及PCR條件參考文獻(xiàn)[9]報(bào)道。Rever Tra Ace?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Toyobo公司)逆轉(zhuǎn)錄RNA，PCR使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(大連Takara公司)在實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行，操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-16-5p相對(duì)表達(dá)量。②空腹血糖(FPG)：于早晨空腹采用普通生化管抽取肘靜脈血2 mL，以3 000 r/min離心10 min分離血清，采用己糖激酶法測(cè)定FPG。③糖化血紅蛋白(HbA1c)：于早晨空腹采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝試管抽取肘靜脈血2 mL，運(yùn)用測(cè)定儀檢測(cè)HbA1c。④尿白蛋白/肌酐比值(UACR)、24 h尿白蛋白量：所有受試者均在排除發(fā)熱、劇烈運(yùn)動(dòng)、顯著高血壓狀態(tài)等可能引起尿蛋白排泄增加的情況下，收集24 h內(nèi)所有尿液標(biāo)本，即將早晨6點(diǎn)至次日早晨6點(diǎn)的混合尿定義為24 h尿，將該天中任意一段時(shí)間點(diǎn)留取的尿液定義為隨機(jī)尿。留取隨機(jī)尿、24 h尿，吸取混勻尿液2～3 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上清液。使用日立7600全自動(dòng)生化分析儀，采用免疫比濁法測(cè)定尿白蛋白，采用堿性苦味酸法測(cè)定尿肌酐，計(jì)算UACR，UACR=尿白蛋白(mg)/尿肌酐(g)；以上指標(biāo)所用試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品均由北京利德曼生化技術(shù)有限公司提供。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-16-5p水平比較 觀察組及對(duì)照組血清miR-16-5p水平分別為0.45±0.25、1.00±0.30，兩組比較，P<0.01。觀察組尿蛋白正常及DKD Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期者血清miR-16-5p水平分別為0.65±0.29、0.32±0.22、0.30±0.16、0.48±0.12，尿蛋白正常者、DKDⅤ期者與DKDⅢ期者、Ⅳ期者比較，P均<0.05。

2.2 血清miR-16-5p水平預(yù)測(cè)DKD的ROC曲線分析 血清miR-16-5p水平預(yù)測(cè)DKD的ROC曲線下面積為0.931(95%CI：0.883～0.980)，以miR-16-5p水平0.665為截?cái)帱c(diǎn)，其診斷DKD的靈敏度為86.0%、特異度為88.7%。

2.3 觀察組血清miR-16-5p與FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量的相關(guān)性分析 兩組FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量比較見(jiàn)表1。觀察組血清miR-16-5p與FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.71、-0.43、-0.53、-0.72，P均<0.01)。

表1 兩組FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

DKD是由糖尿病引起的慢性腎病，具有發(fā)病率高、預(yù)后不良的特點(diǎn)，高血糖是導(dǎo)致慢性腎病發(fā)生與發(fā)展的重要原因[10]。然而，高血糖導(dǎo)致慢性腎病發(fā)生與進(jìn)展的分子機(jī)制目前尚不完全清楚。有研究[4,5]表明，miRNA靶向調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要方式，異常表達(dá)的miRNA參與DKD發(fā)生發(fā)展。明確與DKD發(fā)病相關(guān)的特異度miRNA及可能機(jī)制，將有利于DKD的早期診斷和靶向干預(yù)治療。近年研究[6]發(fā)現(xiàn)，多種miRNA如miR-375、miR-9、miR-204/211等都參與了DKD的發(fā)病，并伴有血清中表達(dá)量變化，將可能作為DKD的生物標(biāo)志物。

文獻(xiàn)[7,8]報(bào)道，血糖增高導(dǎo)致患者miR-16-5p表達(dá)明顯下調(diào)。然而，miR-16-5p低表達(dá)是否與DKD患者腎臟病情相關(guān)，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組患者血清miR-16-5p水平低于健康對(duì)照。進(jìn)一步分析觀察組中不同亞組患者miR-16-5p的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，DKDⅢ期、Ⅳ期者miR-16-5p水平低于尿蛋白正常及DKD Ⅴ期者。這表明miR-16-5p可能不僅參與DKD早期的發(fā)生，在中晚期病程進(jìn)展中還可能起著非常重要的作用。另本研究還發(fā)現(xiàn)，以血清miR-16-5p水平0.665為截?cái)帱c(diǎn)，其診斷DKD的靈敏度為86.0%、特異度為88.7%。因此，初步推測(cè)血清miR-16-5p可以作為診斷DKD患者的生物學(xué)指標(biāo)。

以血糖升高為始因并糖代謝紊亂參與始終的DKD患者存在明顯miR-16-5p低表達(dá)。本研究證實(shí)，血清miR-16-5p水平與FPG、HbA1c水平均呈負(fù)相關(guān)，這與先前的研究[7,8]結(jié)果一致。根據(jù)DKD Mogensen分期標(biāo)準(zhǔn)，微量蛋白尿的出現(xiàn)被認(rèn)為是臨床早期診斷DKD的主要線索，它不僅反映了腎臟的損害，還是全身血管內(nèi)皮損害的顯著標(biāo)志。DKD一旦出現(xiàn)明顯的蛋白尿，進(jìn)入Ⅲ期、Ⅳ期，其進(jìn)程常難以逆轉(zhuǎn)。病程進(jìn)展關(guān)鍵時(shí)期，如得不到有效治療，50%患者7年內(nèi)可發(fā)展為終末期腎病[11]。UACR和24 h尿白蛋白量檢測(cè)是臨床常用的協(xié)助DKD分期診斷的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p水平與UACR、24 h尿白蛋白量呈負(fù)相關(guān)，提示miR-16-5p的表達(dá)下調(diào)與DKD腎損害密切相關(guān)，可能參與腎損傷的發(fā)生發(fā)展。

DKD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[12]，其特異性病理改變是結(jié)節(jié)性腎小球硬化，本質(zhì)是常見(jiàn)而難治的微血管并發(fā)癥合并灶狀腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化。而血管內(nèi)皮功能障礙是微血管病變的主要發(fā)病機(jī)理之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能維持是重建血管完整性和維持組織灌注的基礎(chǔ)。通過(guò)文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p可能在多方面參與糖尿病腎損傷。體外和小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，miR-16-5p作為血管調(diào)控因子，其低表達(dá)通過(guò)上調(diào)VEGF-A、VEGFR2、FGF-R1基因表達(dá)，參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙和影響血管生成等[13]。負(fù)向調(diào)控過(guò)高表達(dá)的VEGF-A可使小鼠DKD模型腎功能得到改善[14]。但miR-16-5p具體如何參與DKD病情進(jìn)展的研究目前尚未見(jiàn)相應(yīng)報(bào)道。還有研究[12]認(rèn)為DKD的發(fā)生發(fā)展與腎臟慢性炎癥有關(guān)。慢性炎癥將最終導(dǎo)致腎纖維化、腎功能衰竭。miR-16-5p可能是一種與炎癥負(fù)向相關(guān)的調(diào)控因子，其表達(dá)下調(diào)與炎癥有關(guān)。在大鼠糖尿病模型中，miR-16-5p的水平與腎臟病理指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，正向調(diào)控miR-16-5p的表達(dá)對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的腎纖維化有保護(hù)作用[15]。國(guó)內(nèi)外研究[16]報(bào)道，miR-16-5p在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的模型中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)上調(diào)miR-16-5p能抑制炎癥反應(yīng)、減輕肺損傷。同樣，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)miR-16-5p也存在表達(dá)下調(diào)，并且其與狼瘡病情活動(dòng)有關(guān)[17]。對(duì)妊娠糖尿病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞下調(diào)的miR-16-5p能通過(guò)調(diào)控COX-2基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，介導(dǎo)炎癥失調(diào)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[18]。這提示miR-16-5p可能是DKD重要的調(diào)控靶點(diǎn)。

總之，DKD患者血清miR-16-5p水平明顯下調(diào)，可作為診斷DKD的指標(biāo)，具有較高的靈敏度和特異度。且下調(diào)的miR-16-5p與DKD患者血糖控制和尿白蛋白水平密切相關(guān)，可能參與調(diào)控糖尿病腎臟病理?yè)p傷。然而，miR-16-5p通過(guò)何種機(jī)制參與調(diào)控有待于進(jìn)一步研究。

[1] Liu ZH. Nephrology in China[J]. Nat Rev Nephrol, 2013,9(9):523-528.

[2] Pillai RS. MicroRNA function: multiple mechanisms for a tiny RNA[J]. RNA, 2005,11(12):1753-1761.

[3] 寧莉,魏殿軍.急性腎損傷相關(guān)miRNA的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2017,57(14):110-112.

[4] Van Craenenbroeck AH, Ledeganck KJ, Van Ackeren K, et al. Plasma levels of microRNA in chronic kidney disease: patterns in acute and chronic exercise[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2015,309(12):2008-2016.

[5] Zawada AM, Rogacev KS, Müller S, et al. Massive analysis of cDNA Ends (MACE) and miRNA expression profiling identifies proatherogenic pathways in chronic kidney disease[J]. Epigenetics, 2014,9(1):161-172.

[6] Kato M, Arce L, Natarajan R. MicroRNAs and their role in progressive kidney diseases[J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2009,4(7):1255-1266.

[7] Bork-Jensen J, Scheele C, Christophersen DV, et al. Glucose tolerance is associated with differential expression of microRNAs in skeletal muscle: results from studies of twins with and without type 2 diabetes[J]. Diabetologia, 2015,58(2):363-373.

[8] Lee DE, Brown JL, Rosa ME, et al. microRNA-16 is downregulated during insulin resistance and controls skeletal muscle protein accretion[J]. J Cell Biochem, 2016,117(8):1775-1787.

[9] 袁海軍,湯永紅,袁梅,等.微小RNA-222在急性缺血性腦卒中血清中的表達(dá)及其對(duì)鈣調(diào)蛋白的調(diào)控作用[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(5):765-767.

[10] 中華醫(yī)師協(xié)會(huì)內(nèi)分泌代謝科醫(yī)師分會(huì).2型糖尿病合并慢性腎臟病口服降糖藥用藥原則中國(guó)專家共識(shí)(2015年更新版)[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2016,32(6):455-460.

[11] 楊陽(yáng),張運(yùn)津,謝安,等.糖尿病腎病患者血清miRNA-93的表達(dá)變化及意義[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(3):222-224.

[12] Wada J, Makino H. Inflammation and the pathogenesis of diabetic nephropathy[J]. Clin Sci(Lond), 2013,124(3):139-152.

[13] Chamorro-Jorganes A, Araldi E, Penalva LO, et al. MicroRNA-16 and microRNA-424 regulate cell-autonomous angiogenic functions in endothelial cells via targeting vascular endothelial growth factor receptor-2 and fibroblast growth factor receptor-1[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011,31:2595-2606.

[14] Long J, Wang Y, Wang W, et al. Identification of microRNA-93 as a novel regulator of vascular endothelial growth factor in hyperglycemic conditions[J]. J Biol Chem, 2010,285(30):23457-23465.

[15] Mohan A, Singh RS, Kumari M, et al. Urinary exosomal microRNA-451-5p is a potential early biomarker of diabetic nephropathy in rats[J]. PLoS One, 2016,11(4):e0154055.

[16] 才志剛,張紹明,張珩,等.LPS誘發(fā)急性肺損傷中miR-16的表達(dá)及功能研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,51(2):1-5.

[17] 陳阿瓊,薛向陽(yáng),章麗和,等.microRNA-16在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿中的表達(dá)及意義[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,43(1):26-30.

[18] Di Francesco L, Dovizio M, Trenti A, et al. Dysregulated post-transcriptional control of COX-2 gene expression in gestational diabetic endothelial cells[J]. Br J Pharmacol, 2015,172(18):4575-4587.

湖南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2017JJ2199)。

周俊(E-mail： 420069344@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.016

R587.2

B

1002-266X(2017)31-0055-04

2017-03-13)