羅格列酮對(duì)小鼠高膽固醇血癥的治療作用、肝臟膽汁酸代謝影響及其機(jī)制探討

何芋岐，凌蕾，杜藝玫，馬菲菲，朱春媛，周若雨，茆芮婕，周旭美，王玉和，魯艷柳

(1遵義醫(yī)學(xué)院國(guó)家級(jí)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563099；2遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室；3遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

羅格列酮對(duì)小鼠高膽固醇血癥的治療作用、肝臟膽汁酸代謝影響及其機(jī)制探討

何芋岐1,2，凌蕾1,2，杜藝玫1,2，馬菲菲1,2，朱春媛1,2，周若雨1,2，茆芮婕1,2，周旭美1，王玉和3，魯艷柳2

(1遵義醫(yī)學(xué)院國(guó)家級(jí)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563099；2遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室；3遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 觀察羅格列酮對(duì)小鼠高膽固醇血癥的治療作用、肝臟膽汁酸代謝影響，并探討其可能機(jī)制。方法 36只小鼠隨機(jī)分為3組各12只，干預(yù)組和模型組均制備高膽固醇血癥模型，并分別灌胃羅格列酮羧甲基纖維素鈉混懸液、空白羧甲基纖維素鈉溶液，持續(xù)給予高脂飼料；正常組每日灌胃等體積羧甲基纖維素鈉溶液，始終給予普通飼料。觀察各組組織病理學(xué)及血生化指標(biāo)[血糖、血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)]變化。液質(zhì)聯(lián)用儀分析肝臟組織中膽汁酸豐度。另檢測(cè)肝臟或腸組織中Cyp7a1、Cyp8b1、FXR、SHP、Lrh1、Hnf4α、Fgf15、Fgfr4、JNK1/2、ERK1/2基因。結(jié)果 模型組肝細(xì)胞中充斥大量脂肪泡，干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)脂肪泡接近正常組。與模型組比較，干預(yù)組TC、LDL、血糖水平降低，ALT水平升高，P均<0.05。模型組TCA顯著下降，但干預(yù)組沒(méi)有能逆轉(zhuǎn)其下降的趨勢(shì)；模型組DCA無(wú)太大變化，但干預(yù)組DCA急劇上升，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)對(duì)照組。與模型組比較，干預(yù)組JNK1、Erk2、Cyp7a1、FXR表達(dá)升高，SHP表達(dá)降低，P均<0.05。結(jié)論 羅格列酮對(duì)小鼠高膽固醇血癥有治療作用，且影響肝臟膽汁代謝，其機(jī)制可能為調(diào)控膽汁酸代謝通路基因表達(dá)，影響膽汁酸組的整體輪廓特征。

羅格列酮；高膽固醇血癥；膽汁酸；膽汁酸通路關(guān)鍵基因

羅格列酮是過(guò)氧化物酶體增殖體激活體受體(PPAR)的激動(dòng)劑，除通過(guò)胰島素增敏調(diào)控血糖外，還對(duì)PPAR介導(dǎo)的膽固醇代謝有調(diào)控作用[1,2]。目前，關(guān)于羅格列酮的藥理作用機(jī)制仍然不夠全面。除PPAR外，其他核受體也可能在其中扮演重要的角色。在膽固醇的調(diào)節(jié)中，法尼醇X受體(FXR)的作用極其關(guān)鍵[4]，研究羅格列酮是否通過(guò)FXR通路發(fā)揮藥效以及如何對(duì)該通路進(jìn)行影響具有重要臨床意義。在FXR所調(diào)控的下游通路中，膽汁酸代謝最為獨(dú)特，也與FXR的調(diào)控最為相關(guān)，經(jīng)常通過(guò)膽汁酸通路被調(diào)控程度及膽汁酸組成特征變化來(lái)反映FXR生物功能的調(diào)控，其中肝臟[5～9]和腸道[10,11]兩條途徑非常重要。膽汁酸通路除能夠靈敏的反映FXR生物功能變化外，其本身與糖脂代謝之間也存在密切關(guān)系[12～14]。本研究觀察了羅格列酮對(duì)小鼠高膽固醇血癥的治療作用、肝臟膽汁酸代謝影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 TRIzol(美國(guó)invitrogen公司)；DEPC水(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)；SYBR Green Supermix(美國(guó)Bio-Rad公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；TE緩沖液(pH 8.0，北京索萊寶科技有限公司)；膽汁酸對(duì)照品(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；實(shí)時(shí)定量PCR引物根據(jù)UCSC小鼠mm10基因組，采用Primer5進(jìn)行設(shè)計(jì)后，由上海捷瑞生物工程有限公司代為合成；高脂飼料(美國(guó)Research Diet公司)；乙腈、甲醇等色譜純?cè)噭?美國(guó)Tedia公司)；色譜純乙酸銨(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；羅格列酮鈉片(太極集團(tuán)四川太極制藥有限公司)；其他試劑均為分析純(成都市科龍化工試劑廠(chǎng))。逆轉(zhuǎn)錄用PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)；NANO DROP 2000微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；Y10型超細(xì)勻漿機(jī)(上海翼控機(jī)電有限公司)；DN-36A型水浴氮吹儀(上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司)；Agilent 6420超高效液相色譜聯(lián)用三重四級(jí)桿質(zhì)譜(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；-80 ℃超低溫冰箱(海爾公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及羅格列酮干預(yù) C57/BL小鼠24只，自由攝入高脂飼料16周，制備高膽固醇血癥模型。造模成功后，隨機(jī)分為兩組，干預(yù)組灌胃羅格列酮(1.2 mg/kg)羧甲基纖維素鈉混懸液，1次/d，持續(xù)22周；模型組灌胃等體積的空白羧甲基纖維素鈉溶液；上述兩組小鼠造模成功直至給藥結(jié)束期間，持續(xù)給予高脂飼料。另取12只C57/BL小鼠作對(duì)照(正常組)，始終給予普通飼料，每日灌胃等體積空白羧甲基纖維素鈉溶液。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以7%水合氯醛(0.05 mL/10 g)麻醉，摘眼球取血，離心，分離血清待測(cè)。取肝臟，部分組織10%甲醛溶液固定，其余置于液氮速凍后-80 ℃保存。取十二指腸段，生理鹽水清洗內(nèi)容物，置液氮速凍后-80 ℃保存。

1.3 組織病理學(xué)檢查 將肝臟組織以10%甲醛溶液固定24 h，從低至高濃度的酒精脫水后，二甲苯處理，蠟塊包埋，切6～8 μm薄片，貼片，45 ℃烘干。室溫平衡15 min后，蒸餾水水化，蘇木素溶液染色4 min，流水沖洗數(shù)秒，鹽酸乙醇中分色數(shù)秒，流水沖洗至細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，入伊紅溶液中染色2 min，水洗2～3 min。染色后的切片先后經(jīng)80%和90%酒精中脫水?dāng)?shù)秒，無(wú)水乙醇中先后脫水各1 min，封片，顯微鏡下觀察。

1.4 血生化指標(biāo)檢測(cè) 血糖采用羅氏公司血糖儀進(jìn)行測(cè)定。血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等指標(biāo)采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果以相對(duì)于正常組的倍數(shù)變化表示(正常組TC、LDL、血糖、AST、ALT設(shè)定值分別為1.00±0.03、1.00±0.15、1.00±0.03、1.00±0.19、1.00±0.17)。

1.5 肝臟膽汁酸分析 取肝臟組織100 mg，加甲醇(1 mg/3 μL)勻漿，12 000×g低溫下離心10 min，取上清250 μL氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL的50%甲醇復(fù)溶。復(fù)溶液相同參數(shù)再次離心后，取上清進(jìn)行LC-MS分析。采用Agilent 6420超高效液相色譜聯(lián)用三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)，固定相Waters BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1×100 mm)，以乙腈及乙酸銨溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫參考文獻(xiàn)[15]。質(zhì)譜參數(shù)為Gas Temp：326 ℃，Gas Flow：12 L/min，Nebulizer：55 psi，Capillary：3 500 V。質(zhì)量分析在負(fù)離子模式下采用選擇離子檢測(cè)方式完成。

1.6 膽汁酸通路關(guān)鍵基因分析 分別取肝臟、腸道組織各30 mg，置1 mL TRIzol溶液中冰上勻漿，勻漿液以12 000×g低溫下離心15 min，取分離上清，與200 μL氯仿混合，反復(fù)振搖充分萃取，相同參數(shù)再次離心，轉(zhuǎn)移上清與500 μL異丙醇混合，充分混勻，相同參數(shù)再次離心，棄去上清。75%乙醇(DEPC水配制，1 000 μL)洗滌沉淀，7 500×g低溫下離心15 min，再次棄去上清。沉淀常溫放置，待揮干后加入DEPC水復(fù)溶，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量。1 μg RNA采用隨機(jī)引物及逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用于實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)分析。結(jié)果以相對(duì)于正常組的倍數(shù)變化表示(正常組膽汁酸通路關(guān)鍵基因FXR、Fgf15、Fgfr4、JNK1、JNK2、Erk1、Erk2、CYP7A1、CYP8B1、FXR、SHP、Lrh1、Hnf4α設(shè)定值分別為1.00±0.07、1.00±0.11、1.00±0.10、1.00±0.14、1.00±0.13、1.00±0.12、1.00±0.12、1.00±0.18、1.00±0.15、1.00±0.06、1.00±0.16、1.00±0.07、1.00±0.08)。

2 結(jié)果

2.1 各組組織病理學(xué)檢查結(jié)果比較 組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，模型組肝細(xì)胞中充斥大量脂肪泡,干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)脂肪泡與正常組相近(圖1)。

圖1 各組組織病理學(xué)檢查結(jié)果(×40)

2.2 模型組、干預(yù)組血生化指標(biāo)相較于正常組的倍數(shù)比較 模型組TC、LDL、血糖、AST、ALT相對(duì)于正常組的倍數(shù)分別為2.13±0.22、1.91±0.38、1.17±0.05、1.61±0.16、3.05±1.11，干預(yù)組相對(duì)于正常組的倍數(shù)分別為1.15±0.09、0.93±0.20、0.95±0.03、0.99±0.28、16.64±3.60，與模型組比較，干預(yù)組TC、LDL、血糖水平降低，ALT水平升高(P均<0.05)。

2.3 各組膽汁酸分析結(jié)果比較 本研究中采用LC-MS檢測(cè)了14種膽汁酸(圖2)，包括游離型膽汁酸5種、甘氨酸(G)結(jié)合膽汁酸3種、?；撬?T)結(jié)合膽汁酸6種，基本覆蓋了肝臟中大部分高豐度膽汁酸。為了快速找到這些膽汁酸中，與造模及治療意義相關(guān)的膽汁酸，本研究采用主成分析法對(duì)膽固醇及血糖變化典型的小鼠(每組5只)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明3組小鼠在不同的維度可以得到顯著區(qū)分(見(jiàn)不同虛線(xiàn)橢圓，圖3A)。通過(guò)載荷圖分析可知，造模后以及羅格列酮治療后變化最顯著的膽汁酸分子分別是牛碘酸膽酸(TCA)和脫氧膽酸(DCA)(圖3B)。為驗(yàn)證PCA的結(jié)果，將TCA和DCA按照傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明和主成分分的結(jié)果一致。TCA在造模后顯著下降，但是羅格列酮沒(méi)有能逆轉(zhuǎn)其下降的趨勢(shì)(表1)。DCA在造模后沒(méi)有太大變化，但是羅格列酮給藥后，DCA急劇上升，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)對(duì)照組正常水平(表1)。

注：1為?；撬嵝苋パ跄懰幔?為甘氨酸膽酸，3為熊去氧膽酸，4為?；撬嶝i去氧膽酸，5為膽酸，6為豬去氧膽酸，7為牛磺酸膽酸，8為甘氨酸鵝去氧膽酸，9為?；撬狴Z去氧膽酸，10為甘氨酸脫氧膽酸，11為?；撬崦撗跄懰?，12為鵝去氧膽酸，13為脫氧膽酸，14為?；撬崾懰?。

圖2 膽汁酸總離子流圖

注：A為主成分分析得分圖，B為主成分分析載荷圖。

圖3 肝臟膽汁酸主成分

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.4 模型組、干預(yù)組膽汁酸通路關(guān)鍵基因相較于正常組的倍數(shù)比較 模型組FXR、Fgf15、Fgfr4、JNK1、JNK2、Erk1、Erk2、CYP7A1、CYP8B1、FXR、SHP、Lrh1、Hnf4α基因表達(dá)相對(duì)于正常組的倍數(shù)分別為0.40±0.05、0.47±0.07、0.52±0.07、0.32±0.07、0.47±0.07、0.40±0.05、0.43±0.06、0.18±0.06、0.22±0.07、0.46±0.08、0.44±0.07、0.42±0.05、0.48±0.08，干預(yù)組相對(duì)于正常組的倍數(shù)分別為0.53±0.04、0.47±0.08、0.59±0.06、0.67±0.14、0.81±0.14、0.51±0.05、1.08±0.15、1.09±0.18、0.28±0.06、1.06±0.10、0.20±0.04、0.56±0.12、0.42±0.03，與模型組比較，干預(yù)組JNK1、Erk2、CYP7A1、FXR表達(dá)升高，SHP表達(dá)降低(P均<0.05)。

3 討論

本研究顯示，羅格列酮對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的高膽固醇有顯著治療作用。通過(guò)對(duì)膽汁酸通路關(guān)鍵基因的分析及膽汁酸分子的定量分析，發(fā)現(xiàn)其治療作用與膽汁酸通路非常相關(guān)。Cyp7a1和Cyp8b1是從膽固醇合成膽汁酸的關(guān)鍵酶[16]，高脂飲食壓力下，兩個(gè)酶的基因表達(dá)都嚴(yán)重下調(diào)，這種下調(diào)勢(shì)勢(shì)必造成膽固醇代謝受阻，進(jìn)而出現(xiàn)高膽固醇癥狀。由于膽固醇代謝和血糖代謝非常相關(guān)，同時(shí)也造成了血糖的顯著升高。羅格列酮給藥后，Cyp7a1的表達(dá)被回調(diào)。由于膽汁酸是膽固醇的主要代謝途徑[12]，這就為降低體內(nèi)膽固醇的水平創(chuàng)造了條件。LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，羅格列酮給藥后膽汁酸中的DCA分子有70余倍的上升，與Cyp7a1的變化相關(guān)性明顯，證明了本文的推斷。

除直接參與膽汁酸合成的關(guān)鍵酶Cyp7a1和Cyp8b1，膽汁酸調(diào)控的肝臟途徑的相關(guān)基因也在羅格列酮的作用下發(fā)生了相應(yīng)的顯著變化。首先是肝臟FXR，其為膽汁酸調(diào)控的核心成員[17,18]，本研究顯示在高脂飲食壓力下被顯著抑制，這與文獻(xiàn)[19]報(bào)道非常一致。FXR下游通路中SHP、Lrh1、Hnf4α也被抑制，理論上這一通路的抑制原本會(huì)造成Cyp7a1和Cyp8b1的上升[7～9]，但是本文和文獻(xiàn)均觀察到與之對(duì)應(yīng)的是Cyp7a1、Cyp8b1下調(diào)。這應(yīng)該是機(jī)體在感應(yīng)到膽汁酸合成受阻后發(fā)生的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，只是由于持續(xù)的高脂飲食壓力使得這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用在沒(méi)有藥物干預(yù)的情況下難以發(fā)揮作用。羅格列酮給藥后，通過(guò)進(jìn)一步的下調(diào)SHP，強(qiáng)化了對(duì)Cyp7a1的上調(diào)，故最終完成了通過(guò)打通膽固醇向膽汁酸合成而恢復(fù)糖脂代謝穩(wěn)定的任務(wù)。本研究還顯示，羅格列酮給藥后，在SHP、Cyp7a1之間的Lrh1、Hnf4α表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生變化。據(jù)報(bào)道，SHP可以在蛋白水平與Lrh1、Hnf4α發(fā)生雜合[6,7]，進(jìn)而抑制后兩者的功能。因此，盡管轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生變化，SHP仍然可以在蛋白相互作用的水平抑制Lrh1以及Hnf4α，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)Cyp7a1的上調(diào)。

在膽汁酸調(diào)控的腸道途徑，膽汁酸進(jìn)入腸道后，刺激腸道FXR進(jìn)而誘導(dǎo)其下游因子腸道Fgf15及肝臟Fgfr4、JNK、ERK等表達(dá)[10,11]。本研究顯示，腸道FXR、Fgf15以及腸道Fgf15循環(huán)進(jìn)入肝臟后的下游目標(biāo)JNK、ERK都在高脂飲食壓力下全面下調(diào)。這有可能是由于高脂飲食壓力下膽固醇代謝受阻導(dǎo)致排入腸道膽汁酸減少，使腸道FXR缺乏刺激所致。羅格列酮給藥后，除JNK1和ERK2外，腸道FXR、Fgf15及肝臟Fgfr4、JNK2、ERK1等仍保持下調(diào)趨勢(shì)，為Cyp7a1的上調(diào)創(chuàng)造了條件。JNK1和ERK2的顯著上調(diào)可能是DCA發(fā)生異常升高后機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)措施。

除藥效外，本研究還觀察到羅格列酮給藥后ALT的異常升高。這表明羅格列酮給藥后產(chǎn)生了明顯的肝臟功能紊亂，至少有一定程度肝損傷存在。羅格列酮給藥的肝損傷問(wèn)題已經(jīng)引起關(guān)注[20,21]，但是其產(chǎn)生肝臟毒性的機(jī)制一直不明確。本文在利用LC-MS技術(shù)對(duì)膽汁酸進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)膽汁酸中的DCA分子在干預(yù)組發(fā)生了異常的升高，其升高值是正常組的70余倍。DCA是膽汁酸分子中相對(duì)疏水性較強(qiáng)的分子之一，其肝臟毒性已經(jīng)廣為報(bào)道[22,23]。因此，本研究中觀察到的DCA的異常很可能是羅格列酮造成肝損傷的重要機(jī)制，值得進(jìn)一步深入研究。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81402985，81560673，81660685)；貴州省科技重大專(zhuān)項(xiàng)(黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字[2015]6010)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2015]2158號(hào)，黔科合JZ字[2015]2010號(hào))；貴州省出國(guó)留學(xué)人員擇優(yōu)資助計(jì)劃(黔人項(xiàng)目資助合同(2015)03號(hào))；上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(14DZ2271000)；國(guó)家級(jí)/省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201510661002)；遵義醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(遵醫(yī)[2015]5046)；貴州省藥劑學(xué)研究生卓越人才培養(yǎng)計(jì)劃(黔教研合ZYRC字[2014]019)。

魯艷柳(E-mail: yanliu.lu@foxmail.com、王玉和(E-mail: wangyuhe11@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.009

R966

A

1002-266X(2017)31-0032-04

2017-03-13)