轉(zhuǎn)化生長因子-β對人卵巢癌細胞系SK-OV-3活性氧簇表達的影響及其機制

李瑞，寧楊，田訓，李莉，王玉蘭，曾珍，龔丹妮，黃磊，李賀梅，張慶華

(華中科技大學附屬武漢中心醫(yī)院，武漢 430014)

·基礎(chǔ)研究·

轉(zhuǎn)化生長因子-β對人卵巢癌細胞系SK-OV-3活性氧簇表達的影響及其機制

李瑞，寧楊，田訓，李莉，王玉蘭，曾珍，龔丹妮，黃磊，李賀梅，張慶華

(華中科技大學附屬武漢中心醫(yī)院，武漢 430014)

目的 觀察轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)對人卵巢癌細胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表達的影響，并探討其可能機制。方法 取對數(shù)生長期SK-OV-3細胞，隨機分為兩組，觀察組用2 mL培養(yǎng)液+2 μL無血清DMEM配制的5 μg/mL TGF-β培養(yǎng)(最終濃度為5 ng/mL)，對照組直接加2 mL培養(yǎng)液。流式細胞儀檢測細胞內(nèi)總的活性氧簇(ROS)產(chǎn)生及線粒體來源的ROS,實時熒光定量PCR檢測細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)變化各指標、線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ組分mRNA。結(jié)果 觀察組及對照組總ROS產(chǎn)生量分別為3 159±42.92、1 062±24.41，兩組比較，P<0.05。觀察組及對照組細胞內(nèi)線粒體來源ROS產(chǎn)生量分別為1 254±29.04、1 039±17.32，兩組比較，P<0.05。觀察組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1分別是對照組的0.200 0、6.739 8、4.487 9、1.639 5倍，P均<0.05。觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表達水平較對照組改變倍數(shù)分別為0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍，P均>0.05。觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平較對照組改變倍數(shù)分別為1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍，P均>0.05。結(jié)論 TGF-β誘導細胞內(nèi)總的ROS表達增加，但過量ROS并非來源于線粒體，機制可能是通過調(diào)控細胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)的關(guān)鍵酶從而改變細胞內(nèi)的ROS水平。

轉(zhuǎn)化生長因子-β；人卵巢癌細胞系；SK-OV-3細胞；活性氧簇；上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控者，其在卵巢癌復發(fā)灶的表達水平比卵巢癌原發(fā)灶高[1,2]，并且通過誘導卵巢癌細胞發(fā)生上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)從而增強卵巢癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力[3,4]。TGF-β信號通路改變引起的EMT等變化是腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要原因[5,6]。近期有關(guān)乳腺癌及腎癌的研究顯示，TGF-β誘導細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，并與癌細胞發(fā)生EMT密切相關(guān)[7,8]。但是，TGF-β誘導細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的機制尚不明確。本研究觀察了TGF-β對人卵巢癌細胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表達的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞系SK-OV-3購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。MyCoy′5A培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清及TRIzol試劑購自Thermo Fisher公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Takara公司，CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1抗體購自Proteintech公司，TGF-β來源于R&D公司，CM-H2DCFDA、Mito-SOX染料購自Molecular Probes公司，2×實時熒光定量PCR mix購自Genecopoeia公司。實時熒光定量PCR儀購自BioRad公司，流式細胞分析儀購自Beckman公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理 SK-OV-3細胞用含有10%胎牛血清的MyCoy′5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、含5%CO2濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化，計數(shù)后以3×105/孔的細胞密度均勻接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分成兩組，觀察組用2 mL培養(yǎng)液+2 μL無血清DMEM配制的5 μg/mL TGF-β培養(yǎng)(最終濃度5 ng/mL)[9]，對照組直接加2 mL培養(yǎng)液，各組均為3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞，做后續(xù)的RNA提取，每組重復試驗3次。

1.3 細胞內(nèi)總ROS、線粒體來源ROS檢測方法 按照說明書，將CM-H2DCFDA及Mito-SOX染料加DMSO配制為10 mmol/L的儲液濃度，用37 ℃完全培養(yǎng)基稀釋1 000倍成為工作液；將培養(yǎng)的細胞棄掉原有的培養(yǎng)基，分別加入完全培養(yǎng)基稀釋完成的CM-H2DCFDA及Mito-SOX染料，避光，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20～30 min，棄去染料，用溫的PBS清洗1次，消化，用完全培養(yǎng)基終止，收集細胞，1 200 r/min離心，上流式細胞儀檢測熒光，CM-H2DCFDA用流式儀的FL1通道檢測，Mito-SOX用流式儀的FL2通道檢測，F(xiàn)lowjo 7.6軟件分析流式細胞儀所得的結(jié)果，結(jié)果以10 000個細胞熒光幾何平均值表示。

1.4 細胞EMT變化指標、線粒體復合體Ⅲ主要成分mRNA檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。將6孔板中不同觀察組的細胞用PBS洗1次，加入1 mL TRIzol試劑裂解細胞，提取細胞內(nèi)總RNA，測RNA濃度后，以oligodT逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄1 μg RNA為cDNA(反應(yīng)條件為42 ℃、1 h，72 ℃、10 min)。以cDNA為模板，按2×SYBR實時熒光定量PCR mix的要求，在實時熒光定量PCR儀上擴增及檢測(反應(yīng)條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s處檢測信號，循環(huán)40次；再65～95 ℃，每升高1 ℃收集1次熒光信號，做溶解曲線)。以GAPDH做為內(nèi)參，2-ΔΔCT表示目的基因mRNA相對表達水平，ΔΔCT=(CT目的基因-CT管家基因)實驗組-(CT目的基因-CT管家基因)對照組。引物由武漢天一輝遠公司合成，序列見表1。

表1 各基因?qū)崟r熒光定量PCR引物序列

1.5 細胞內(nèi)線粒體復合體Ⅲ主要成分蛋白檢測方法 采用Western blotting法。收集不同處理條件的細胞，PBS清洗后，用RIPA裂解液裂解細胞蛋白，冰上裂解20 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，BAC法測蛋白，加5×loading buffer，90～100 ℃煮沸10 min后，SDS-PAGE檢測CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白。

2 結(jié)果

2.1 SK-OV-3細胞內(nèi)總ROS產(chǎn)生量比較 觀察組及對照組總ROS產(chǎn)生量分別為3 159±42.92、1 062±24.41，兩組比較，P<0.05。

2.2 SK-OV-3細胞內(nèi)線粒體來源ROS產(chǎn)生量比較 觀察組及對照組細胞內(nèi)線粒體來源ROS產(chǎn)生量分別為1 254±29.04、1 039±17.32，兩組比較，P<0.05。

2.3 SK-OV-3細胞EMT變化指標比較 經(jīng)過5 ng/mL TGF-β作用24 h后，SK-OV-3細胞發(fā)生明顯EMT變化，E-cadherin mRNA表達降低為對照組的0.20倍，N-cadherin、Vimentin、ZEB1分別是對照組的6.7398、4.4879、1.6395倍，P均<0.05。

2.4 SK-OV-3細胞內(nèi)線粒體復合體Ⅲ主要成分mRNA比較 觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表達水平較對照組改變倍數(shù)分別為0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍，P均>0.05。

2.5 SK-OV-3細胞內(nèi)線粒體復合體Ⅲ主要成分蛋白比較 觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平較對照組改變倍數(shù)分別為1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍,P均>0.05。

3 討論

卵巢癌是影響女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率位于女性惡性腫瘤的第3位，但病死率卻排名第一。而卵巢癌在發(fā)現(xiàn)時多數(shù)伴隨轉(zhuǎn)移，研究卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中的變化對卵巢癌的診治有重要意義。TGF-β是EMT的誘導者，也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子，多種腫瘤都可以觀察到TGF-β水平上調(diào)。由于TGF-β通過誘導腫瘤發(fā)生EMT變化，進而促進腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，因此TGF-β水平上調(diào)被認為是腫瘤進展的重要標志[12,13]。研究TGF-β在卵巢癌細胞發(fā)生EMT過程中細胞發(fā)生的改變，將提供卵巢癌診治方面的新視角。

近期研究表明，TGF-β誘導的ROS信號通路改變與TGF-β引起的EMT相關(guān)[7,14]，但TGF-β誘導細胞內(nèi)ROS升高的機制尚不清楚。因此，深入研究TGF-β如何誘導細胞內(nèi)ROS升高能更進一步明確腫瘤進展及轉(zhuǎn)移的機制。前期研究報道，細胞內(nèi)ROS受多種因素調(diào)控，即NADPH氧化酶(Nox家族)、線粒體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、環(huán)氧合酶、細胞色素P450、黃嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶等，其中線粒體及Nox家族是細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源[15]。前期研究顯示，過量ROS產(chǎn)生是TGF-β促進腫瘤發(fā)生EMT的原因之一，所以抑制TGF-β誘導產(chǎn)生ROS將是腫瘤治療的一個方面。因此，探索TGF-β誘導細胞ROS產(chǎn)生機制是目前的研究熱點之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以誘導SK-OV-3發(fā)生EMT變化，進而檢測細胞內(nèi)總的ROS，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)總的ROS量明顯升高。雖然多數(shù)研究認為線粒體尤其是線粒體復合體Ⅲ是細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源，但我們研究發(fā)現(xiàn)TGF-β并未改變細胞內(nèi)線粒體來源的ROS產(chǎn)生量。進而我們檢測SK-OV-3細胞在TGF-β作用后線粒體復合體Ⅲ主要組分mRNA及蛋白表達水平的變化，結(jié)果顯示線粒體復合體Ⅲ主要組分CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA及CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白表達并無明顯變化。因此，本研究證明TGF-β升高細胞內(nèi)總的ROS并不來源于線粒體，TGF-β可能通過調(diào)控細胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)的關(guān)鍵酶從而改變細胞內(nèi)的ROS，確切的生物學機制仍需進一步研究。

[1] Bartlett JM, Langdon SP, Scott WN, et al. Transforming growth factor-beta isoform expression in human ovarian tumours[J]. Eur J Cancer, 1997,33(14):2397-403.

[2] Qiu X, Cheng JC, Zhao J, et al. Transforming growth factor-beta stimulates human ovarian cancer cell migration by up-regulating connexin43 expression via Smad2/3 signaling[J]. Cell Signal, 2015,27(10):1956-1962.

[3] Cheng JC, Auersperg N, Leung PC. TGF-beta induces serous borderline ovarian tumor cell invasion by activating EMT but triggers apoptosis in low-grade serous ovarian carcinoma cells g[J]. PLoS One, 2012,7(8):e42436.

[4] Xu Z, Jiang Y, Steed H, et al. TGFbeta and EGF synergistically induce a more invasive phenotype of epithelial ovarian cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010,401(3):376-381.

[5] Heldin CH, Vanlandewijck M, Moustakas A. Regulation of EMT by TGFbeta in cancer[J]. FEBS Lett, 2012,586(14):1959-1970.

[6] Katsuno Y, Lamouille S, Derynck R. TGF-beta signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression[J]. Curr Opin Oncol, 2013,25(1):76-84.

[7] Boudreau HE, Casterline BW, Rada B, et al. Nox4 involvement in TGF-beta and SMAD3-driven induction of the epithelial-to-mesenchymal transition and migration of breast epithelial cells[J]. Free Radic Biol Med, 2012,53(7):1489-1499.

[8] Rhyu DY, Yang Y, Ha H, et al. Role of reactive oxygen species in TGF-beta1-induced mitogen-activated protein kinase activation and epithelial-mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells[J]. J Am Soc Nephrol, 2005,16(3):667-675.

[9] Fournier PG, Juárez P, Jiang G, et al. The TGF-beta signaling regulator pmepa1 suppresses prostate cancer metastases to bone[J]. Cancer Cell, 2015,27(6):809-821.

[10] Sena LA, Chandel NS. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species[J]. Mol Cell, 2012,48(2):158-167.

[11] Turrens JF. Mitochondrial formation of reactive oxygen species[J]. J Physiol, 2003,552(Pt 2):335-344.

[12] Akhurst RJ. TGF beta signaling in health and disease[J]. Nat Genet, 2004,36(8):790-792.

[13] Derynck R, Akhurst RJ. Differentiation plasticity regulated by TGF-beta family proteins in development and disease[J]. Nat Cell Biol, 2007,9(9):1000-1004.

[14] Jiang Y, Feng X, Zheng L, et al. Thioredoxin 1 mediates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition in salivary adenoid cystic carcinoma[J]. Oncotarget, 2015,6(28):25506-25519.

[15] Holmstr?m KM, Finkel T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014,15(6):411-421.

武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學科研項目(WX11B05)。

張慶華(E-mail： zhangqh66@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.008

R737.31

A

1002-266X(2017)31-0029-03

2016-10-12)