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    綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌Y13UV在油茶體內(nèi)的定殖*

    2017-08-30 14:24:16朱丹雪周國英何苑皞
    林業(yè)科學(xué) 2017年7期
    關(guān)鍵詞:定殖灌根枯草

    金 勤 朱丹雪 周國英 李 河 何苑皞 張 茜,2

    (1. 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長沙 410004;2. 湖南汽車工程職業(yè)學(xué)院 株洲 412001)

    綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌Y13UV在油茶體內(nèi)的定殖*

    金 勤1朱丹雪1周國英1李 河1何苑皞1張 茜1,2

    (1. 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長沙 410004;2. 湖南汽車工程職業(yè)學(xué)院 株洲 412001)

    【目的】 枯草芽孢桿菌Y13UV對油茶炭疽病具有良好的防治效果,研究其在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài),為油茶炭疽病的防治提供依據(jù)?!痉椒ā?通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法引入綠色熒光蛋白質(zhì)粒,構(gòu)建熒光標(biāo)記菌株。通過噴葉、灌根、噴葉灌根結(jié)合處理多種接種方式及重復(fù)接種,測定菌株在油茶體內(nèi)不同組織部位的定殖數(shù)量,分析其定殖規(guī)律及能力。【結(jié)果】 標(biāo)記菌株可以在油茶根、莖和葉內(nèi)定殖,單次接種當(dāng)天,根內(nèi)回收的標(biāo)記菌株數(shù)量為1.07×105cfu·g-1; 噴葉灌根結(jié)合處理7天后,油茶根、莖和葉內(nèi)標(biāo)記菌株的數(shù)量分別為8.70×102、5.00×102和7.30×102cfu·g-1,均高于噴葉、灌根單獨(dú)處理。重復(fù)接種時(shí),油茶根莖葉內(nèi)標(biāo)記菌株的定殖量在接種3~5天內(nèi)達(dá)到高峰,然后呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢, 20天時(shí)定殖量開始大幅下降,第30天噴葉灌根處理的油茶根內(nèi)的定殖量僅為5.30×102cfu·g-1。熒光標(biāo)記菌株生長較好,穩(wěn)定表達(dá),對炭疽病菌具有良好的抑制效果?!窘Y(jié)論】 枯草芽孢桿菌Y13UV能通過噴葉灌根方式接種在油茶體內(nèi)定殖并傳導(dǎo),有較好的定殖能力。

    綠色熒光蛋白; 枯草芽孢桿菌; 油茶炭疽??; 定殖

    在油茶(Camelliaoleifera)生產(chǎn)中,油茶炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)是一種最主要的病害,在各大產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,造成嚴(yán)重的落葉、落果、落蕾,產(chǎn)量降低(楊華等, 2015)。目前,防治油茶炭疽病主要是采取化學(xué)防治和生物防治手段(陳彧等, 2010)。但大量使用化學(xué)農(nóng)藥容易導(dǎo)致植物病原菌產(chǎn)生抗藥性,造成環(huán)境污染,引起人畜中毒等問題(周國英等, 2007)。國內(nèi)外已有不少關(guān)于生物防治植物病害的報(bào)道。周建宏等(2011)通過對40多種植物進(jìn)行篩選,利用篩選出來的丁香(Syringaoblata)和黃苓(Scutellariabaicalensis)研制出了防治油茶炭疽病的純植物源農(nóng)藥。宋光桃(2009)從油茶林土壤中分離出了對油茶炭疽病具有拮抗作用的放線菌CF17。美國Agraquest公司(2001)將枯草芽孢桿菌QST713制成生物殺菌劑,具有廣譜性。

    利用能夠在寄主植物體內(nèi)定殖的內(nèi)生拮抗菌對病害進(jìn)行防治具有獨(dú)特的優(yōu)勢(楊光道等, 2009),實(shí)際應(yīng)用中拮抗作用強(qiáng)并不一定是最好的生防因子,生防菌能否在植株體內(nèi)定殖才是取得防效的關(guān)鍵。研究內(nèi)生細(xì)菌定殖的常用方法有同位素示蹤法(葛銀林等, 1995)、免疫學(xué)方法(劉云霞等, 1996)、抗生素標(biāo)記法(吳藹民等, 2001)、熒光標(biāo)記法(殷幼平等, 2010)。熒光標(biāo)記中的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)熒光性能穩(wěn)定、無需外源反應(yīng)底物、對宿主細(xì)胞無毒害作用、檢測方便,成為研究微生物與宿主或環(huán)境互作的重要工具(王卿等, 2015)。劉郵洲等(2014)發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在番茄(Lycopersiconesculentun)根際土壤中有一定的定殖能力,接種30天后仍可檢測到標(biāo)記菌株。杜芳等(2015)研究了枯草芽孢桿菌Y10在白菜(Brassicarapa)根、莖及葉部組織的定殖情況,結(jié)果表明枯草芽孢桿菌在白菜體內(nèi)有良好的定殖能力,且這種特性可能與其防治根腫病有關(guān)。Yang等(2013)將攜帶質(zhì)粒gfpmut3a基因的穿梭載體pGFP4412 導(dǎo)入生防枯草芽孢桿菌中,通過浸種、蘸根以及灌根接種研究其在黃瓜(Cucummissativus)根表的定殖,發(fā)現(xiàn)在根基部和中部都有標(biāo)記菌株聚集而形成膜狀結(jié)構(gòu),在根的分叉和根冠處可觀察到大量標(biāo)記菌株。關(guān)于綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌在油茶體內(nèi)定殖的研究,國內(nèi)目前未見相關(guān)報(bào)道。

    枯草芽孢桿菌Y13UV是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過誘變獲得的優(yōu)良菌株,本試驗(yàn)通過GFP標(biāo)記研究Y13UV在油茶體內(nèi)的定殖及消長動態(tài),為提高Y13UV防治油茶炭疽病效果和制定施用方法提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試菌株: 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Y13UV,本實(shí)驗(yàn)室分離、誘變保存。

    供試質(zhì)粒和內(nèi)切酶: pHT315-GFP,高效表達(dá)綠色熒光蛋白基因的大腸桿菌(Escherichiacoli)一蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)穿梭載體,HindⅢ和XbaⅠ內(nèi)切酶均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    供試油茶苗: 湘林210品種,2年生健康盆栽苗,購于湖南省林業(yè)種苗中心; 長勢、苗高、大小一致。

    1.2 GFP標(biāo)記菌株Y13UV的構(gòu)建及檢測

    參考陳燕紅等(2014)的方法,本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建標(biāo)記菌株。

    1.2.1 熒光顯微鏡檢測 挑取少許綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株菌體涂布固定,蓋上蓋玻片,在熒光顯微鏡下檢測(激發(fā)光波長480 nm,發(fā)射光波長520 nm),觀察有無熒光產(chǎn)生。

    1.2.2 GFP標(biāo)記菌株生長動力學(xué)測定 挑取GFP標(biāo)記菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)24 h,按1%的接種量接種到100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,每隔4 h測定OD600值。

    1.2.3 GFP標(biāo)記菌株抑菌活性測定 采用平板對峙法: 取炭疽病菌菌餅放在PDA平板中央,將GFP標(biāo)記菌株接種至距離炭疽病菌1.5 cm處,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。待朝向標(biāo)記菌株方向的病原菌菌落不再生長時(shí),采用十字交叉法測量菌落直徑,計(jì)算抑菌率。

    1.3 GFP標(biāo)記菌株在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)

    1.3.1 單次接種監(jiān)測GFP標(biāo)記菌株在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài) 采用噴葉法、灌根法和噴葉灌根結(jié)合法接種標(biāo)記菌菌懸液,濃度為3.2×108cfu·mL-1,每處理3次重復(fù),每處理100株,以無菌水處理為對照。噴葉法: 用噴霧器將菌液均勻地噴灑到油茶葉片上,每株10 mL; 灌根法: 將GFP標(biāo)記菌株菌液澆灌于油茶根部,每株10 mL; 噴葉灌根綜合法: 噴葉和灌根同時(shí)接種,分別為每株5 mL,共10 mL。分別于接種0,1,3,5,7天……對油茶根(主根與側(cè)根混勻)、莖(莖下: 地表3~8 cm莖部;莖中: 8~13 cm莖部;莖上: 13~20 cm莖部)、葉(從上往下不同部位的葉子混勻)進(jìn)行取樣回收,每處理隨機(jī)抽取3株,每份組織樣品0.5 g,直至回收不到標(biāo)記菌株。

    1.3.2 重復(fù)接種監(jiān)測GFP標(biāo)記菌株在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài) 單次接種7天后,進(jìn)行第2次接種。采用的接種方法、菌液濃度及用量與1.3.1 相同。

    分別于接種后1,3,5,10,15,20,30天對油茶根、莖、葉進(jìn)行取樣回收,每處理隨機(jī)抽取3株,每份組織樣品0.5 g,直至回收不到標(biāo)記菌株。

    1.3.3 標(biāo)記菌株的回收與鑒定 分別稱取油茶苗根、莖、葉組織各0.5 g,經(jīng)表面消毒后研磨成勻漿,分別取0.1 mL各梯度稀釋液涂布LB氯霉素抗性平板,28 ℃培養(yǎng)2~3天,在熒光顯微鏡下觀察熒光菌落數(shù)。用接種環(huán)挑取單菌落到10 ml LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)6 h,提取質(zhì)粒,用HindⅢ和XbaⅠ從GFP兩端切開驗(yàn)證回收的菌株是否為標(biāo)記菌株。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差,采用Excel 2007和SPSS19.0軟件處理,顯著性水平采用Duncan’s新復(fù)極差法分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌Y13UV的構(gòu)建及其檢測

    2.1.1 綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌Y13UV的熒光檢測 綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株構(gòu)建好之后,挑取標(biāo)記菌株于載玻片上涂布并固定,在熒光顯微鏡下檢測到菌株發(fā)熒光(圖1),并將綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株記為Y13UV-GFP。

    圖1 Y13UV-GFP在熒光顯微鏡下的表現(xiàn)Fig.1 Fluorescence under the fluorescence microscope of Y13UV-GFP

    2.1.2 綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株Y13UV-GFP生長曲線測定 從圖2可以看出,綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株Y13UV-GFP的生長趨勢與原始菌株Y13UV基本一致。這表明外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入以及綠色熒光蛋白的表達(dá)對菌株Y13UV生長沒有產(chǎn)生不利影響。

    圖2 Y13UV菌株及Y13UV-GFP標(biāo)記菌株生長曲線Fig.2 Growth curve of Y13UV and Y13UV-GFP strains

    2.1.3 綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株Y13UV-GFP的抑菌效果測定 從表1可知: 標(biāo)記菌株Y13UV-GFP和原始菌株Y13UV相比,對炭疽病的抑制效果無顯著差異,因此Y13UV-GFP可以用來進(jìn)行定殖動態(tài)和生防能力的研究。

    表1 標(biāo)記菌株Y13UV-GFP和原始菌株Y13UV的抑菌效果①

    ①平均數(shù)后相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)。The same letter after the averages indicate there was no significant difference(P>0.05).

    2.2 標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)

    2.2.1 標(biāo)記菌株的回收與鑒定 從LB平板上挑取的Y13UV-GFP中提取出 pHT315-GFP(約7.2 kb)質(zhì)粒,對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后可獲得與GFP片段(約714 bp)長度相當(dāng)?shù)钠?。由此可以確定回收到的菌株是Y13UV-GFP。如圖3: M為DL10000 marker,1為從回收菌株中提取的質(zhì)粒pHT315-GFP,2為HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后的產(chǎn)物。

    2.2.2 單次接種監(jiān)測Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài) 如表2所示: 灌根處理當(dāng)天,油茶苗根部能夠檢測到Y(jié)13UV-GFP,其定殖數(shù)量高達(dá)1.07×105cfu·g-1。接種后第1天,在莖及葉組織可以檢測到標(biāo)記菌株; 莖上部位及葉片,定殖數(shù)量隨時(shí)間遞增逐漸減少。接種后第7天,葉片內(nèi)定殖數(shù)量顯著低于根部(P<0.05); 并且回收的植株中,有的葉內(nèi)已經(jīng)檢測不到標(biāo)記菌株。表明Y13UV-GFP能夠通過油茶苗根部短時(shí)間內(nèi)侵入并向上傳遞,但定殖時(shí)間有限。

    噴葉處理后,根、葉片、莖下部位的Y13UV-GFP定殖數(shù)量呈現(xiàn)遞減趨勢。接種后第1天葉內(nèi)的定殖數(shù)量顯著高于灌根處理(P<0.05); 莖上部位的定殖數(shù)量為1.1×103cfu·g-1,莖中部位僅有2.1×102cfu·g-1。在3,5,7天均出現(xiàn)了莖上部位的定殖量高于莖中,此現(xiàn)象在噴葉灌根結(jié)合處理后再次出現(xiàn),且第7天回收的大部分油茶苗葉片內(nèi)檢測不到Y(jié)13UV-GFP,說明通過葉部侵入的Y13UV-GFP有一定向下傳遞的能力。

    噴葉灌根結(jié)合處理后,接種后1天根部定殖數(shù)量為2.00×104cfu·g-1,顯著高于灌根處理的數(shù)量3.00×103cfu·g-1(P<0.05); 莖上部位的定殖數(shù)量高于莖中部位,此現(xiàn)象與噴葉方式處理相同。第7天根部定殖數(shù)量為8.70×102cfu·g-1,仍然高于灌根處理; 葉內(nèi)Y13UV-GFP定殖數(shù)量也高于噴葉處理的數(shù)量。

    綜合來看,3種接種方式下Y13UV-GFP定殖量存在顯著性差異,噴葉灌根結(jié)合處理為最優(yōu)接種方式。

    圖3 Y13UV-GFP酶切鑒定Fig.3 Enzyme identification of Y13UV-GFP

    表2 單次接種情況下Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)①

    ①同一組織不同時(shí)間列中具有相同小寫字母的處理表示不同天數(shù)沒有達(dá)到顯著差異(P>0.05)The same column with the same letters are not significant difference on different day(P>0.05).

    2.2.3 重復(fù)接種監(jiān)測Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài) 1) 灌根接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài) 通過灌根處理,回收檢測結(jié)果顯示: 在油茶根莖葉組織中均可分離檢測到標(biāo)記菌株Y13UV-GFP,且根內(nèi)的定殖量顯著高于葉(P<0.05)。在接種初期,根內(nèi)的定殖量為3.73×103cfu·g-1,高于莖和葉中的定殖量。隨著接種時(shí)間的延長,在根中的定殖量逐漸下降,在30天時(shí)僅有5.30×102cfu·g-1。在莖的各部位(莖下、莖中、莖上)和葉中的定殖量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,莖下部位定殖量在第3天達(dá)到高峰,而莖中、莖上和葉的高峰期均為第5天。各組織中標(biāo)記菌株的數(shù)量在第5~15天較為穩(wěn)定, 20天后數(shù)量迅速減少。在第30天時(shí),根內(nèi)的數(shù)量高于莖內(nèi)各部位和葉。

    圖4 灌根接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)Fig.4 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by pouring root

    2) 噴葉接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài) 采用噴葉法將標(biāo)記菌株Y13UV-GFP接入油茶苗后,回收檢測結(jié)果表明: 在接種后第1天,標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶葉內(nèi)的定殖數(shù)量為6.00×103cfu·g-1,然后迅速下降; 在無套袋處理、自然滴落的情況下,在接種1天后根部回收到的Y13UV-GFP數(shù)量為3.27×103cfu·g-1,與灌根處理的油茶根部第1天的回收量基本一致。莖內(nèi)各部位Y13UV-GFP的定殖量先增后減,莖下部的定殖量在第5天達(dá)到最大值1.60×103cfu·g-1,而莖中部和上部在第3天就達(dá)到最大值,3~10天莖上部位回收量均高于莖中部位。第30天時(shí),根內(nèi)的數(shù)量高于葉和莖內(nèi)各部位; 葉內(nèi)Y13UV-GFP的定殖數(shù)量為4.00×102cfu·g-1,略高于灌根處理葉內(nèi)30天的定殖量。

    圖5 噴葉接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)Fig.5 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by spraying leaf

    3) 噴葉灌根接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài) 通過噴葉灌根接種處理,根內(nèi)標(biāo)記菌株的定殖數(shù)量高于噴葉或灌根單獨(dú)處理的數(shù)量。在接種后第1天,根部標(biāo)記菌株Y13UV-GFP數(shù)量達(dá)8.67×103cfu·g-1,然后降低,第30天的數(shù)量與灌根接種處理的相同。莖各部位的定殖量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,高峰期分別為3天和5天。接種后1天,葉內(nèi)Y13UV-GFP的數(shù)量較高,第3天有所下降,第5天出現(xiàn)第2次高峰,之后下降。第30天時(shí),葉內(nèi)的定殖量高于其他2種處理方式。

    圖6 噴葉灌根接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)Fig.6 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by spraying leaf and pouring root

    3 討論

    采用噴葉法、灌根法、噴葉灌根結(jié)合法3種接種方法接種,均能使標(biāo)記菌株侵入油茶根莖葉內(nèi),并在油茶植株體內(nèi)繁殖和傳導(dǎo)。單次接種時(shí),3種接種方式下標(biāo)記菌株的定殖時(shí)間短,不同接種方式的定殖量存在差異。重復(fù)接種使標(biāo)記菌株在油茶體內(nèi)的定殖時(shí)間長達(dá)30天,噴葉灌根結(jié)合處理30天后,根部定殖量為5.3×102cfu·g-1,葉部為6.7×102cfu·g-1,莖各部(莖上、莖中和莖下)的定殖量均高于其他2種處理方法。經(jīng)酶切鑒定分析,回收菌株均為標(biāo)記菌株Y13UV-GFP。

    王瑞芹(2014)用抗利福平標(biāo)記Y13菌株,雖然抗利福平標(biāo)記的菌株與綠色熒光蛋白標(biāo)記的菌株在油茶體內(nèi)定殖沒有顯著性差異,但抗性菌株接種到植物后,部分菌株會因?yàn)樵谥参矬w內(nèi)沒有了選擇壓力而在增殖過程中丟失了抗利福平的能力(范曉靜, 2007),再者植物內(nèi)生菌有些也可能對利福平具有抗藥性,從而造成分離到的細(xì)菌數(shù)量不準(zhǔn)確,綠色熒光蛋白基因標(biāo)記就減小了分離菌量與實(shí)際定殖菌量的差異。

    研究中發(fā)現(xiàn),單次接種時(shí)Y13UV-GFP定殖時(shí)間短,重復(fù)接種時(shí)葉部回收并未出現(xiàn)5天和7天就已檢測不到標(biāo)記菌株的情況,由此猜想,重復(fù)接種的方式更易于內(nèi)生拮抗細(xì)菌對植株生境的適應(yīng)并穩(wěn)定定殖。重復(fù)接種延長了Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖時(shí)間,也有報(bào)道(王卿等, 2015)指出強(qiáng)化接種1次可能會使生防菌保持一定的種群優(yōu)勢,進(jìn)而將可能對植物有較長的保護(hù)作用。 彭袆等(2010)研究發(fā)現(xiàn)多黏芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)能在番茄根表面形成生物膜,國外也有研究(Timmusketal., 2005)報(bào)道多黏芽孢桿菌可以在植物根尖形成生物膜,生物膜所包被的細(xì)菌群體,對不良環(huán)境有較強(qiáng)的耐受力(Costertonetal., 1995)。至于枯草芽孢桿菌Y13UV是否能在油茶根部形成生物膜則有待進(jìn)一步研究。

    噴葉灌根結(jié)合處理30天后,葉片中的定殖數(shù)量比根部多,相比噴葉灌根單獨(dú)處理的效果好。出現(xiàn)這一結(jié)果,筆者分析其原因可能是綜合處理增強(qiáng)了菌株在葉內(nèi)的定殖效果。葉內(nèi)的標(biāo)記菌株包括從根部進(jìn)入并傳遞到葉片的標(biāo)記菌株和直接從葉片侵入的標(biāo)記菌株,更多的標(biāo)記菌株與其他內(nèi)生菌競爭生態(tài)位,在油茶體內(nèi)繁殖,具有生長優(yōu)勢。針對此結(jié)果,筆者展開了后續(xù)試驗(yàn),研究Y13UV菌株在油茶體內(nèi)定殖對葉內(nèi)微生物的影響。

    國內(nèi)外研究表明,生防菌能否在植物體內(nèi)有效定殖是其發(fā)揮防病作用的重要因素(Kloepperetal., 1981; 連玲麗等, 2011)。本試驗(yàn)初步明確了Y13UV菌株能夠在油茶體穩(wěn)定定殖,不同部位定殖量也有較大差異,這說明對特定部位有所偏好,可能與各部位分泌的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)(李世貴等, 2009; 杜芳等, 2015)。本試驗(yàn)也只研究了Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài),能否在其他植物體內(nèi)穩(wěn)定定殖,進(jìn)而發(fā)揮防治效果,還需進(jìn)一步研究,為大范圍推廣Y13UV提供依據(jù)。

    4 結(jié)論

    將綠色熒光蛋白基因?qū)氲娇莶菅挎邨U菌Y13UV中,標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在藍(lán)光激發(fā)下可以發(fā)出強(qiáng)而穩(wěn)定的綠色熒光、生長好、具有較好的抑菌效果。標(biāo)記菌株可以通過灌根和噴葉的方式侵入油茶體內(nèi),并進(jìn)行繁殖和傳導(dǎo); 20天后達(dá)到穩(wěn)定定殖狀態(tài),定殖時(shí)間長達(dá)30天,為制定枯草芽孢桿菌Y13UV的林間施用措施提供了理論基礎(chǔ)。

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    (責(zé)任編輯 朱乾坤)

    Colonization of GFP-TaggedBacillussubtilisY13UVinCamelliaoleifera

    Jin Qin1Zhu Danxue1Zhou Guoying1Li He1He Yuanhao1Zhang Qian1,2

    (1.HunanProvincalKeyLaboratotyforControlofForestDiseaseandPestsKeyLaboratoryforNon-WoodForestCultivationandConservationofMinistryofEducationCentralSouthUniversityofForestandTechnologyChangsha410004;2.HunanAutomotiveEngineeringVocationalCollegeZhuzhou412001)

    【Objective】BacillussubtilisY13UVcan controlColletotrichumgloeosporioideseffectively. Studying its colonization dynamics could provide a scientific basis for controllingC.gloeosporioides. 【Method】 The GFP plasmid was introduced into cells by protoplasts conversion and to acquire GFP-tagged Y13UV.Camelliaoleiferaplants were inoculated with the GFP-tagged Y13UVwith different methods including foliar spray, root irrigation, foliar spray plus root irrigation, and single or multiple inoculations. The population numbers of GFP-tagged Y13UVin different tissues ofCamelliaoleiferawere quantified after inoculations to test the colonization ability of the GFP-tagged strain. 【Result】 GFP-tagged Y13UVcould colonize in root, stem and leaf tissues ofCamelliaoleifera. In the same day after single inoculation, the population numbers of the marked strain in root were 1.07×105cfu·g-1. Seven days after inoculation by foliar spray plus root irrigation, the population of marked strain in root, stem and leaf tissues ofCamelliaoleiferawere 8.70×102, 5.00×102 and 7.30×102cfu·g-1, respectively. And the population numbers were higher than inoculation by foliar spray or root irrigation alone. With multiple inoculations, the population numbers of the tagged strain reached their peaks about 3-5 days after inoculation, the populations kept stable until they dropped dramatically 20 days after inoculation,. The population number of 30th day in root tissue ofCamelliaoleiferawas5.30×102cfu·g-1when inoculated by foliar spray plus root irrigation. The results showed that GFP-tagged Y13UVgrew better, expressed stably and still had good inhibition toC.gloeosporioides. 【Conclusion】 After inoculated by foliar spray or root irrigation, GFP-tagged Y13UVcould colonize and transfer inCamelliaoleifera, and displayed good colonization ability.

    green fluorescent protein(GFP);Bacillussubtilis;Colletotrichumgloeosporioides; colonization

    10.11707/j.1001-7488.201707012

    2016-04-08;

    2016-12-26。

    “十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2012BAD19B0803); 湖南省研究生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX2015B294); 中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX2015B15)。

    S763.13

    A

    1001-7488(2017)07-0111-07

    * 周國英為通訊作者。

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