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    針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MPO、ICAM-1和IL-lβ的影響

    2017-08-30 13:38:22張玉紅馬玲白荷
    中醫(yī)藥信息 2017年5期
    關(guān)鍵詞:針?biāo)?/a>尼莫地平腦缺血

    張玉紅,馬玲,白荷

    (1.鞏義瑞康醫(yī)院,河南 鄭州 451200;2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院,河南 鄭州 450003; 3.河南漢鈞文化傳播有限公司,河南 鄭州 450009)

    針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MPO、ICAM-1和IL-lβ的影響

    張玉紅1,馬玲2,白荷3

    (1.鞏義瑞康醫(yī)院,河南 鄭州 451200;2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院,河南 鄭州 450003; 3.河南漢鈞文化傳播有限公司,河南 鄭州 450009)

    目的:研究五神針(針刺百會(huì)、四神聰穴)結(jié)合不同劑量的當(dāng)歸四逆湯加減對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性、黏附分子-1(ICAM-1)及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)表達(dá)的影響。方法:將108只SD大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M和針?biāo)幐邉┝拷M,每組再分為3個(gè)亞組,每亞組6只。除假手術(shù)組外均建立腦缺血再灌注模型,尼莫地平片組采用尼莫地平片干預(yù),針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝亢歪標(biāo)幐邉┝拷M分別采用五神針結(jié)合低劑量、中劑量和高劑量當(dāng)歸四逆湯加減進(jìn)行干預(yù),模型組和假手術(shù)組給予等量的生理鹽水。采用運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)法評(píng)估各組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力;TTC染色法檢測(cè)各組大鼠腦梗死體積;采用紫外分光光度比色法檢測(cè)MPO;采用免疫組化法檢測(cè)腦組織中ICAM-1和IL-1β的表達(dá)。結(jié)果:尼莫地平片組和針?biāo)幐邉┝拷M第3 d、5 d與模型組、針?biāo)幍蛣┝拷M和針?biāo)幹袆┝拷M比較,行為異常均有明顯改善(P均<0.05),腦梗死體積明顯減少(P均<0.05),MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達(dá)有顯著的改善(P均<0.05),針?biāo)幐邉┝拷M與尼莫地平片組比較無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論:五神針結(jié)合高劑量當(dāng)歸四逆湯加減能夠明顯縮小腦缺血再灌注后的腦梗死體積,減輕運(yùn)動(dòng)功能缺損,有效改善MPO活性、ICAM-1和IL-lβ蛋白的表達(dá),對(duì)缺血后的腦組織具有保護(hù)作用。

    五神針;當(dāng)歸四逆湯加減;腦缺血再灌注;髓過氧化物酶;黏附分子-1;白細(xì)胞介素-1β

    腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury)是腦的血流中斷,造成缺血區(qū)域缺血缺氧甚至是壞死的病理改變,當(dāng)再灌注時(shí)不但不能恢復(fù)腦神經(jīng)功能反而會(huì)加重腦的損傷,即所謂的腦缺血再灌注損傷[1]。目前西醫(yī)采用抗腦缺血再灌注損傷藥物進(jìn)行治療[2],療效雖好,但副作用較大;中醫(yī)藥對(duì)腦缺血再灌注方面的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),能夠多途徑、多靶點(diǎn)、多向調(diào)節(jié)的作用于腦損傷部位,安全有效[3-4]。筆者多年來一直致力于針刺結(jié)合中藥湯劑治療腦缺血的臨床研究,取得了較好的療效[5-6]。為探索其在治療腦缺血再灌注疾病的內(nèi)在機(jī)理,筆者研究五神針(針刺百會(huì)、四神聰穴)結(jié)合不同劑量當(dāng)歸四逆湯加減對(duì)大鼠腦缺血再灌注后MPO活性、ICAM-1及IL-1β表達(dá)的影響,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

    SPF級(jí)SD大鼠90只,雌雄各半,體質(zhì)量(240±18)g,由河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(豫)2010002。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組:假手術(shù)組、模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹械蛣┝拷M和針?biāo)幐邉┝拷M,每組18只;每組再分為3個(gè)亞組,每亞組6只。

    1.2 試驗(yàn)儀器和試劑

    JD-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠);XJ80-2型醫(yī)用離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠);1141002型號(hào)凝膠拍照儀(美國Wealtec公司);免疫組化用試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);尼龍線栓(線頭直徑(0.32±0.02)mm,北京沙東生物技術(shù)公司);QR-3268型石蠟切片機(jī)(美國AO型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī));華佗牌針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,規(guī)格為0.18 mm×25 mm,批號(hào)GB2024-1994);尼莫地平片(山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司,批號(hào)H37022797);3%戊巴比妥(湖北武漢,批號(hào)302-17-0);所有中藥飲片均來自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院。

    1.3 模型制備

    造模前各組大鼠連續(xù)灌胃15 d,禁食1 d。模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M、針?biāo)幐邉┝拷M的大鼠給予3%戊巴比妥(38 mg/kg)腹腔注射麻醉,然后仰臥固定,常規(guī)備皮消毒,頸中切口,從肌群間向深部分離暴露其頸總動(dòng)脈(CCA),頸外動(dòng)脈(ECA),分別近心端掛線結(jié)扎,微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉近心端距頸總動(dòng)脈分叉處5 mm處,眼科剪45°在CCA遠(yuǎn)端上剪一小口,將制備好的線栓沿切口插入,將預(yù)先置于頸內(nèi)動(dòng)脈上的掛線適度系住防止出血,后移去微動(dòng)脈夾,用眼科鑷緩慢推進(jìn)線栓,使線栓頭端通過CCA分叉進(jìn)入ICA時(shí)將栓線弧度調(diào)整為右下方,遇阻力停止,即達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部,完全阻斷其血流,插入深度自CCA分叉處16~18 mm,將先前的掛線扎緊固定栓線,然后縫合肌肉皮膚,栓線尾端外露部分標(biāo)記,缺血達(dá)到2 h后小心外拉栓線約1 cm使其球端回至CCA內(nèi),即形成再灌注,在缺血期間及再灌注后保持正常體溫,間隔抽吸氣道分泌物使呼吸道保持通暢。假手術(shù)組大鼠經(jīng)同樣麻醉后只分離血管,結(jié)扎。

    1.4 干預(yù)方法

    1.4.1 尼莫地平片組

    劑量為0.126 g/kg,使用前加蒸餾水按1 g/L配制成混懸液,每日3次。

    1.4.2 針?biāo)幗M

    在造模后24 h,同時(shí)給予五神針結(jié)合當(dāng)歸四逆湯加減進(jìn)行治療。針刺穴位定位方法依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7],百會(huì),四神聰(百會(huì)穴前、后、左、右各開2 mm,共4個(gè)穴位)。百會(huì)針刺手法:采用平補(bǔ)平瀉手法,捻轉(zhuǎn)持續(xù)1 min,留針20 min。四神聰針刺手法:采用平刺手法,得氣后用捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法,留針20 min。每日1次,6天為1個(gè)療程,療程間休息1日,連續(xù)治療4個(gè)療程。在針刺同時(shí)給予當(dāng)歸四逆湯加減進(jìn)行治療。組方:當(dāng)歸20 g,熟地黃15 g,川芎10 g,桂枝10 g,牛膝10 g,赤芍10 g,細(xì)辛3 g,大棗 6枚,炙甘草6 g。水煎煮,給藥劑量為低劑量組10.96 g/kg,中劑量組21.92 g/kg,32.88 g/kg,早中晚各1次。

    1.4.3 模型組和假手術(shù)組

    給予等量的生理鹽水。

    1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

    1.5.1 運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)[8]

    分別于造模后1 d、3 d、5 d進(jìn)行網(wǎng)評(píng)試驗(yàn),檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)功能。大鼠可持續(xù)抓住網(wǎng)屏5 s,未滑落,計(jì)0分;大鼠可持續(xù)抓住網(wǎng)屏,有滑落但5 s內(nèi)未掉下,計(jì)1分;大鼠抓住網(wǎng)屏5 s內(nèi)掉下,計(jì)2分;網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動(dòng)過程中大鼠掉下,計(jì)3分。

    1.5.2 腦梗死范圍的測(cè)定

    運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)后,采用TTC染色法進(jìn)行腦梗死范圍測(cè)定??焖贁囝^取腦,去除小腦及低位腦干,余下部分置于-20℃冰箱內(nèi)冷凍15 min,從前額極向后行冠狀位切片后,浸入2%TTC磷酸鹽緩沖液中,水浴箱中染色30 min。將染色后的腦組織放入多聚甲醛中固定24 h,數(shù)碼相機(jī)拍照后,計(jì)算腦梗死體積。腦組織非缺血部分呈現(xiàn)紅色,缺血部分呈現(xiàn)白色。應(yīng)用image J2X圖片分析軟件計(jì)算各切片組織的腦梗死面積,然后根據(jù)公式計(jì)算出腦梗死的體積,計(jì)算公式為:v=(A1+…+An)t/2,t表示切片厚度,A表示梗死面積,最后算出腦梗死灶體積百分比。

    1.5.3 腦組織MPO活性的測(cè)定

    將腦組織從-70℃冰箱內(nèi)取出、解凍、稱重,以試劑盒所提供的試劑配制成勻漿介質(zhì);按重量體積比為1∶19加勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿;其余操作按試劑盒步驟進(jìn)行;取出后在紫色分光光度計(jì)460 nm處,測(cè)定吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算各腦組織的MPO值:MPO(單位/克濕片)=(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)/11.3×取樣量(g)。其中11.3為斜率的倒數(shù),取樣量為所含組織濕片的量。

    1.5.4 免疫組化法檢測(cè)腦組織ICAM-1和IL-lβ蛋白表達(dá)水平

    從4%多聚甲醛中取出腦組織,蒸餾水浸泡2 h,酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,常規(guī)脫蠟等同HE染色。石蠟切片脫蠟至水:二甲苯Ⅰ10 min,二甲苯Ⅱ10 min,100%酒精Ⅰ10 min,100%酒精Ⅱ10 min,95%酒精Ⅰ5 min,95%酒精Ⅱ5 min,80%酒精5 min,蒸餾水沖洗3 min×3次。3% H2O2孵育5~10 min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。 蒸餾水水洗3 min×3次??乖迯?fù):將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(pH值6.0),微波爐中加熱至沸騰5~10 min后,冷卻至室溫。再重復(fù)進(jìn)行一次。 PBS緩沖液(pH值7.2)沖洗2 min×3次。擦干周圍的PBS液,不洗,滴加5%BSA(正常山羊血清),室溫封閉20 min,滴加1∶100比例稀釋的兔抗大鼠IL-1β,然后放入4℃冰箱內(nèi)過夜。從冰箱內(nèi)取出,PBS緩沖液沖洗2 min×3次。 擦干周圍的PBS液后,滴加山羊抗兔二抗IgG,置于室溫(37℃)20 min。PBS緩沖液沖洗2 min×3次。加試劑SABC:滴加稀釋的鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合素(SABC),室溫孵育20 min。PBS緩沖液沖洗5 min×4次。加DAB顯色劑:使用DAB顯色試劑盒。在1 ml蒸餾水中加試劑盒中的A、B各1滴,搖勻后加至切片,室溫中顯色。蒸餾水沖洗顯色的片子5 min,浸于蘇木精中復(fù)染。蒸餾水沖洗復(fù)染后的片子后,將載玻片放入70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精及二甲苯Ⅰ、Ⅱ中,每個(gè)試劑放2 min。浸泡在二甲苯中,搬通風(fēng)柜中。光學(xué)顯微鏡下,以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)的棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。光鏡下,每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)不同的視野,計(jì)算平均陽性細(xì)胞率。

    平均陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分情況比較

    假手術(shù)組未出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)功能異常;模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M和針?biāo)幐呓M大鼠第1 d均出現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能缺損的表現(xiàn);尼莫地平片組和針?biāo)幐邉┝拷M第3 d、5 d與模型組比較,行為異常均有明顯的改善(P<0.01),與針?biāo)幍蛣┝拷M和針?biāo)幹袆┝拷M比較,行為異常均有明顯的改善(P<0.05),針?biāo)幐邉┝拷M與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。

    表1 各組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較

    注:與假手術(shù)組同期比較,*P<0.01;與模型組同期比較,△P<0.05;與尼莫地平片同期比較,▲P>0.05。

    2.2 腦梗死體積情況比較

    假手術(shù)組未出現(xiàn)明顯體積的腦梗死;模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M和針?biāo)幐邉┝拷M大鼠第1 d均出現(xiàn)大面積的腦梗死的表現(xiàn);尼莫地平片組和針?biāo)幐邉┝拷M第3 d、5 d與模型組、針?biāo)幍蛣┝拷M和針?biāo)幹袆┝拷M比較,腦梗死體積均有明顯的減少(P<0.01),針?biāo)幐邉┝拷M與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

    表2 各組腦梗死體積比較

    注:與假手術(shù)組同期比較,*P<0.01;與模型組同期比較,△P<0.05;與尼莫地平片同期比較,▲P>0.05。

    2.3 MPO活性、ICAM-1和IL-lβ的蛋白表達(dá)情況比較

    假手術(shù)組MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白的表達(dá)未出現(xiàn)明顯的變化;模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M和針?biāo)幐邉┝拷M大鼠第1 d均出現(xiàn)MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達(dá)的明顯異常;尼莫地平片組和針?biāo)幐邉┝拷M第3 d、5 d與模型組、針?biāo)幍蛣┝拷M和針?biāo)幹袆┝拷M比較,MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達(dá)均有明顯的改善(P<0.01),針?biāo)幐邉┝拷M與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表3,免疫組化圖見圖1、圖2。

    表3 各組MPO、ICAM-1和IL-lβ比較

    注:與假手術(shù)組同期比較,*P<0.01;與模型組同期比較,△P<0.05;與尼莫地平片同期比較,▲P>0.05。

    圖1 各組大鼠腦缺血再灌注5 d IL-1β蛋白表達(dá)比較(免疫組化,×40)

    圖2 各組大鼠腦缺血再灌注5 d ICAM-1蛋白表達(dá)比較(免疫組化,×40)

    3 討論

    腦血管病歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇,包括缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為風(fēng)、火、痰、瘀阻于腦絡(luò)而出現(xiàn)半身不遂、口眼歪斜、半身麻木等臨床癥狀[10]。心、腦、腎、肝缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、心絞痛、心梗都可歸屬于血行不暢形成的病癥[11-12]。各種原因?qū)е碌哪骋黄鞴偃毖?、缺氧,血流障礙及血流異常而出現(xiàn)的水腫、炎性改變、組織變性等一系列病理改變,都可以概括為血瘀證,應(yīng)用活血化瘀藥物可活其血脈、化其瘀滯[13]。治療機(jī)制主要體現(xiàn)在減輕細(xì)胞內(nèi)鈣的超載、抑制炎癥反應(yīng),減少炎癥因子的釋放及清除氧自由基等。此外活血化瘀的藥物還具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、抑菌和抗病毒的作用[14]。

    西醫(yī)認(rèn)為腦缺血再灌注是一個(gè)復(fù)雜的多因素的通過多種途徑導(dǎo)致?lián)p傷的病理過程,腦缺血后會(huì)出現(xiàn)一個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15],如興奮性氨基酸的釋放、酸中毒、過度炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)離子失衡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基的損傷和凋亡細(xì)胞基因的激活等,這些因素往往都不是單獨(dú)存在的,而是相互關(guān)聯(lián)相互重疊,共同造成腦缺血再灌注損傷[16]。

    IL-1β對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)與中醫(yī)中風(fēng)毒邪學(xué)說有著相似之處。毒邪的生物學(xué)基礎(chǔ)就是腦缺血再灌注后產(chǎn)生的有害物質(zhì),其中炎癥因子的過量表達(dá)就屬于其中一種[17]。炎癥因子介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)和一系列相關(guān)的氧化自由基、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒和酸中毒等反應(yīng),是毒邪損傷腦組織的具體表現(xiàn)形式,這些毒性物質(zhì)共同作用造成神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡,導(dǎo)致腦組織的損害[18]。ICAM-1表達(dá)是啟動(dòng)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附的決定因素。而黏附分子受到炎性細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的刺激過度表達(dá)是腦缺血再灌注損傷的始動(dòng)因素。正常情況下ICAM-1處于低表達(dá)或不表達(dá),在刺激因素、動(dòng)脈硬化、糖尿病、高血壓、缺氧及腦缺血再灌注等因素的誘導(dǎo)下,ICAM-1表達(dá)明顯上調(diào)[19]。在腦缺血再灌注時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞受損及炎性介質(zhì)的釋放,使各種黏附分子表達(dá)明顯增加。MPO的活性降低,可減輕對(duì)腦組織的損害,腦梗面積縮小以及神經(jīng)功能不同程度的好轉(zhuǎn),這些都足以證明針?biāo)幗Y(jié)合針對(duì)炎癥反應(yīng)對(duì)腦組織的毒性效應(yīng)有很好的解毒治療作用。

    針刺對(duì)腦血管疾病的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),針刺百會(huì)能夠調(diào)節(jié)氣血運(yùn)行,增加腦組織供氧量,改善人和動(dòng)物的智力功能,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,修復(fù)受損神經(jīng)元[20-21]。四神聰最早源至《銀海精微》,針刺四神聰可以益氣活血、補(bǔ)腦益智,改善血流變、增加腦組織供氧量,從而促進(jìn)腦部血液循環(huán)。針刺上述穴位具有活血化瘀、益智健腦的功效,可行氣活血,擴(kuò)張腦血管,增加腦組織供氧量,促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù),而神經(jīng)組織功能的恢復(fù)和腦部的血液循環(huán)密切相關(guān)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯出自《傷寒論》,原方由熟地黃,當(dāng)歸,桂枝,白芍,細(xì)辛,通草,大棗和炙甘草組成,具有溫經(jīng)散寒,養(yǎng)血通脈的功效。以赤芍易白芍祛瘀而不傷正,活血而不破血,藥雖平和,療效尚好;加入川芎辛溫香燥,可活血行氣,走而不守,能行散,上行可引藥人巔頂,直達(dá)上部氣血;活血應(yīng)養(yǎng)血和血,忌峻猛克伐,以熟地黃替代通草,補(bǔ)血滋潤,益精填髓。諸藥共用具有益氣活血、健腦益智的功效,能補(bǔ)益氣血,促進(jìn)腦部氣血運(yùn)行,增加腦組織供氧量,修復(fù)受損腦組織。

    五神針配合高劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯加減可益氣活血,改善腦組織血液高凝的狀態(tài),擴(kuò)張腦血管,促進(jìn)腦組織血液循環(huán),促進(jìn)腦缺血再灌注, 修復(fù)腦組織神經(jīng)元, 腦髓充盛則腦竅得聰,增強(qiáng)患者的認(rèn)知和記憶能力,有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠MOP、ICAM-1和IL-1β,具有良好的安全性和穩(wěn)定性,與尼莫地平具有相似的治療作用。

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    河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題(No.2014ZY02060)

    張玉紅(1968-),女,副主任中醫(yī)師,主要從事中醫(yī)藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究工作。

    2017-02-20

    修回日期:2017-03-01

    R285.5

    :A

    :1002-2406(2017)05-0037-05

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