烏腺金絲桃對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量的影響

朱潔宜，吳鑫宇，潘軍英，付新，李冀*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

烏腺金絲桃對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量的影響

朱潔宜1，吳鑫宇1，潘軍英2，付新1，李冀1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討烏腺金絲桃治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型，隨機(jī)分為空白組、模型組、烏腺金絲桃高劑量組、烏腺金絲桃低劑量組、雷公藤多苷片陽性對(duì)照組，采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)各組大鼠血清中細(xì)胞因子白介素17(IL-17)、前列腺素E2(PGE2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、干擾素γ(IFN-γ)的含量。結(jié)果：烏腺金絲桃高劑量組和低劑量組AA大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ的含量與模型組相比顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：烏腺金絲桃治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能與降低IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量有關(guān)。

烏腺金絲桃；佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;IL-17；PGE2；MMP-9；IFN-γ

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病[1-2]。目前發(fā)病機(jī)制不明，難治性、復(fù)發(fā)性、致殘性貫穿該病的始終。該疾病的基本病理表現(xiàn)為滑膜炎和血管翳的形成，后期常會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形，使人致殘，該病無法治愈，所以對(duì)于控制病情的有效藥物研究一直在進(jìn)行。中醫(yī)藥治療RA有著悠久的歷史，且中藥具有毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[3-4]。烏腺金絲桃為民間常用中草藥，味苦，性平，歸心、肝經(jīng)，有鎮(zhèn)痛的功效，主治風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛。本研究復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察IL-17、PGE2、MMP-9及IFN-γ含量的變化,意在探討烏腺金絲桃治療RA的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)安全評(píng)價(jià)中心(GLP)提供;烏腺金絲桃(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)；完全弗氏佐劑(Sigma公司)；雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z31020415)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中加分公司)；ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；i-control Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、烏腺金絲桃高劑量組(以下簡(jiǎn)稱高劑量組)、烏腺金絲桃低劑量組(以下簡(jiǎn)稱低劑量組)、雷公藤多苷片陽性對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱陽性組)，每組10只。

1.2.2 模型制備

除空白組外，其余各組每只大鼠左后足拉直并于左后足跖皮下注射完全弗氏佐劑0.1 ml。

1.2.3 藥物制備

烏腺金絲桃全草剪碎，用16倍量蒸餾水浸泡60 min，冷凝回流提取藥液60 min并過濾，剩余藥渣用14倍量蒸餾水再次提取藥液40 min后濾出；剩余藥渣再以10倍量95%乙醇提取藥液30 min，再進(jìn)行一次30 min醇提，濾出，將4次水醇提取的藥液混合，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至所需的濃度，放置冰箱4℃保存。

雷公藤多苷片研成粉末與蒸餾水充分混勻，制成濃度為0.1%的雷公藤多苷片混懸液，并加入0.01% 的懸混劑羧甲基纖維素鈉，放置冰箱4℃保存。

1.2.4 給藥方法

造模7日后開始灌胃給藥，每日1次，低劑量組灌服1.44 g/kg烏腺金絲桃提取液，高劑量組灌服5.76 g/kg烏腺金絲桃提取液[5-7]，陽性組灌服9.45 mg/kg雷公藤多苷片混懸液，空白組、模型組以1.0 ml/100 g灌服生理鹽水，每組均連續(xù)給藥21天。

1.3 血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ的含量測(cè)定

末次給藥后24 h內(nèi)大鼠禁食禁水，之后全部大鼠稱重，腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠(5 mlkg)，經(jīng)頸總動(dòng)脈取血，將血置于采血管中，3 000 rmp離心15 min，取上清，保存于-20℃冰箱，采用ELISA法檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中IL-17、PGE2的含量比較

由表1可知，模型組大鼠血清IL-17、PGE2的含量明顯升高，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而高、低劑量組和陽性組大鼠血清中IL-17、PGE2的含量均有所下降，與模型組比較，差異具差異顯著(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組大鼠血清IL-17、PGE2的含量比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量比較

由表2可知，模型組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量明顯升高，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量與模型組相比差異顯著(P<0.05)，而高劑量組、陽性組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量與模型組比較，具有極顯著性差異(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清MMP-9、IFN-γ的含量比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但相關(guān)研究表明其發(fā)病機(jī)制與一些細(xì)胞因子密切相關(guān)。

IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌，其參與RA的炎癥反應(yīng)和進(jìn)行性損壞可通過多種途徑實(shí)現(xiàn)[8]。IL-17常通過與其他細(xì)胞因子的相互作用來促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而介導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)節(jié)以致組織損傷[9]。還有研究表明,IL-17能促進(jìn)滑膜血管的增生，加重關(guān)節(jié)破壞，這是通過誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生金屬蛋白酶實(shí)現(xiàn)的[10]。本研究顯示,烏腺金絲桃可下調(diào)IL-17的含量，說明對(duì)抑制RA的炎癥和骨破壞有一定的作用，也通過這一機(jī)制證明了其治療RA的可能性。

花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧化酶代謝產(chǎn)生前列腺素，而前列腺素的合成與釋放體現(xiàn)在炎癥反應(yīng)的全過程中。組織損傷和多種關(guān)節(jié)炎性疾病的產(chǎn)生與PGE2介導(dǎo)蛋白水解酶和炎性因子的產(chǎn)生是息息相關(guān)的[11]，而RA的炎性滲出與PGE2改變血管通透性亦有關(guān)[12]。阻斷PGE2的產(chǎn)生可以治療RA，非甾體抗炎藥就是通過此途徑來發(fā)揮藥效的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏腺金絲桃可降低PGE2的含量，說明PGE2可能是烏腺金絲桃治療的RA機(jī)制之一。

MMP-9是MMPs家族的成員，屬明膠酶類，有研究表明干擾素α可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞MMP-9的合成，加強(qiáng)炎性細(xì)胞的侵襲力，造成RA骨和軟骨的破壞[13]，而血清MMP-9也可作為暫無骨破壞RA患者的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)[14]，亦有研究發(fā)現(xiàn)血管翳的形成與MMP-9促使滑膜下層血管生成有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，烏腺金絲桃高、低劑量組可明顯降低模型大鼠血清中MMP-9的含量，證明其可能通過MMP-9這一機(jī)制參與了RA的治療。

IFN-γ是有著廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的干擾素，與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)[16]，可刺激并增強(qiáng)RA的炎癥反應(yīng)，參與關(guān)節(jié)軟骨等組織的損傷，且作為免疫刺激因子可以促使CD4+Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞的極化，促使免疫系統(tǒng)活化[17]。還有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)血清及滑膜中IFN-γ的表達(dá)，利于平衡Th1/Th2細(xì)胞，從而抑制滑膜局部細(xì)胞及體液免疫反應(yīng),減輕關(guān)節(jié)滑膜炎和血管病變[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烏腺金絲桃高、低劑量組可明顯下調(diào)模型大鼠血清中IFN-γ的含量，說明IFN-γ可能是烏腺金絲桃治療RA的作用機(jī)制之一，這為烏腺金絲桃治療RA的下一步深入研究提供了平臺(tái)。

烏腺金絲桃，又名穩(wěn)心草、趕山鞭，味苦，性平，歸心、肝經(jīng)，有止血、鎮(zhèn)痛、通乳的功效，主治咯血、吐血、子宮出血，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，跌打損傷，神經(jīng)痛，乳腺炎，乳汁缺乏，外用時(shí)常用來治療疔瘡腫毒和外創(chuàng)出血。之前對(duì)于烏腺金絲桃的研究多集中在化學(xué)成分、治療心臟病、抗抑郁等方面[19-20]，本研究從新的角度出發(fā)，分析其治療RA的可能性。而從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，烏腺金絲桃可從抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制骨破壞等方面發(fā)揮其治療RA的功效[21]，這不僅為接下來的深入研究提供了基礎(chǔ)，更為臨床治療RA的用藥提供了新思路。

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EffectofHypericumAttenuatumChoisyonSerumLevelsofIL-17,PGE2,MMP-9andIFN-γinAdjuvantArthritisRats

ZHUJie-yi1，WUXin-yu1，PANJun-ying2,FUXin1,LIJi1*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To investigate the mechanism of Hypericum Attenuatum Choisy(HAC) in the treatment of rheumatoid arthritis. Methods:The rats were randomly divided into the blank group, the model group, the high-dose HAC group, the low-dose HAC group, and the Tripterygium glycosides group. Adjuvant arthritis(AA) model was established in the other four groups except the blank group. The contents of interleukin 17(IL-17), prostaglandin E2(PGE2), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) and interferon γ (IFN- γ) in serum were tested by ELISA method. Results: The contents of IL-17, PGE2, MMP-9, and IFN- γ in the high-dose HAC group and the low-dose HAC group were significantly decreased compared to those in the model group(P<0.05 orP<0.01). Conclusion:The mechanism of HAC in the treatment of rheumatoid arthritis may be related to modulating IL-17, PGE2, MMP-9, IFN-γ.

Hypericum Attenuatum Chosiy; Adjuvant arthritis model rats; Rheumatoid arthritis;IL-17;PGE2;MMP-9;IFN-γ

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81373536);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金面上項(xiàng)目(No.201722)

朱潔宜(1988-)，女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2015級(jí)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè)博士研究生。

李冀*(1960-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向:方劑配伍規(guī)律及作用機(jī)理研究。

2016-12-16

修回日期：2016-12-30

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0013-03