化學(xué)缺氧對小鼠胰腺星狀細(xì)胞增殖活化的影響

關(guān)宇昕， 成洪杰， 崔培林

1.北京積水潭醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100096；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科

論著·胰腺疾病

化學(xué)缺氧對小鼠胰腺星狀細(xì)胞增殖活化的影響

關(guān)宇昕1， 成洪杰2， 崔培林2

1.北京積水潭醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100096；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 探討化學(xué)缺氧對小鼠胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSCs)增殖活化的影響。方法 原代培養(yǎng)出小鼠PSCs并進(jìn)行鑒定，于培養(yǎng)基中加入CoCl2(使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0、50、100、200 μmol/L)培養(yǎng)18 h以誘導(dǎo)化學(xué)低氧狀態(tài)，免疫組化檢測低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)情況，免疫熒光測定PSCs活化情況，細(xì)胞計數(shù)明確細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 隨著培養(yǎng)基中CoCl2終濃度的增加，表達(dá)HIF-1α陽性的細(xì)胞百分比逐漸增加，由0增加至32.000%(31.325%,34.175%)(H=42.333，P=0.000)?；罨腜SCs比例逐漸增加，由(3.833±2.234)%上調(diào)至(21.950±1.446)%(F=258.774，P=0.000)，PSCs計數(shù)逐漸增加，由(61.08±2.712)×104ml-1增加至(71.67±2.309)×104ml-1(F=28.967，P=0.000)。結(jié)論 缺氧條件下通過HIF-1α引起PSCs增殖及活化程度的增加。

缺氧；胰腺星狀細(xì)胞；低氧誘導(dǎo)因子-1α

胰腺纖維化是多種慢性胰腺疾病共同的病理學(xué)改變，其本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)沉積和降解的失平衡，胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells, PSCs)的活化是這種失衡的關(guān)鍵因素[1]。1998年Apte和Bachem等首次用密度梯度離心法從胰腺組織中分離、培養(yǎng)出星狀細(xì)胞[2-3]。該細(xì)胞位于胰腺小葉間和腺泡周圍，約占胰腺細(xì)胞數(shù)的3.99%。在正常組織中，PSCs非常少，免疫組織化學(xué)染色顯示其處于靜止?fàn)顟B(tài),只是偶爾陽性表達(dá)，但在慢性胰腺炎組織中PSCs數(shù)量明顯增多，并處于激活狀態(tài)，表現(xiàn)為α-平滑肌肌動蛋白抗原(α-smooth muscle antigen，α-SMA)表達(dá)明顯增加，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成顯著增加。缺血缺氧廣泛存在于胰腺纖維化這一病理學(xué)改變過程中。胰腺小葉內(nèi)中央動脈是唯一一支供應(yīng)胰腺腺葉的動脈，這種解剖結(jié)構(gòu)決定胰腺組織對缺氧的代償反應(yīng)非常差。HIF-1α是組織細(xì)胞維持氧平衡的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在慢性胰腺疾病缺氧應(yīng)答、胰腺纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本實驗將闡明缺氧通過低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)對體外培養(yǎng)的PSCs增殖活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠，體質(zhì)量約20 g，購自北京天壇醫(yī)院動物實驗中心。

1.2 實驗材料 胰酶抑制劑、兔抗鼠α-SMA單克隆抗體、兔抗鼠HIF-1α單克隆抗體購自美國Sigma公司，SP免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原代細(xì)胞分離：小鼠PSCs分離、培養(yǎng)：取體質(zhì)量20 g左右的清潔級昆明小鼠，乙醚深度麻醉后采用脊髓脫臼法處死，酒精消毒后迅速剖腹取出胰腺，放入預(yù)冷PBS中清洗，于解剖顯微鏡下剔除胰腺被膜及血管。PBS清洗后將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，置于多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板中。1 h后取出培養(yǎng)瓶，加入含200 g/L胎牛血清、1 g/L胰酶抑制劑、10 g/L青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基5 ml,24 h后換液。48 h后細(xì)胞貼壁。

1.3.2 PSCs鑒定：顯微鏡下觀察PSCs形態(tài)。對PSCs進(jìn)行油紅O染色。6孔培養(yǎng)板每孔加入1.5 ml， 40 g/L多聚甲醛室溫固定20 min，將配置好的濃度為5 g/L的油紅溶液與蒸餾水按照3∶2配制為工作液。吸出多聚甲醛，加入工作液，10 min后吸凈，并蒸餾水清洗一遍，顯微鏡下觀察。免疫熒光染色測定傳代后以及化學(xué)誘導(dǎo)缺氧后PSCs中α-SMA表達(dá)情況。甲醛固定30 min。后按1∶800加入0.5 μg/ml抗α-SMA一抗，1孔為對照組加入等體積的PBS替代一抗，室溫90 min。向每孔按1∶100加入FITC標(biāo)記的二抗30 min。避光條件下分別于每孔中加入DAPI熒光染劑。對照組用相同量的PBS替代，3 min。避光條件吸干，于熒光顯微鏡下觀察，藍(lán)色熒光為DAPI染的細(xì)胞核，綠色熒光為α-SMA陽性細(xì)胞。觀察4個高倍鏡視野(50×)計算陽性率。

1.3.3 誘導(dǎo)缺氧狀態(tài)：將細(xì)胞分為4組，每組3個孔板，細(xì)胞長至孔板約70%更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后向培養(yǎng)基中加入CoCl2，使其終濃度分別為0、50、100、200 μmol/L。

1.3.4 SP法(辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素免疫組化染色方法)測定HIF-1α表達(dá)情況：操作步驟參照SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，40 g/L多聚甲醛1 ml于4 ℃固定30 min，PBS沖洗后加入滅活內(nèi)源性過氧化物酶1 ml室溫15 min，PBS沖洗后加入PBS+3 g/L Triton+5 g/L FBS封閉液1 ml 30 min，吸出多余液體后加入兔抗鼠HIF-1α單克隆抗體1 ml 2 μg/ml(Sigma USA)，4 ℃過夜。37 ℃復(fù)溫1 h，PBS洗后加入生物素標(biāo)記的抗兔的Ⅱ抗1 ml，室溫30 min，PBS沖洗，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈酶卵白素1 ml，室溫30 min，PBS沖洗，滴加DAB顯色液，15 min后于顯微鏡下觀察。HIF-1α陽性染色主要定位于細(xì)胞胞核中，細(xì)胞核有淺黃色、棕色、棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞，觀察4個高倍鏡視野(50×)計算陽性率。

2 結(jié)果

2.1 小鼠PSCs鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察:細(xì)胞原代培養(yǎng)48 h，可見大量PSCs貼壁，呈未活化狀態(tài),形態(tài)呈球形，胞核較大，胞漿內(nèi)有許多明亮脂滴，數(shù)量從幾個甚至到幾十個(見圖1)。傳代后細(xì)胞完全活化，形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞向四周伸出突起由圓形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則三角形或星形，并伴有脂滴減少(見圖2)。

2.1.2 油紅O染色法:觀察脂肪滴可見細(xì)胞質(zhì)中有大量被染成紅色的脂滴，圍繞著細(xì)胞核環(huán)形排列(見圖3)。

2.1.3 免疫熒光染色:測定α-SMA表達(dá)：原代培養(yǎng)出的尚未傳代的PSCs幾乎沒有α-SMA蛋白的特異表達(dá)，傳代后PSCs基本完全活化，可見明顯的α-SMA表達(dá)(見圖4)。

2.2 不同缺氧條件下HIF-1α表達(dá) 免疫組化染色顯示,隨著CoCl2濃度增加，表達(dá)HIF-1α陽性的細(xì)胞比例增加。4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=42.333，P=0.000，見圖5、表1)。

圖1 未活化的PSCs；圖2 活化后PSCs；圖3 油紅O染色；圖4 活化后PSCs中α-SMA表達(dá)

Fig 1 Non-activated PSCs; Fig 2 PSCs after activation; Fig 3 Oil Red O staining; Fig 4 Immunostaining of α-SMA in cells after activation

圖5 不同CoCl2濃度下HIF-1α蛋白在PSCs中的表達(dá)情況 A： 0 μmol/L；B： 50 μmol/L；C： 100 μmol/L；D： 200 μmol/L

Fig 5 Expression of HIF-1α protein in PSCs at different concentrations of CoCl2A: 0 μmol/L; B: 50 μmol/L; C: 100 μmol/L; D: 200 μmol/L

表1 不同CoCl2終濃度下HIF-1α表達(dá)

Tab 1 Expression of HIF-1α at different final concentrations of CoCl2

CoCl2濃度(μmol/L)HIF-1α蛋白表達(dá)a(%)005017.650(15.525,19.825)10021.050(19.025,23.475)20032.000(31.325,34.175)

注：a:H=42.333，P=0.000。

2.3 低氧條件下PSCs細(xì)胞增殖、活化情況

2.3.1 細(xì)胞計數(shù)：不同終濃度的CoCl2條件培養(yǎng)基處理PSC細(xì)胞18 h后，PSCs細(xì)胞增殖呈增加趨勢(F=28.967，P=0.000，見圖6、表2)，α-SMA陽性表達(dá)的細(xì)胞百分比也呈現(xiàn)增加趨勢(F=258.774，P=0.000，見表2)，4組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同CoCl2終濃度下α-SMA表達(dá)及PSCs數(shù)量

Tab 2 Expression of α-SMA and counting of PSCs at different final concentrations of CoCl2

CoCl2濃度(μmol/L)α-SMA蛋白表達(dá)a(%)PSCs增殖情況b(細(xì)胞計數(shù),×104ml-1)03.833±2.23461.08±2.7125018.558±1.20964.50±3.82610020.142±2.06467.67±2.53520021.950±1.44671.67±2.309

注：a:F=258.774，P=0.000；b:F=28.967，P=0.000。

圖6 不同CoCl2濃度下細(xì)胞的數(shù)量 A： 0 μmol/L；B： 50 μmol/L；C： 100 μmol/L；D： 200 μmol/L Fig 6 Cell numbers at different concentrations of CoCl2 A: 0 μmol/L; B: 50 μmol/L; C: 100 μmol/L; D: 200 μmol/L

2.3.2 相關(guān)性分析： 將HIF1-α表達(dá)分別與PSCs計數(shù)、α-SMA表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)均呈正相關(guān)(HIF1-α與PSCs計數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.790；HIF1-α與α-SMA表達(dá)的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.828)；且以上兩組均有較強(qiáng)相關(guān)性(P<0.05)。說明缺氧狀態(tài)下，PSCs中HIF1-α表達(dá)明顯上調(diào)，其上調(diào)程度與PSCs的增殖活化呈正相關(guān)。

3 討論

胰腺纖維化將會導(dǎo)致胰腺結(jié)構(gòu)的損壞及功能的缺失。這一病理過程在早期可以控制,甚至逆轉(zhuǎn)，長期而持久存在的促纖維化因素將會引起胰腺結(jié)構(gòu)及功能不可逆的損傷。所以研究導(dǎo)致胰腺纖維化可能的機(jī)制，將會有助于找到抑制胰腺纖維化的因素，對治療胰腺纖維化的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。

已有實驗證實活化的PSCs是造成細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的核心環(huán)節(jié)，大量研究表明，在導(dǎo)致慢性胰腺纖維化的眾多因素中，缺血缺氧是其中一個重要的病理生理過程。已有一項對照研究[4]發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌、慢性胰腺炎和正常胰腺組織中HIF1-α蛋白的陽性表達(dá)率分別為76.2%、22.2%和0，提示HIF1-α表達(dá)可能與胰腺疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。

本研究中我們采用組織塊培養(yǎng)法[5]成功分離并培養(yǎng)了原代小鼠PSCs，并對其進(jìn)行鑒定。實驗中原代培養(yǎng)出的小鼠PSCs呈球形，核較大，胞漿周圍有大量被油紅O染色的脂肪滴，活化后可見有α-SMA表達(dá)。為了模擬細(xì)胞缺氧狀態(tài)，本研究中采用CoCl2誘導(dǎo)化學(xué)缺氧狀態(tài)。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，在觀察期限內(nèi)加入CoCl2后，隨著溶液中CoCl2終濃度的增加，PSCs中HIF1-α陽性的細(xì)胞比例逐漸增加，證明我們成功誘導(dǎo)出缺氧狀態(tài)，另一方面細(xì)胞計數(shù)及免疫熒光結(jié)果提示，PSCs的增殖和活化明顯增加，說明缺氧條件能夠促進(jìn)PSCs的增殖和活化，且程度隨著培養(yǎng)基中CoCl2終濃度增加而增加；眾多研究表明,PSCs的增殖和活化受到包括細(xì)胞因子[6-7]和氧化應(yīng)激[8]在內(nèi)的多種因素影響，如TGF-β1、PDGF、IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等，這些細(xì)胞因子一方面可刺激PSCs產(chǎn)生膠原蛋白，促進(jìn)胰腺的纖維化，同時活化的PSCs本身也可分泌多種細(xì)胞因子，形成自分泌環(huán)，導(dǎo)致PSCs的持續(xù)激活[9-10]。

圖7 不同CoCl2濃度下PSCs細(xì)胞中α-SMA陽性表達(dá) A：DAPI染鏡下所有細(xì)胞的細(xì)胞核α-SMA陽性表達(dá)；B：免疫熒光染色下α-SMA陽性表達(dá)；C：兩者合并后α-SMA陽性表達(dá)

Fig 7 The positive expression of α-SMA in PSCs cells at different concentrations of CoCl2A: positive expression of α-SMA by DAPI staining; B: positive expression of α-SMA by immunofluorescent staining; C: positive expression of α-SMA after the combination of the two staining methods

HIF-1是目前發(fā)現(xiàn)的氧信號相關(guān)傳導(dǎo)途經(jīng)中重要的環(huán)節(jié)。HIF-1存在于大部分人體組織內(nèi)，包含HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位[11]，當(dāng)環(huán)境氧濃度小于5%時，HIF-1α羥化受阻不被降解，與HIF-1β形成二聚體，通過與靶基因上的缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)結(jié)合而促進(jìn)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，影響下游因子表達(dá)[12]。眾多研究表明，HIF-1α參與調(diào)控多種與組織纖維化相關(guān)的因子的表達(dá)：如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、TNF、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGF)、TGFα，β以及結(jié)締組織因子(CTGF)等，這些因子和介質(zhì)均參與PSCs的激活和增殖過程[13-16]。

本研究中，進(jìn)一步將HIF-1α分別與PSCs的增殖及活化情況進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，隨著HIF-1α表達(dá)的增加，PSC細(xì)胞增殖和活化也呈增加趨勢，均為線性正相關(guān)。說明缺氧條件是通過HIF-1α介導(dǎo)PSCs的增殖活化，具體機(jī)制本實驗中未繼續(xù)深入研究。此前已有實驗驗證：HIF-1α對肝星狀細(xì)胞分泌的細(xì)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matric metalloprotease，MMP-2)表達(dá)及酶活性有影響，MMP-2可間接促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化，而活化后的肝星狀細(xì)胞不僅能產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)也是肝內(nèi)MMP-2的主要來源[17]。由于PSCs和肝星狀細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)均有很多相關(guān)性，可以此為切入點進(jìn)一步探討HIF-1α引起PSCs活化以及胰腺纖維化可能的機(jī)制。

本研究結(jié)果提示,化學(xué)缺氧能使PSCs的增殖活化程度增加，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，HIF-1α介導(dǎo)的細(xì)胞通路可能參與這一過程，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。HIF-1α可能是抑制PSCs活化的潛在靶點。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Hypoxia influencing the proliferation and activation of pancreatic stellate cells

GUAN Yuxin1, CHENG Hongjie2, CUI Peilin2

1.Department of Gastroenterology, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100096; 2.Department of Gastroenterology, Beijing Tian Tan Hospital, Capital Medical University, China

Objective To investigate the effects of hypoxia on the proliferation and activation of pancreatic stellate cells (PSCs). Methods The mouse PSCs were isalated and indentified, when reached confluence, the cells were incubated in the DMEM with cobalt chloride (to make the final concentration to 0, 50, 100, 200 μmol/L) for 18 hours. The expression of HIF-1α was investigated by immunohistochemistry. Then the α-SMA expression was determined by immunofluorescence staining. And the cell proliferation was defined by the method of cell count. Results When the final concentration of CoCl2solution were increased from 0 to 200 μmol/L, the expression of HIF-1α was increased from 0 to 32.000%(31.325%, 34.175%). The difference among these four groups was significant (H=42.333,P=0.000); after 18 hours, the expressions of α-SMA were increased: (3.833±2.234)% for 0 μmol/L and (21.950±1.446)% for 200 μmol/L (F=258.774,P=0.000). The number of PSCs also showed an increasing trend, the final concentration of CoCl2from 0 to 200 μmol/L, cell counts were increased from (61.08±2.712)×104ml-1to (71.67±2.309)×104ml-1(F=28.967,P=0.000). Conclusion The proliferation and activation of PSCs increase significantly under hypoxia condition; HIF-1α is involved in the pathophysiological process of proliferation and activation of PSCs.

Hypoxia; Pancreatic stellate cells; Hypoxia-inducible factor-1α

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.07.005

北京市優(yōu)秀人才基金資助(2013D003034000032)

關(guān)宇昕，碩士研究生，E-mail：guanyx_7@126.com

崔培林，博士，副教授，研究生導(dǎo)師，研究方向：胰腺癌發(fā)病機(jī)制。E-mail：cuipl@aliyun.com

R576

A

1006-5709(2017)07-0736-05

2017-06-05