顯微鏡復(fù)檢在血小板假性減低中的應(yīng)用研究

賈相燕，朱麗萍，馬曉波，李慶

(1、彝良縣人民醫(yī)院檢驗科，云南昭通657600；2、昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，云南昆明650032)

顯微鏡復(fù)檢在血小板假性減低中的應(yīng)用研究

賈相燕1，朱麗萍2，馬曉波2，李慶2

(1、彝良縣人民醫(yī)院檢驗科，云南昭通657600；2、昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，云南昆明650032)

目的使用XE-2100血細胞分析儀篩檢血小板，并用顯微鏡復(fù)檢低值血小板，進而排除假性血小板減低的情況，為臨床提供準確有用的實驗結(jié)果。方法選取臨床患者血標本，用儀器進行血小板計數(shù)，同時血涂片鏡檢法間接計數(shù)低值血小板并觀察形態(tài)。結(jié)果鏡檢血小板結(jié)果同儀器結(jié)果相符合，符合率達到97.4%，不符合率達到2.6%，主要是由于假性血小板以及鏡下部分血小板聚集而導(dǎo)致的不符合。結(jié)論嚴格按照血涂片血小板復(fù)檢規(guī)則進行復(fù)檢，觀察鏡下血小板數(shù)量及分布，確保結(jié)果真實可靠，避免漏診和誤診。

血小板計數(shù)；顯微鏡檢查；假性血小板減低；血小板聚集

血小板具有黏附、聚集、釋放反應(yīng)、收縮和吸附的生理特性，能夠維持血管內(nèi)皮細胞的完整性，參與凝血、止血過程，影響纖維蛋白原的降解。當血小板的數(shù)量或質(zhì)量降低時，可引起出血。對于臨床醫(yī)生來說，隨時監(jiān)測血小板計數(shù)是非常重要的。血細胞分析常采用國際血液學標準化委員會（ICSH）建議并得到廣泛使用的EDTA抗凝的靜脈血，用先進的全自動血細胞分析儀對全血進行高效快速的分析，為臨床提供可靠、準確的血細胞參數(shù)。正常情況下，血小板在血循環(huán)中呈單個存在，不與其他細胞或血小板發(fā)生聚集。如圖1。然而EDTA可對極少數(shù)患者，尤其是有自身免疫性疾病、腫瘤、孕產(chǎn)婦等患者的血小板在體外有凝集作用，使血細胞分析儀計數(shù)血小板時，會把聚集的血小板誤認為白細胞，使血小板計數(shù)發(fā)生假性減少。其中抗凝劑EDTA引起的假性血小板減低較常見，稱為EDTA依賴性PTCP（EDTA-dependent pseudo thrombocy topenia，EDTA-PTCP），它是指在體外EDTA抗凝全血中，由于EDTA誘導(dǎo)血小板膜表面隱蔽抗原的暴露或者對抗原的修飾，導(dǎo)致血漿中預(yù)存的循環(huán)自身抗血小板抗體與之發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)血小板聚集而使血細胞分析儀不能正確計數(shù)，造成血小板計數(shù)假性減低的一種現(xiàn)象[1]。EDTA-PTCP發(fā)生率較低，常被忽視，造成誤診誤治。EDTA-PTCP的發(fā)生導(dǎo)致血小板凝集成團，而且這種凝集物，不能被溶血素破壞，同樣也會使白細胞數(shù)增高[2]；另外，冷凝集也會影響血小板計數(shù)。據(jù)報道，臨床上肺炎、蕁麻疹的這類患者血清中存有血清冷球蛋白，冷球蛋白在正常體溫時不會使血小板聚集、當離體后其血液通過EDTA抗凝溫度低于25℃可使自身紅細胞、白細胞、血小板聚集。涂片看到血小板聚集[3]。使用EDTA-K2抗凝，少數(shù)患者血涂片尾部可以看到簇狀聚集的血小板，有時還可以看到血小板黏附于白細胞周圍，形成所謂的“血小板衛(wèi)星現(xiàn)象”，導(dǎo)致血小板計數(shù)偏低。此外，采血不當造成出血不暢時也會造成血小板假性減少。EDTA依賴及血小板衛(wèi)星現(xiàn)象顯微鏡下可見圖2。

圖1 鏡下正常血小板（×100）

圖2 血小板聚集及血小板衛(wèi)星現(xiàn)象（×100）

因此顯微鏡復(fù)檢PLT減少很重要，可以排除假性血小板減少。本文就昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院544例標本檢測其血小板，并同時用顯微鏡復(fù)檢血小板結(jié)果，進而比較分析復(fù)檢結(jié)果的準確性，統(tǒng)計其符合率。

1 材料與方法

1.1 標本來源選取觸發(fā)昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科臨床血液室復(fù)檢規(guī)則的2016年5-8月昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血小板均＜70×109/L的住院和門診患者標本共544例。男性289例，女性255例，年齡2～80歲。

1.2 儀器與試劑采用XE-2100血液分析儀（日本sysmex公司及配套試劑）、質(zhì)控物（中、高值）、雙目顯微鏡（日本Olymplus公司）、HST-302血細胞分析流水線使用配套試劑及質(zhì)控液（日本Sysmex公司）；瑞氏-吉姆薩染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。儀器設(shè)備操作按照標準操作規(guī)程進行[4]。

1.3 復(fù)檢規(guī)則參考由解放軍總醫(yī)院、四川大學華西醫(yī)院、復(fù)旦大學華山醫(yī)院和Sysmex公司組成的國內(nèi)“XE-2100復(fù)檢協(xié)作組”制定的適合XE-2100自動血細胞計數(shù)與白細胞分類的23條涂片復(fù)檢規(guī)則及國內(nèi)文獻[5，6]，制定本院的血小板復(fù)檢規(guī)則：PLT直方圖異常且計數(shù)結(jié)果＞500×109/L或＜70×109/ L。

1.4 血小板計數(shù)全自動血細胞分析儀計數(shù)血小板，并記錄。

1.5 血涂片制備HST-302血細胞分析流水線的涂片染色儀自動對符合復(fù)檢規(guī)則的樣本進行涂片、染色及編號。標本可依照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行手工推片染色[7]。

1.6 人工鏡檢由昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科臨床血液室10年以上工作經(jīng)驗的具備形態(tài)學分析資質(zhì)的檢驗技師，按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[8]方法步驟對上述標本進行顯微鏡鏡檢，得到人工鏡檢復(fù)檢結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學方法以人工鏡檢為標準，將XE-2100血液分析儀對血小板計數(shù)與人工鏡檢復(fù)檢結(jié)果的兩種數(shù)據(jù)采用SPSS（SPSS 19.0）軟件進行統(tǒng)計學處理，進行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)符合正太分布，則用配對t檢驗統(tǒng)計，不符合正態(tài)分布則用非參數(shù)檢驗。并進行相關(guān)性分析，P≤0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血細胞分析儀計數(shù)血小板、血涂片油鏡（10× 100倍）觀察血小板情況⑴經(jīng)對544例患者進行血小板觀察，發(fā)現(xiàn)血小板計數(shù)＜10×109/L時，全片觀察血涂片幾乎觀察不到血小板，油鏡下連續(xù)觀察10個視野以上，偶爾可以看到一個血小板。⑵血小板計數(shù)在20～30×109/L時，全片觀察血涂片，連續(xù)觀察10個視野平均可見到2～3個血小板。⑶血小板計數(shù)在31～40×109/L時，全片觀察血涂片，連續(xù)觀察10個視野平均可見到3～4個血小板。⑷血小板計數(shù)在41～60×109/L時，全片觀血涂片，連續(xù)觀察10個視野平均可見到4～6個血小板。⑸血小板計數(shù)，在61～70×109/L時，全片觀血涂片，連續(xù)觀察10個視野平均可見到6～7個血小板。除了可以看到散在的血小板或成簇狀的血小板外。⑹真性血小板減低機檢以及鏡檢血小板計數(shù)進行配對t檢驗分析，P值均＜0.01，符合率高達97.4%。結(jié)果見表1。⑺544例標本中，鏡檢不符合率達到2.6%，主要是有14例標本是假性血小板減少引起的，其中EDTA依賴性血小板假性減低有5例，大血小板導(dǎo)致患者血小板計數(shù)減低的有9例。經(jīng)過更換抗凝劑以及采用光學法檢測后，血小板計數(shù)與鏡檢符合。

表1 544例復(fù)檢標本PLT復(fù)查前后結(jié)果比較（x±s）

3 討論

血小板既是血液一般檢驗的常見參數(shù)之一，也是臨床出血性疾病的重要參數(shù)之一。血小板具有維持血管內(nèi)皮完整性和黏附聚集、釋放、促凝和血塊收縮功能。血小板計數(shù)是測定全血中血小板濃度，是止血凝血常用的檢查試驗之一。全自動血液分析儀通過電阻抗與光散射特征檢測血小板，具有快速、準確等優(yōu)點。然而在一些特殊情況下，例如采血不順、抗凝劑選擇不當、儀器操作不當以及患者自身基礎(chǔ)疾病等原因的存在[1]，血細胞分析儀檢測PLT結(jié)果減低存在兩種情況：一種是PLT真性減低.即患者由于疾病，比如說ITP、肝腎疾病、藥物的應(yīng)用等導(dǎo)致機體PLT處于一種低水平狀態(tài)；另一種情況則是假性減低，PLT聚集或大PLT存在的情況下常常會導(dǎo)致血細胞分析儀計數(shù)PLT假性減低，這種情況時儀器只能提供簡單的報警信息，例如“PLT Clumps or Giant PLT”，并無法給出一個比較真實的計數(shù)結(jié)果。這時就需要人工辨別其減低的真?zhèn)巍Ｆ駷橹箛鴥?nèi)外尚未研制出一種適合血小板形態(tài)變化的精密儀器，本研究經(jīng)對544例血小板減低的患者進行儀器、血涂片鏡檢觀察血小板情況，當機檢PLT＜70×109/L時，在排除標本有無凝塊的情況下，應(yīng)當采用血涂片觀察血小板情況。在本次統(tǒng)計的數(shù)據(jù)中，當血小板真性減低時，顯微鏡鏡檢復(fù)查結(jié)果同機檢結(jié)果相符合，P＜0.01，符合率達到97.4%；當機檢血小板少，而鏡下有大血小板導(dǎo)致患者血小板計數(shù)減低的患者有9例，發(fā)生率為1.65%，血小板聚集即EDTA依賴性PLT假性減少的患者有5例，發(fā)生率為l%，通過采取光學法、更換抗凝劑等方法處理后，血小板計數(shù)與鏡檢相符合。由此可見，當血小板計數(shù)減少時，應(yīng)涂片觀察血小板，(正常情況下，在油鏡視野下，每200個紅細胞可見到5～20個血小板)應(yīng)排除是否有EDTA依賴性血小板減少癥和假性血小板減少等[9]，從而防止臨床醫(yī)生誤診誤治。

隨著血細胞自動分析儀的普及和不斷改進，它不僅大大提高了臨床檢查的效率，檢測結(jié)果的精密度和準確性也得到了提高，同時，也使儀器的篩檢功能更加完善[9]。但是由于血細胞形態(tài)的多樣性和復(fù)雜性以及儀器的局限性和某些病理變化等干擾因素影響了血細胞分析的準確性，使得某些情況必須由人工鏡檢來完成[10]，以彌補儀器對形態(tài)學鑒別能力的不足。國外也常用血涂片監(jiān)測血小板數(shù)目作為血小板直接計數(shù)的指控方法。本文對比儀器分析法、直接涂片鏡檢計數(shù)血小板的優(yōu)缺點，總結(jié)如下：⑴血細胞分析儀檢測血小板數(shù)目及體積分布，具有測定速度快、重復(fù)性好，準確性高等優(yōu)點。⑵血小板形態(tài)變化多樣，既使有經(jīng)驗的人，也難免出現(xiàn)誤差，經(jīng)常見到同一病人的血小板數(shù)忽高忽低反常現(xiàn)象，如果進行血小板涂片鏡檢不僅可以糾正技術(shù)上的誤差，而且可以觀察血小板病理形態(tài)，為臨床提供血小板質(zhì)變的診斷依據(jù)。⑶對比觀察能排除單用儀器法所帶來的血小板計數(shù)結(jié)果的各種誤差，二者結(jié)合對血小板極低者可進行較好的觀測，兩種方法相互驗證，為臨床提供更可靠的血小板計數(shù)。

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R446.11+1

A

1674-1129(2017)04-0510-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.018

2016-11-16；

2017-05-10)

李慶