CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在肝硬化發(fā)病中的作用及意義

周志敏

(許昌市人民醫(yī)院檢驗科，河南許昌461000)

CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在肝硬化發(fā)病中的作用及意義

周志敏

(許昌市人民醫(yī)院檢驗科，河南許昌461000)

目的檢測病毒性肝硬化患者外周血Treg細胞和IL-10細胞因子表達的變化，探討其相關的臨床意義。方法收集2014年6月到2016年6月我院收治的病毒性肝硬化患者84例，另取同期我院健康體檢者40例作為正常對照。Treg細胞的表達使用流式細胞儀檢測，IL-10的表達使用ELISA法檢測。結果對照組Treg細胞比例和IL-10表達分別為5.14±1. 82%和21.14±4.22ng/L，肝硬化組為2.56±1.02%和9.53±2.61ng/L，對照組上述指標均顯著高于肝硬化組（P＜0.05，P＜0.01）。Child-Pugh評分分級A級、B級和C級患者Treg細胞比例和IL-10表達各級之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中A級顯著高于B級（P＜0.05），B級又顯著高于C級（P＜0.05）。Treg細胞比例和IL-10表達在乙肝病毒性肝硬化患者和丙肝病毒性肝硬化患者之間無顯著性差異（P＞0.05）。結論病毒性肝硬化患者外周血中Treg細胞比例和IL-10表達均減低，提示其可能參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展過程，并可能為肝硬化的治療提供新思路。

病毒性肝硬化；調節(jié)性T細胞；白細胞介素-10

肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，病毒感染、酒精中毒、膽汁淤積、血吸蟲感染等是其常見的病因[1]，其中病毒感染是我國肝硬化的主要原因。病毒感染長期或反復作用可形成彌漫性的肝損害，已被大多數的實驗研究和臨床觀察所證實，但其具體的作用機制仍未明了[2]，給肝炎病毒感染患者肝硬化的防治工作帶來一定的障礙，因此研究病毒損傷肝細胞的作用機制具有顯著的臨床意義[3]。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）是近年來新發(fā)現的一種CD4+效應性T細胞亞群[4]，Treg細胞分泌的IL-10等細胞因子具有減低炎癥反應的作用[5]。本文通過檢測肝硬化患者外周血Treg細胞與IL-10細胞因子表達的變化情況，探討其與肝硬化的相關性，為該病的發(fā)病機制和臨床防治等提供更多的思路。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料本文選取河南省許昌市人民醫(yī)院2014年6月到2016年6月收治的病毒性肝硬化患者84例，其中男47例，女37例，年齡28～67歲，平均41.6±11.3歲，乙肝病毒性肝硬化42例，丙肝病毒性肝硬化42例。肝硬化診斷符合2009美國肝硬化指南，84例患者參照Child-Pugh評分分為[6]：A級26例（5～6分），B級28例（7～9分），C級30例（10～15分）。排除對象：酒精性肝硬化、膽汁性肝硬化、惡性腫瘤、并發(fā)其它免疫和結締組織疾病。并選取同期在我院行健康體檢者40例作為對照組，其中男性21例，女性19例，年齡29～68歲，平均年齡42.2±10.7歲。兩組受試者在性別、年齡等一般臨床資料方面比較，無顯著性差異，可進行比較（P＞0.05）。

1.2 Treg細胞的流式細胞儀檢測取所有受試者外周靜脈抗凝血5ml，并采用密度梯度離心分離法分離單個核細胞，分離液試劑盒購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司，1500g×20min，單個核細胞層即血漿層和分離液交界處，吸取單個核細胞層。將細胞濃度調整為106個細胞/ml，并在400μl懸浮液中加入R&D公司生產的FITCCD25與PE-CD4抗體以及相應的同型對照，并在室溫避光下孵育30min。同型對照調零，使用美國BD公司生產的FACSCalibur流式細胞儀檢測CD25及CD4雙陽性的Treg細胞。

1.3 血清白介素-10（IL-10）表達的測定取所有受試者外周靜脈血2ml，1500g×15min，并分離上清待測。采用ELISA法測定血清IL-10表達，試劑盒為深圳達科為生物科技技術有限公司生產，嚴格按照說明書操作，根據標準品，德國艾迪(AID)公司提供的酶聯分析儀測定OD值，并根據OD值計算IL-10濃度。

1.4 統(tǒng)計學方法文中所涉及的數據均采用SPSS 18.0統(tǒng)計包處理數據，實驗數據連續(xù)性資料以均值±標準差（x±s）表示，兩樣本均數比較行t檢驗，外周血Treg細胞、IL-10與肝癌Child-Pugh評分的關系應用Pearson單因素分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組在外周血Treg細胞和IL-10表達上的變化對照組Treg細胞比例和IL-10表達分別為5.14±1.82%和21.14±4.22ng/L，肝硬化組為2.56± 1.02%和9.53±2.61ng/L，對照組上述指標均顯著高于肝硬化組（P＜0.05，P＜0.01）。見表1和圖1。

表1 兩組Treg細胞和IL-10表達的比較

圖1 Treg細胞的流式細胞儀檢測

2.2 肝硬化患者不同分級中Treg細胞和IL-10表達的變化肝硬化Child-Pugh評分分級A級、B級和C級患者Treg細胞比例和IL-10表達各級之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中A級顯著高于B級（P＜0.05），B級也顯著高于C級（P＜0.05）。見表2。

表2 三組Treg細胞和IL-10表達的比較

2.3 不同病毒感染者之間Treg細胞和IL-10表達的變化從表3可見Treg細胞比例和IL-10表達在乙肝病毒性肝硬化患者和丙肝病毒性肝硬化患者之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 兩組Treg細胞和IL-10表達的比較

2.4 外周血Treg細胞、IL-10與肝癌Child-Pugh評分的關系經Pearson單因素分析可知，外周血Treg細胞、IL-10與肝癌Child-Pugh評分呈負相關（r=-0.352，-0.366，P=0.000）

3 討論

病毒引起肝硬化的致病機制至今尚不清楚，目前認為涉及多種因素，隨著相關研究的不斷深入，最近幾年來免疫系統(tǒng)的紊亂引起了學者的注意，成為了研究該病的新型熱點[7]。Treg細胞能夠下調機體對異體抗原或自身抗原的免疫應答水平，起到免疫抑制的作用，同時維持機體自身耐受[8，9]，而且作為肝硬化本身就是一種免疫耐受異常性的疾病，患者的免疫細胞在遭受病毒攻擊時也會相應的損傷肝細胞，Tregs細胞可以通過T-T細胞間的相互接觸作用來降低CD8+T細胞的增殖和產生IFN-γ的能力[10，11]，這些都可以促進組織纖維化的發(fā)生，本研究的結果顯示了肝硬化患者Tregs細胞比例顯著低于正常對照人群，IL-10是Tregs細胞分泌的主要效應因子[12]，本研究也表明肝硬化患者IL-10表達水平明顯低于正常對照組，這提示肝硬化患者處于一種免疫抑制的狀態(tài)，這可能就是其發(fā)生、發(fā)展的機制。

肝硬化Child-Pugh分級是綜合臨床、凝血、肝功能等實驗室檢查的一種評價分級方法，分級與預后密切相關，A級預后最好，C級預后最差，B級介于中間[13]，本研究顯示A級、B級和C級患者Treg細胞比例和IL-10表達各級之間存在顯著性差異，其中A級顯著高于B級，B級顯著高于C級，經Pearson單因素分析可知，外周血Treg細胞、IL-10與肝癌Child-Pugh評分呈負相關，說明了Treg細胞比例和IL-10表達隨著患者病情的惡化而呈現減低的趨勢，Treg細胞的低表達可能參與了肝硬化病變的發(fā)展過程，Treg細胞的檢測可用于患者預后的評估[14，15]。導致肝硬化的病毒主要是乙型和丙型肝炎病毒，本研究顯示了Treg細胞比例和IL-10表達在乙肝病毒性肝硬化患者和丙肝病毒性肝硬化患者之間無顯著性差異，說明了Treg細胞表達變化與病毒感染的類型無相關性，但病毒導致Treg細胞減低的原因有待進一步的研究來探明。本研究發(fā)現肝硬化組不只是CD4、CD25雙陽的細胞減少了，CD25陰性CD4陽性的細胞也少了，考慮可能原因為肝硬化患者中Tregs細胞可通過CTLA-4、TGF-β及GITR等與靶細胞上的相應受體結合，并抑制靶細胞上IL-10Rα鏈的表達，降低靶細胞對IL-10的反應性從而抑制效應T細胞的增殖有關[16]。

總之，本文研究結果顯示病毒性肝硬化患者外周血中Treg細胞比例和IL-10表達顯著減低，提示其可能參與了肝硬化的發(fā)生及發(fā)展過程，改善肝臟的抑制性微環(huán)境可能有助于肝硬化的治療。

[1]Aspinall EJ，Hawkins G，Fraser A，et al.Hepatitis B prevention，diagnosis，treatment and care：a review[J].Occup Med，2011，61(8)：531-540.

[2]黃建宏，林心，黃翠珍，等.乙型肝炎患者CD4+CD25+調節(jié)性T細胞檢測及意義[J].中華全科醫(yī)學，2011，9(1)：119-120.

[3]郭存麗，程文，徐易，等.肝細胞癌患者外周血及腫瘤微環(huán)境中自然殺傷細胞的亞群變化及其臨床意義[J].臨床腫瘤學雜志，2014，19(2)：117-121.

[4]Katz SC，Ryan K，Ahmed N，et al.Obstructive jaundice expands intrahepatic regulatory T cells，which impair liver T lymphocyte function but modulate liver cholestasis and fibrosis[J].J Immunol，2011，187(3)：1150-1156.

[5]Zhang B，Hu M，Zhang P，et al.BAFF promotes regulatory T-cell apoptosis and blocks cytokine production by activating B cells in primary biliary cirrhosis[J].Braz J Med Biol Res，2013，46(5)：433-439.

[6]黎娜，崔超英，范書英，等.肝硬化患者Child-Pugh分級與體表心電圖QTc的相關性研究[J].中國醫(yī)藥科學，2012，2(10)：12-13.

[7]Tucker RM，Feldman AG，Fenner EK，et al.Regulatory T cells inhibit Th1 cell-mediated bile duct injury in murine biliary atresia [J].J Hepatol，2013，59(4)：790-796.

[8]白青山，金世柱，韓明子，等.CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在丙型肝炎發(fā)病中的作用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2013，22(6)：604-606.

[9]牟花妮，蔣玉鳳.抗病毒治療對慢性乙型肝炎患者調節(jié)性T細胞影響的研究進展[J].中國當代醫(yī)藥，2015，22（23）：15-18.

[10]Ferri S，Lalanne C，Lanzoni G，et al.Redistribution of regulatory T-cells across the evolving stages of chronic hepatitis C[J].Dig Liver Dis，2011，43(10)：807-813.

[11]何文敏，蘇毅.IL-10和IL-17在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝硬化合并腹腔感染中的研究進展[J].世界華人消化雜志，2014，22(3)：333-339.

[12]黃啟強，黃麗慶，周青，等.HCV早期感染者病毒載量與CD4＋CD25＋Foxp3＋調節(jié)性T淋巴細胞相關性研究[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2015，12（08）：1045-1047.

[13]Muratori L，Longhi MS.The interplay between regulatory and effector T cells in autoimmune hepatitis：Implications for innovative treatment strategies[J].J Autoimmun，2013，46(1)：74-80.

[14]郭曉霞，李良學，武玉鵬，等.調肝理脾方對原發(fā)性膽汁性肝硬化小鼠調節(jié)性T細胞及肝組織病理的影響[J].中醫(yī)雜志，2016，57(2)：161-165.

[15]晁佩佩，盛慧萍，石文波，等.慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+CD127low/-調節(jié)性T細胞表達及其與肝組織病理、HBV-cccDNA的關系[J].西安交通大學學報（醫(yī)學版），2016，37（1）：87-91.

[16]曾曉明，鄭九生，龔維，等.CD4+CD25+Treg細胞及其相關細胞因子在HBV感染孕婦胎盤組織中的表達[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2015，5(5)：528-532.

The Rose of CD4+CD25+Regulatory T cells in the Pathogenesis of Liver Cirrhosis

ZHOU Zhimin.Department of Laboratory，Xuchang People's Hospital，Xuchang Henan，461000，China.

Objective To detect the changes of Treg cells and the expression of IL-10 in the pathogenesis of liver cirrhosis and explore its clinical significance.Methods A total of 84 patients with virous liver cirrhosis from June 2014 to June 2016 were enrolled in this study，and 40 cases were chosen from the medical examination as normal control.The number of Treg cells in liver cirrhosis patients and normal control was analyzed by floe cytometry，and the expression of IL-10 was detected by Real-time PCR analysis.Results The percent of Treg cells and expression of IL-10 in control group were 5.14±1.82%and 21.14±4.22ng/L，which were respectively higher than 2.56±1.02%and 9.53±2.61ng/L in liver cirrhosis group(P＜0.05，P＜0.01).There was a significant difference in the expression levels Treg cells and IL-10 among Child-Pugh score grade A，B，and C group(P＜0.05)，the levels of which in grade B were significantly lower and higher than those in grade A and B(P＜0.05)，respectively.The ratio of Treg cells and expression of IL-10 were not significant between patients with hepatitis B virus and hepatitis C virus cirrhosis(P＞0.05).Conclusion The number of Treg cells and expression of IL-10 in PMBC of viral liver cirrhosis were decreased.It’s suggested that Treg cells and IL-10 might play a major role of in the pathogenesis and progress of liver cirrhosis，which could provide a new approach to the treatment.

∶Viral liver cirrhosis；Treg cells；IL-10

R446.62，R657.3+1

A

1674-1129(2017)04-0492-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.012

2016-12-06；

2017-06-10)

周志敏，女，1975年生，學士學位，本科，副主任技師，檢驗醫(yī)學，微生物及免疫學檢驗。