長鏈非編碼RNAMIAT在腎透明細胞癌中的表達情況和預后意義

鄭灶松 陳海城 謝文練*

長鏈非編碼RNAMIAT在腎透明細胞癌中的表達情況和預后意義

鄭灶松 陳海城 謝文練*

目的探討長鏈非編碼RNA MIAT在腎透明細胞癌中的表達情況及與患者臨床指標的相關性，分析其作為腎透明細胞癌分子標記物的可能性。方法通過熒光定量PCR方法檢測MIAT在40例腎透明細胞癌組織和40例癌旁正常組織中的表達情況，同時結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫分析MIAT表達水平與腎透明細胞癌患者臨床指標和預后的關系。結(jié)果MIAT在腎透明細胞癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，在腎癌細胞系中的表達明顯高于正常腎小管上皮細胞，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TCGA數(shù)據(jù)庫資料分析表明，MIAT表達水平與腎癌患者T分期（P＜0.001）、M分期呈正相關（P＜0.05）。Kaplan?Meier生存分析表明，高表達MIAT的腎癌患者總體生存時間明顯低于低表達MIAT的腎癌患者（Log?rank P＜0.05）。結(jié)論MIAT在腎透明細胞癌組織和腎癌細胞系中高表達，有可能成為腎透明細胞癌的分子標記物。

lncRNA；MIAT；腎透明細胞癌；預后

腎癌發(fā)病率在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中居第3位，占腎惡性腫瘤的80%～90%，約17%的腎癌患者在診斷時便已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，約30%的患者術(shù)后出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移［1?3］。由于腎癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，容易被患者和醫(yī)生忽略，研究腎癌的分子標記物，對該疾病的早期診斷和預后評估具有重要作用。研究證明，長鏈非編碼RNA在腎癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中表達異常［4］。lncRNAs通過對靶基因或信號通路的調(diào)控，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中行使著重要的癌基因或抑癌基因的功能［5］。H19是第一個被發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關的lncRNA，它在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤中異常表達，參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡等生物學過程［6，7］。MEG3是第一個被發(fā)現(xiàn)具有抑制腫瘤功能的lncRNA，其通過調(diào)控p53的表達，抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和促進細胞的凋亡［8］。

但大部分lncRNAs在人類腫瘤中的功能和作用機制仍未完全明了，在腎癌中的研究亦非常有限。本研究探討lncRNA MIAT在腎透明細胞癌組織中的表達情況及與腎癌患者臨床指標的相關性，希望能為腎癌早期診斷和預后提供新指標，為腎癌治療提供新靶點。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本文收集2012～2016年于中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院泌尿外科行腎癌根治性手術(shù)，病理診斷確診為腎透明細胞癌的40例患者的腎癌標本。術(shù)前均無進行放、化療。所有病例均征得患者同意并簽署相關同意書。本研究由中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 取材手術(shù)后立即收集腎癌組織和癌旁正常組織。新鮮標本取下后立即放入液氮中，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄采用液氮研磨法研磨腎癌組織，Trizol法提取組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA（500/濃度）μL，RT?Primer Mix 2μL，DEPC水（8～500/濃度）μL。逆轉(zhuǎn)錄步驟為：37℃15min，85℃5 s。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司。

1.2.3 熒光定量PCR將逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA模板溶解10倍用于熒光定量PCR。熒光定量PCR反應體系為：cDNA模板2μL，上下游引物各0.52 μL，ddH2O 2μL，SYBR Green IMaster 5μL。熒光定量PCR反應步驟：95℃15 s，56℃15 s，72℃15 s，共40個循環(huán)。采用瓊脂糖凝膠電泳及溶解曲線鑒定熒光定量PCR產(chǎn)物，ΔCt=目的基因Ct?內(nèi)參基因Ct。PCR引物由上海捷瑞公司合成，并選擇β?actin作為內(nèi)參。熒光定量PCR試劑盒購自羅氏公司。MIAT上游引物為GCTCACACCTCCTAT TCCT，下游引物為CTTCACCAACTCTCCCACT。β?actin上游引物為AGCCTCGCCTTTGCCGATCC，下游引物為ACATGCCGGAGCCGTTGTCG。

1.2.4 TCGA數(shù)據(jù)庫分析利用TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//gdc?portal.nci.nih.gov/）下載并處理448例腎癌和67例癌旁組織RNAseq數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用單因素方差分析和t檢驗。生存分析采用Kaplan?Meier法及l(fā)og?rank檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNAMIAT在腎透明細胞癌組織中明顯高表達

本研究提取40對腎透明細胞癌組織和癌旁正常組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，MIAT在腎透明細胞癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05，圖1）。

圖1 M IAT在腎透明細胞癌組織中的表達情況

2.2 lncRNAMIAT在腎癌細胞系中明顯高表達

我們檢測MIAT在腎癌細胞系（Caki?1、Caki?2、786?O、ACHN、769?P、A?498）和正常腎小管上皮細胞HK?2中的表達情況，結(jié)果表明，MIAT在腎癌細胞系中的表達明顯高于正常腎小管上皮細胞（P＜0.05，圖2）。

2.3 lncRNAMIAT表達水平與腎癌患者預后的相關性

我們進一步在TCGA數(shù)據(jù)庫中驗證MIAT在腎癌組織中的表達情況，結(jié)果表明，MIAT在腎透明細胞癌組織中的表達明顯高于正常組織。我們統(tǒng)計分析MIAT表達水平與腎癌患者臨床指標的關系，發(fā)現(xiàn)MIAT表達水平與患者T分期（P＜0.001）、M分期呈正相關（P=0.03）（表1）。我們通過Kaplan?Meier法分析MIAT表達水平與腎癌患者總體生存時間的關系，結(jié)果表明，高表達MIAT的腎癌患者總體生存時間明顯低于低表達MIAT的腎癌患者（Log?rank P＜0.05）。

圖2 M IAT在腎癌細胞系和腎小管上皮細胞中的表達水平

表1 M IAT表達水平與腎癌患者臨床指標的相關性

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析M IAT在腎癌組織中的表達水平及預后關系A MIAT在腎癌組織和正常腎組織中的表達情況；BKaplan?Meier分析MIAT表達水平與腎癌患者預后的關系

3 討論

研究表明，長鏈非編碼RNA在多種腫瘤中異常表達，參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，是腫瘤潛在的腫瘤標記物和治療靶點。HOTAIR在乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌中高表達，通過與PCR2的相關作用促進H3K27甲基化，進而促進腫瘤細胞增殖和侵襲［9］。PVT?1在結(jié)直腸癌中該表達，通過TGF?β信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌細胞浸潤與轉(zhuǎn)移［10］。目前泌尿系統(tǒng)長鏈非編碼RNA的研究主要集中在膀胱癌和前列腺癌，而在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制研究相對較少。

MIAT是位于22號染色體長臂的長鏈非編碼RNA。近年來的研究表明，MIAT在多種疾病進程中發(fā)揮重要作用。Zhou等人研究發(fā)現(xiàn)，MIAT通過影響Nrf2表達，調(diào)控高糖介導的腎小管上皮損傷［11］。Shen等人研究發(fā)現(xiàn)，沉默MIAT表達能抑制TNF?α誘導的人晶狀體上皮細胞增殖、遷移。機制研究也表明MIAT通過內(nèi)源競爭性RNA的形式，并與AKT和miR?150?5p形成環(huán)路，從而調(diào)控人晶狀體上皮細胞［12］。目前尚未見MIAT在腎癌組織中表達水平和臨床意義的研究。因此，本研究收集手術(shù)切除的腎癌組織和癌旁正常組織，通過熒光定量PCR檢測MIAT的表達情況。結(jié)果表明，MIAT在腎透明細胞癌組織中表達明顯高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義。進一步利用TCGA數(shù)據(jù)庫的臨床資料，通過Kaplan?Meier分析發(fā)現(xiàn)，高表達MIAT的腎癌患者總體生存時間明顯低于低表達MIAT的腎癌患者。因此，可以認為MIAT對判斷腎癌患者預后具有一定的臨床意義。

綜上所述，我們的研究表明腎透明細胞癌組織中MIAT的表達明顯高于癌旁正常組織。高表達MIAT的腎癌患者總體生存時間明顯低于低表達MIAT的腎癌患者。因此，MIAT有望成為腎癌早期診斷和評估預后的標記物。

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The expression and prognostic significance of lncRNA M IAT in clear cell renal cell carcinoma

ZHENG Zaosong，CHEN Haicheng，XIE Wenlian.
Department of Urology，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou，510289.Corresponding author：XIEWenlian，wenlianxie@ 126.com

Objective To explore the expression and prognostic significance of lncRNA MIAT in clear cell renal cell carcinoma，and evaluate its possibility to be a biomarker of clear cell renal cell carcinoma.Methods The expression ofMIAT in clear cell renal cell carcinoma and normal tissueswere detected by qRT?PCR.The clinical significance and prognostic value of MIAT in clear cell renal cell carcinoma was analyzed using TCGA data.Results The expression of MIAT in clear cell renal cell carcinoma tissueswas significantly higher than in normal tissues.The expression ofMIAT in renal cancer cellswas significantly higher than in HK?2.The expression ofMIATwas positively associated with T stage（P＜0.001）and M stage（P=0.03）.Meanwhile，patients with higher MIAT expression had a shorter survival time than patientswith lower MIAT expression.Conclusion LncRNA MIATwas overexpressed in clear cell renal cell carcinoma tissues and renal cancer cells，and might be a biomarker for clear cell renal cellcarcinoma.

lncRNA；MIAT；clear cell renal cell carcinoma；prognosis

R737.11

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.04.003

2017-06-25）

國自然科學基金（81672534）

510289廣州中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院泌尿外科

*通訊作者：謝文練，Email：wenlianxie@126.com