玉屏風(fēng)多糖體外抗新城疫病毒效果的研究

戴超月 ， 蔣焱平 ， 郭 彥 ， 劉雨桐 ， 楊 鴻 ， 計(jì)慧琴 ， 鄧 樺

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系, 廣東佛山528231)

玉屏風(fēng)多糖體外抗新城疫病毒效果的研究

戴超月 ， 蔣焱平 ， 郭 彥 ， 劉雨桐 ， 楊 鴻 ， 計(jì)慧琴 ， 鄧 樺

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系, 廣東佛山528231)

以新城疫病毒(NDV)感染雞胚和雞胚成纖維細(xì)胞，探索玉屏風(fēng)多糖(Yupingfeng polysaccharides YPF-P)及其含藥血清的抗病毒效果。SPF兔采用500 mg/kg體重YPF-P灌服給藥，于第1、3、5、7天采集全血，制備不同濃度含藥血清；培養(yǎng)SPF雞成纖維細(xì)胞(CEF)，分別加入不同濃度的YPF-P及其含藥血清，進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)；采用先加多糖后加病毒、先加病毒后加多糖、多糖和病毒感作后同時(shí)加入的3種給藥方式，觀察YPF-P及其含藥血清對(duì)病毒的阻斷、抑制和直接殺滅作用。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，不同濃度YPF-P(0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL)和7 d的YPF-P含藥血清的CEF細(xì)胞活性均顯著增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)。CEF培養(yǎng)24 h后，YPF-P抑制病毒作用明顯，與NDV對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；3種給藥方式與NDV對(duì)照組相比，含藥血清組細(xì)胞活性均極顯著升高(P<0.01)。表明YPF-P及其含藥血清均對(duì)CEF無(wú)毒副作用，且可顯著增強(qiáng)細(xì)胞活性；YPF-P及其含藥血清有較好的抑制病毒毒性的作用。

玉屏風(fēng)多糖 ； 含藥血清 ； 細(xì)胞活力 ； 抗病毒

多糖類藥物具有治療功能全面，覆蓋面廣泛的優(yōu)勢(shì)，所產(chǎn)生的毒害性作用小，有害殘留少[1]。據(jù)相關(guān)研究表明，YPF-P能促使人與動(dòng)物胸腺、脾臟等免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，提高各種疫苗的接種效果以及延遲抗體的持續(xù)時(shí)間，可免疫調(diào)節(jié)功能，并促進(jìn)機(jī)體免疫球蛋白的形成[2-3]。YPF-P還能有效提高佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的T細(xì)胞亞群數(shù)，顯著促進(jìn)小鼠腹腔的巨噬細(xì)胞吞噬功能、脾淋巴細(xì)胞增殖、相關(guān)遲發(fā)型超敏反應(yīng)以及溶血素抗體生成等[4-5]。但是，目前YPF-P體外抗病毒的研究尚不多見。本文提純YPF-P，制備不同濃度的YPF-P及其含藥血清，以NDV感染雞胚和雞胚成纖維細(xì)胞探索YPF-P及其含藥血清的體外抗病毒效果，為中藥多糖含藥血清的臨床應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 制備YPF-P 將藥粉黃芪、防風(fēng)和白術(shù)按質(zhì)量比3∶1∶1配制成的玉屏風(fēng)散，置于1 L的圓底燒瓶中，通過水提取，過濾加熱濃縮，醇提純，最后經(jīng)過真空冷凍干燥機(jī)在低溫下制成粉末狀的精制YPF-P，分裝后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 制備YPF-P含藥血清 12只SPF新西蘭兔隨機(jī)分2組，給藥組灌胃YPF-P 500 mg/kg體重·d;對(duì)照組灌服等體積的生理鹽水；1次/d，共7 d，最后1次給藥1 h 后心臟采血，37 ℃靜置1 h后放4 ℃冰箱過夜，5 000 r/min 離心5 min，取血清同組合并后，56 ℃ 滅活30 min，0.22 μm 濾過除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ND病毒的檢測(cè)

1.3.1 ND病毒復(fù)壯 9日齡的SPF雞胚15只，每只注射0.2 mL新城疫原胚液，37 ℃恒溫箱中孵育，間隔12 h檢查1次，收集24～72 h死亡雞胚的尿囊液，0.22 μm過濾，-80 ℃保存。

1.3.2 NDV半數(shù)致死量 準(zhǔn)備11個(gè)10 mL EP管，在第1管中加入1 mL的已復(fù)壯的胚液，2～11管用移液槍各加入0.9 mL生理鹽水，用100 μL移液槍從第1管吸取出0.1 mL試液轉(zhuǎn)移到第2管(移液槍在第2管時(shí)反復(fù)吹打幾次，混合試液)，從第2管中吸取出0.1 mL到第3管，重復(fù)上述步驟直到第11管，最后除去0.1 mL試液。濃度分別為1∶1、1∶10～1∶1010。將SPF雞胚分成11組，每組6個(gè)，接種病毒液2 mL/只,72 h后，檢查并記錄雞胚死亡數(shù)量，計(jì)算NDV雞胚半數(shù)致死量。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.4.1 CEF原代培養(yǎng) 9日齡的SPF胚蛋，通過取材、剪材、消化、制備CEF細(xì)胞懸液、加入10%胎牛血清，置于37 ℃、飽和濕度的5 %CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4.2 YPF-P及其含藥血清細(xì)胞活性檢驗(yàn) 雞胚成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)12 h后，按照表1、表2加入不同濃度的YPF-P及其含藥血清，除空白對(duì)照組仍然加入10%的胎牛血清外，為盡量減少胎牛血清對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾，其余各試驗(yàn)組均加入2%胎牛血清維持細(xì)胞生長(zhǎng)。采用MTT法檢測(cè)，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上比色(波長(zhǎng)490 nm)。以觀察YPF-P及其含藥血清對(duì)CEF的影響，并篩選出最佳作用劑量。

表1 YPF-P細(xì)胞活性檢驗(yàn)的給藥劑量及分組 (n=16, mg/mL)

表2 YPF-P含藥血清細(xì)胞活性檢驗(yàn)的給藥劑量及分組 (n=16, mg/mL)

1.4.3 YPF-P及其含藥血清體外抗NDV研究 根據(jù)1.4.2結(jié)果，選擇YPF-P及其含藥血清的最佳作用劑量，以3種不同加藥方式研究其抗病毒效果，具體分組見表3。

表3 YPF-P及其含藥血清體外抗NDV的試驗(yàn)分組 (n=16)

2 結(jié)果

2.1 ND病毒的檢測(cè)結(jié)果 11組雞胚，在72 h內(nèi)均有不同程度的死亡。其中將病毒1∶107倍稀釋時(shí)，接種雞胚(0.2 mL/個(gè))首先可使50%雞胚死亡，因此確定NDV半數(shù)致死濃度為1∶107。

2.2 YPF-P及其含藥血清對(duì)CEF活性的影響

2.2.1 YPF-P對(duì)CEF活性的影響 YPF-P提純率為88.9%。不同濃度的YPF-P(0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL)之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，與正常對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，雞胚成纖維細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)。見圖1。

圖1 不同YPF-P劑量對(duì)CEF活性的影響注：大寫字母不同者表示P<0.01

2.2.2 YPF-P含藥血清對(duì)CEF活性的影響 結(jié)果可見，不同劑量的含藥血清組之間，細(xì)胞活性差異極顯著(P<0.01)，但第7 天含藥血清組與胎牛血清組之間無(wú)差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 不同天數(shù)含藥血清對(duì)CEF活性的影響注：大寫字母不同者表示P<0.01

2.3 YPF-P及其含藥血清體外抗NDV研究

2.3.1 YPF-P體外抗NDV結(jié)果 由圖3可見，陽(yáng)性YPF-P對(duì)照組細(xì)胞活性最高，陰性ND病毒對(duì)照組、殺滅作用組和阻斷作用組細(xì)胞活性最低。經(jīng)方差分析，正常胎牛血清對(duì)照組細(xì)胞活性與殺滅作用組、阻斷作用組和陰性對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。3種加樣方式之間差異極顯著(P<0.01)，且抑制作用組細(xì)胞活性顯著高于殺滅作用組、阻斷作用組。陰性對(duì)照組與殺滅作用組、阻斷作用組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明多糖對(duì)病毒沒有殺滅和阻斷作用。陽(yáng)性YPF-P對(duì)照組與其他各組之間差異極顯著(P<0.01)，細(xì)胞活性最高，且顯著高于正常對(duì)照組。

圖3 YPF-P體外抗NDV對(duì)細(xì)胞活力的影響注：大寫字母不同者表示P<0.01

2.3.2 YPF-P含藥血清體外抗NDV結(jié)果 由圖4可見，陽(yáng)性YPF-P含藥血清組細(xì)胞活性最高，與正常對(duì)照組差異顯著(P<0.01或P<0.05)，與其他各組差異極顯著(P<0.01)。陰性對(duì)照組、殺滅作用組、阻斷作用組的細(xì)胞活性最低。正常胎牛血清組細(xì)胞活性與殺滅、抑制、阻斷、陰性組相比，差異極顯著(P<0.01)，陰性對(duì)照組與殺滅作用組、阻斷作用組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明YPF-P含藥血清對(duì)病毒沒有殺滅和阻斷作用。3種加樣方式之間抑制作用組細(xì)胞活性顯著高于殺滅、阻斷作用組，差異極顯著(P<0.01)。

圖4 YPF-P含藥血清體外抗NDV對(duì)細(xì)胞活力的影響注：圖中小寫字母不同者表示P<0.05; 大寫字母不同者表示P<0.01

3 討論

3.1 YPF-P及其含藥血清的細(xì)胞活性試驗(yàn) 從圖1中可知，不同濃度的YPF-P試驗(yàn)組的細(xì)胞活性均比胎牛血清對(duì)照組的細(xì)胞活性高，各試驗(yàn)組之間的細(xì)胞活性差異不顯著，隨著YPF-P濃度增加，細(xì)胞活性并沒有規(guī)律性升高或降低，表明YPF-P雖然對(duì)細(xì)胞活性有顯著提高作用，但是并不隨多糖濃度劑量的變化而提高或降低。

從圖2中可知，不同劑量的含藥血清組之間，細(xì)胞活性隨著濃度的增加而升高，第7 天的含藥血清組的細(xì)胞活性與胎牛血清組之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明高濃度含藥血清對(duì)CEF無(wú)明顯毒副作用。

3.2 YPF-P及其含藥血清體外抗NDV效果 在YPF-P試驗(yàn)中，結(jié)果提示感染初期病毒毒力較強(qiáng)，YPF-P僅對(duì)病毒有一定抑制作用，無(wú)明顯的殺滅、阻斷作用。YPF-P可能與細(xì)胞膜表面的病毒吸附蛋白受體結(jié)合[6]，并且在一定程度上阻止病毒的吸附和進(jìn)入。

CEF繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，YPF-P對(duì)病毒有明顯的抑制作用，但是殺滅和阻斷作用不明顯。說(shuō)明其抗病毒作用主要是通過與細(xì)胞膜表面的病毒吸附蛋白受體結(jié)合或改變病毒吸附蛋白受體來(lái)保護(hù)細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的，而并非直接殺滅病毒，而病毒一旦侵入并破壞細(xì)胞后，多糖亦不能提高細(xì)胞的抗感染能力。

在YPF-P含藥血清3種加樣方式試驗(yàn)中，培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)YPF-P含藥血清對(duì)ND病毒也無(wú)明顯的殺滅和阻斷作用，確有極顯著的抑制作用。陽(yáng)性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，YPF-P含藥血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用。

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，YPF-P及其含藥血清均對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，均可顯著增強(qiáng)細(xì)胞活性；YPF-P能夠阻斷NDV的吸附和進(jìn)入，對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞有較好的保護(hù)作用；YPF-P含藥血清不但可阻斷NDV對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的吸附和侵入，還可較好的抑制病毒的毒性。

[1] 張曉霜，王妙妙，辛萌，等.褐藻多糖抗病毒作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)海洋藥物,2016,35(2):87-94.

[2] 鄧樺，楊鴻，張兆，等.玉屏風(fēng)復(fù)合多糖對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的恢復(fù)作用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34(2)：288-292.

[3] 鄧樺，楊鴻，仝錫瑤，等.玉屏風(fēng)多糖對(duì)免疫抑制小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2016,52(2)：56-58.

[4] 陳瑩瑛. 玉屏風(fēng)多糖對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠T細(xì)胞亞群的影響[D]. 合肥：安徽醫(yī)科大學(xué), 2009.

[5] 楊鴻，陳杖榴，鄧樺，等. 玉屏風(fēng)多糖對(duì)免疫低下小鼠血清IL-2和IFN-γ含量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(12)：3 571-3 572.[6] 楊鴻，陳杖榴，鄧樺，等.加味玉屏風(fēng)散對(duì)雞紅細(xì)胞免疫和自由基的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006,36(01)：70-73.

[7] 陳向濤，李俊.玉屏風(fēng)散的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2003,7(4):241.

[8] Jiang B, Zhang H, Liu C,etal. Extraction of water-soluble polysaccharide and the antioxidant activity from Ginkgo biloba leaves[J]. Medicinal Chemistry Research, 2010, 19(3):262-270.

[9] Li Q,Li C,Yang C,etal.Preparation,characterization and antioxidant activities of poly mannuronic acid phos-phate,H-phosphonate and sulfate[J].Int J BiolMacro-mol,2013,62:281-286.

Study the antiviral effect of Yupingfeng Polysaccharides on Vitro

DAI Chao-yue ， JIANG Yan-ping , GUO Yan ， LIU Yu-tong ，YANG Hong ， JI Hui-qin ， DENG Hua

(Department of Veterinary Medicine,Foshan University, Foshan 528231,China)

To explore the antiviral effect of YPF-P and drug-containing serum-on chicken embryo and CEF infected by NDV. SPF rabbits was drenched with YPF-P (500 mg/kg), the blood sample were collect at 1,3,5,7 days, and the different concentrations of medicated sera were prepared. To do cell toxicity experiments the SPF chicken fibroblasts were cultivated with different concentrations of YPF-P and drug-containing serum. For three ways to medicine the virus was first added，the virus was added before adding polysaccharide or the mixed of polysaccharide and virus was added. Then we observed the effect of YPF-P and drug-containing serum on blocking, killing and restraining virus effect.Compared with normal control group, different concentrations of YPF-P (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 mg/mL) and YPF-P drug-containing serum (7 d) of CEF activity were enhanced significantly(P<0.05 orP<0.01).After 24 h, compared to NDV control group,YPF-P inhibits the virus extremely significant (P<0.01);three ways of medicine compared with NDV control group, cell activity of drug-containing serum groups were increased significantly(P<0.01). YPF-P and drug-containing serum were non-toxic on CEF, and can enhance cell activity significantly ;YPF-P and drug-containing serum has good inhibition of the toxic effects of the virus.

YPF-P ; CEF ; NDV ; YPF-P drug-containing serum ; cell activity

DENG Hua

2016-09-14

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A020210140);國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201411847008)

戴超月(1992-)，男，碩士生，主要從事分子病理學(xué)研究，E-mail: 13434818703@163.com

鄧樺，E-mail: denghuatt@163.com

S852.65+9.5

A

0529-6005(2017)07-0030-03