乳香提取物對兩種牙周致病菌體外抑菌作用的研究

張冬雪程成王蕾王吉天姜彤林梅王左敏

乳香提取物對兩種牙周致病菌體外抑菌作用的研究

張冬雪程成王蕾王吉天姜彤林梅王左敏

目的：研究乳香提取物(Extract of Boswellin)對兩種常見牙周致病菌的抑菌性，比較乳香提取物及0.2%Gel Gingival hyaluronic acid(GHA)凝膠兩種藥物對牙周致病菌抑菌性的差異。方法：采用試管二倍稀釋法測定乳香提取物對牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、具核梭菌(Fusobacterium nucleatum Fn)的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)后，用平皿培養(yǎng)法測定兩種細菌的最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration,MBC)。采用紙片法分別測定質量分數為10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%的乳香提取物及GHA凝膠對以上2種細菌的抑菌環(huán)直徑，觀察隨著質量分數增加抑菌環(huán)直徑的變化；比較兩種藥物對同一細菌的抑菌性差異，同一濃度的乳香水提取物對2種細菌的抑菌性的差異。結果：乳香提取物對Pg、Fn的MIC分別為0.325%，乳香提取物對Pg的MBC為0.325%，對Fn的MBC為2.5%。隨著質量分數增加，抑菌環(huán)直徑均增大，5%的抑菌環(huán)直徑最大；同一質量分數的乳香提取物溶液對2種細菌的抑菌環(huán)直徑不同，差異具有統(tǒng)計學意義；與0.2%GHA凝膠相比，10%乳香提取物的抑菌環(huán)直徑大，差異具有統(tǒng)計學意義。結論：乳香提取物對2種牙周致病菌均具有一定的抑制作用，對Pg的抑菌作用強于Fn，且5%的乳香提取物對2種牙周致病菌的抑菌性最佳，抑菌作用強于0.2%GHA凝膠。

乳香提取物；抑菌實驗；牙周致病菌

慢性牙周炎是細菌感染引起的，牙周支持組織的慢性感染性疾病，其發(fā)生發(fā)展與牙菌斑和牙結石在牙齒表面的附著密切相關。如何有效控制菌斑的形成，對牙周病的預防和控制具有重要的意義。除了機械性去除菌斑外，因局部用藥具有在病變部位濃度高、藥效好、可減輕全身用藥的不良反應等優(yōu)點，是牙周病用藥的主要方式。因此找到抑菌效果好、作用持久、不易產生耐藥性、不良反應小、價格低廉的局部藥物，對治療牙周炎具有重要意義[1]。乳香為橄欖科植物卡氏乳香樹(Boswellia carteriibirdw)的膠狀樹脂，能活血行氣、通經止痛、消腫生肌。主要化學成分為樹脂60%-70%，樹膠27%-35%，揮發(fā)油3%-8%。已經有很多研究報道表明乳香提取物具有抗氧化作用、能夠抑制腫瘤細胞生長、抑制炎癥反應、抑制肺纖維化、抗輻射、改善腦功能、刺激成纖維細胞等作用[2]，但對于牙周疾病的研究卻很少。國外學者發(fā)現(xiàn)乳香提取物對菌斑性齦炎具有輔助治療作用。本實驗研究不同質量分數的乳香提取物對牙周致病菌的抑制作用，為制備防治牙周病藥物提供理論依據。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種牙齦卟啉單胞菌(Porhpyromonas gingivalis,Pg)ATCC33277，具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum Fn)ATCC 25586，以上菌種均由首都醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)學研究所提供。

1.1.2 乳香提取物凝膠橄欖科植物乳香樹及其同屬植物樹皮深處的樹脂提取的產物(由首都醫(yī)科大學附屬中藥研究所提供)；透明質酸鈉凝膠0.2% Gel Gingival hyaluronic acid，由Ricerfarma SRL公司(意大利)提供[4]。

1.1.3 實驗樣本制備將10%乳香提取物用滅菌注射用水和厭氧液體培養(yǎng)基二倍稀釋制成為質量分數為5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%的乳香提取物溶液各一份。

1.1.4 培養(yǎng)基CDC培養(yǎng)基及厭氧液體培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)無菌環(huán)接種，取2種細菌的凍干粉少許分別溶于生理鹽水中混勻，接種于CDC培養(yǎng)基7天，取Pg和Fn的2-3個菌落接種于液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h后，用生理鹽水稀釋，比濁在0.5個麥氏單位，此時菌液的濃度為1.5*108CFU/ml。

1.2.2 試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)取試管6支，按照1-6編號，1號管內加入3g的乳香提取物凝膠(質量分數10%)，加入等質量液體培養(yǎng)基的3ml稀釋，此時5%乳香溶液4.8ml，滅菌。2-6號管內各加入液體培養(yǎng)基2.4ml。經倍比稀釋后1-6號管中的乳香提取物的質量分數依次為5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%及0.15625%。另取14支試管，按照藥物濃度編號(001-014)，每2支試管同一濃度，連續(xù)編號，分別取1ml乳香溶液，每只試管中加入0.01ml菌液，搖勻，其中最后兩只試管分別為生理鹽水空白對照(013)和液體培養(yǎng)基陰性對照(014)。37℃厭氧箱培養(yǎng)48h后觀察試管中菌液渾濁情況，以抑制細菌生長的所含量最低乳香提取物濃度為MIC。將CDC培養(yǎng)基均分，分別接種相同藥物濃度的兩種菌液各0.01ml，三線法涂布均勻，培養(yǎng)48h，觀察2種細菌的生長情況，以無細菌生長的最低乳香提取物濃度為MBC。本實驗重復2次。

1.2.3 紙片法測量抑菌環(huán)直徑菌液即配即用。按照上述菌種復蘇培養(yǎng)的方法將Pg、Fn的菌液比濁在0.5個麥氏單位。用移液槍吸取2種細菌的菌液0.1ml至整個CDC固體培養(yǎng)基中心，用L型涂菌棒涂布均勻：(1)無菌鑷子鑷取無菌圓形濾紙片，直徑為6mm，分別浸入質量分數為5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%及0.15625%已滅菌的乳香提取物溶液30min后，將濾紙片貼于六等分的CDC培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)皿至于37℃厭氧培養(yǎng)箱，48h后用游標卡尺測量抑菌環(huán)(包含濾紙片的直徑)。實驗重復6次。(2)將無菌圓形濾紙片分別浸入質量分數為10%的乳香提取物凝膠、0.2%GHA凝膠及生理鹽水30min后，將濾紙片帖于3等分的CDC培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)皿至于37℃厭氧培養(yǎng)箱，48h后用游標卡尺測量抑菌環(huán)(包含濾紙片的直徑)。實驗重復6次。

1.3 統(tǒng)計學方法將測得的抑菌環(huán)直徑用(x±s)的形式表示。用spss統(tǒng)計軟件進行數據。采用ANONA分析比較10%乳香提取物凝膠和0.2% GHA凝膠的抑菌環(huán)直徑；組間總體比較采用單因素方差分析，比較不同質量分數的藥物抑菌作用差異以及同一質量分數的乳香提取物溶液對2種細菌的抑菌性差異；組間比較采用LSD法。以雙側P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 試管二倍稀釋法進行藥物抑菌后培養(yǎng)細菌，用肉眼比濁法觀察，與液體培養(yǎng)基和生理鹽水相比，當乳香提取物質量分數為0.15625%時，液體培養(yǎng)基渾濁，測定MIC的結果：乳香提取物溶液對Pg和Fn的MIC均0.325%(圖1)。

圖1 從左到右液體培養(yǎng)基、生理鹽水對照、0.15625%Fn和0.15625%Pg

2.2 當乳香提取物質量分數為0.15625%時，CDC培養(yǎng)基有Pg生長；當質量分數為1.25%時，CDC培養(yǎng)基有Fn生長，由此得出平皿培養(yǎng)法測定MBC的結果：乳香提取物對Pg和Fn的MBC分別為0.325%和2.5%(見圖2-圖5)。

圖20 .15625%Pg

圖30 .3125%Pg

圖41 .25%Fn

圖52 .5%Fn

2.3 試紙片法測得的抑菌環(huán)直徑結果見表1，表2。

乳香提取物溶液抑菌環(huán)直徑與質量分數的關系見表1。藥物抑菌環(huán)直徑隨質量分數的變化而變化。其中5%質量分數的抑菌環(huán)直徑最大。2種細菌的抑菌環(huán)直徑在6個質量分數組間比較，差異具有統(tǒng)計(P＜0.05)。結果顯示乳香提取物對2種細菌的抑菌性從強到弱Pg＞Fn。

表1 不同質量分數乳香提取物對2種細菌的作用(x±s)

5%乳香提取物凝膠、0.2%GHA凝膠及生理鹽水抑菌環(huán)直徑比較見表2。

表2 乳香提取物、及生理鹽水GHA凝膠對2種細菌的作用(x±s)

3.討論

牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌被認為是齦下菌斑中主要的可疑致病微生物。并且，這兩種細菌是最常見的建立牙周炎動物模型的致病菌，與慢性牙周炎的關系密切。本實驗中所選用的兩種細菌是其中具有代表性牙周致病菌，Pg為革蘭氏陰性專性厭氧菌，是慢性牙周炎病變區(qū)域或活動部位最主要的優(yōu)勢菌[3,6]，體外實驗表明Pg可粘附于牙周袋上皮，凝集人紅細胞，產生較多蛋白水解酶，將蛋白質降解成短鏈，同時產生大量的內毒素和膠原酶等，從而破壞牙周組織。Fn是介導定植于生物膜上的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌相互作用的中心物種，它被認為是牙齒和上皮表面與病原體之間的媒介，F(xiàn)n可與多種致病菌共聚協(xié)同，產生大量毒素及水解酶，造成牙周支持組織破壞，并且，F(xiàn)n可使甲硝唑失去抗菌作用，從而促進伴隨Pg的粘附和生長[6,7]。

慢性牙周炎是由菌斑引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，因細菌易產生抗藥性，所以生物膜感染難以治療，有研究結果表明，乳香提取物可以有效抑制多種炎癥性疾病的細菌生物膜的形成，并且抑制脂氧合酶的作用從而達到抑制腫瘤細胞和誘導細胞凋亡。乳香酸是乳香提取物的重要組成部分，Acetyl-11-keto-boswellic acid(AKBA)和其他的乙酸酯，AKBA是乳香提取物中最活躍的部分，通過5-脂氧合酶途徑的選擇性非氧化抑制劑。有大量的臨床試驗證明了，乳香提取物可用于治療炎癥性疾病，如癌癥、關節(jié)炎、慢性腸炎、潰瘍性腸炎、Crohn病、支氣管哮喘及口腔潰瘍[8-10]。通過乳香提取物對體外培養(yǎng)牙周致病菌抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，乳香提取物對牙周致病菌Pg具有明顯的抑菌性，MIC為0.325%，MBC為0.325%，說明極低的藥物濃度對慢性牙周炎的主要致病菌Pg，具有抑制細菌生長并殺死細菌的能力。Fn可聚集協(xié)同多種細菌最終形成菌斑，實驗結果發(fā)現(xiàn)，乳香提取物對Fn的MIC為0.325%，MBC為8倍的MIC 2.5%，說明藥物對Fn也具有抑制作用，且未產生耐藥性。本實驗通過測量抑菌環(huán)直徑發(fā)現(xiàn)，隨著質量分數的增加5%乳香提取物對兩種牙周致病菌的抑菌環(huán)直徑最大，并且相同藥物濃度，Pg的抑菌環(huán)直徑明顯大于Fn,差異具有統(tǒng)計學意義，由此我們可以得出乳香提取物對Pg的抑菌作用強于Fn。乳香具有明顯的抗炎作用和抗菌效果，成本低，可用性高，我們的實驗結果證明了乳香提取物對牙周致病菌有較好的抑菌性，這與國外的大部分乳香提取物的抑菌實驗結果一致[11，12]，為乳香提取物對牙周致病菌革蘭氏陰性菌的抑菌作用研究提供了理論基礎。

乳香提取物可能替代口腔局部應用的抗生素，有效抑制牙周致病菌的生長，對慢性牙周炎等多種牙周疾病的治療可能具有良好的輔助作用。今后我們將對乳香提取物進行深入研究,使其在牙周病的防治中發(fā)揮作用。

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Bacteriostasis effect of extract of boswellin on two kinds of periodontal pathogens in vitro

ZHANG Dong-xue,CHENG Cheng,WANG Lei,WANG Ji-tian,JIANG Tong,LIN Mei,WANG Zuo-min(Institution: Beijing ChaoYang Hospital affiliated with Capital Medical University,Deparment of Stomatology,Beijing 100020,China)

Objective:To determine the bacteriostasis effects of Extract of Boswellin on two kinds of periodontal pathogens.Methods:Dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration of extract of Boswellin for Porphyromonas gingivalis(Pg),Fusobacterium nucleatum(Fn).The antimicrobial characters of Extract of Boswellin and 0.2%Gel Gingival hyaluronic acid on the two kinds of pathogens were evaluated by disk diffusion method.Results:The MIC of Boswellin extract on Pg and Fn was 0.325%,and the MBC of Boswellin extract was 0.325%for Pg,and MBC for Fn was 2.5%.Extract of Boswellin showed different antimicrobial effects on the two periodontal pathogens(Pg＞Fn).The best antimicrobial concentration of Extract of Boswellin were 5%. The antimicrobial effect of 10%Extract of Boswellin was better than that of GHA on Pg(P＜0.05).Conclusions:Extract of Boswellin have inhibition effect on Pg and Fn,and the best antibacterial concentration was 5%.The Extract of Boswellin has better antibacterial effect on Pg than Fn.

Extract of Boswellin;Microbial sensitivity tests;periodontal pathogens

R781.4

A

1672-2973(2017)04-0224-04

2017-03-14)

首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院青年科學基金(編號YQ2015-26)

張冬雪首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院口腔科醫(yī)師北京100020

程成北京市核工業(yè)醫(yī)院口腔科醫(yī)師北京100045

王蕾首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院口腔科碩士生北京100020

王吉天首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院口腔科碩士生北京100020

姜彤中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院口腔科副主任醫(yī)師北京100102

林梅首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院口腔科主治醫(yī)師北京100020

王左敏通訊作者首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院口腔科主任醫(yī)師教授北京100020