胃癌多藥耐藥細胞中FOXC1的表達及其意義＊

安艷新，孫力勇，王菁

胃癌多藥耐藥細胞中FOXC1的表達及其意義＊

安艷新，孫力勇，王菁＊

目的探討FOXC1在胃癌耐藥細胞中的表達情況及對胃癌細胞藥物敏感性的影響。方法采用qRT-PCR、Western Blot法檢測胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/ADR、SGC7901/VCR及親本細胞SGC7901中FOXC1的表達；應用siRNA下調(diào)胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/ADR、SGC7901/VCR中FOXC1的表達后以MTT法檢測上述細胞IC50值的變化。結(jié)果FOXC1在胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/ADR、SGC7901/VCR表達顯著高于親本細胞SGC7901，當下調(diào)其表達后，SGC7901/ADR、SGC7901/VCR對多種化療藥物的敏感性顯著升高。結(jié)論FOXC1參與胃癌多藥耐藥過程，但其相關(guān)分子機制有待進一步深入研究。

FOXC1；胃癌；多藥耐藥性

胃癌是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，胃癌的全球病死率位居所有腫瘤第二位，僅次于肺癌［1］。目前，化療是治療進展期胃癌的主要手段之一，對于防治腫瘤的復發(fā)及轉(zhuǎn)移具有重要的意義。然而耐藥尤其是多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）的發(fā)生往往導致化療失敗，同時也是胃癌患者術(shù)后復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移直至病死的重要原因［2，3］。

FOXC1是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子基因家族（FOX）成員之一，其位于人染色體6p25基因編碼區(qū)，具有FOX家族典型的螺旋翼狀保守DNA結(jié)合區(qū)域［4］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1在多種腫瘤中表達升高并且與腫瘤侵襲、TNM分期及預后密切相關(guān)［5-7］。然而有關(guān)FOXC1與胃癌尤其是胃癌耐藥研究相對較少，前期研究中筆者初步發(fā)現(xiàn)FOXC1在胃癌多藥耐藥細胞中表達升高，該研究在前期基礎上進一步研究FOXC1在胃癌多藥耐藥細胞中的表達情況，同時應用siRNA技術(shù)探討FOXC1對胃癌細胞多藥耐藥性的影響。

1 資料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株胃癌細胞株SGC7901及多藥耐藥細胞株SGC7901/ADR、SGC7901/VCR來自西京消化病醫(yī)院腫瘤生物學國家重點實驗室。應用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），按比例加入青鏈霉素，置于含5%CO2的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 試劑RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司；TRIzol、LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒，Takara公司；PCR試劑盒購自廣州復能基因生物有限公司；噻唑藍（MTT）購自Sigma公司；FOXC1單克隆抗體購自Abcam公司。

1.2 RNA提取及PCR檢測Trizol法提取細胞總RNA后依照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒相關(guān)說明進行，冰上操作。步驟：37℃，15min；85℃，5sec，4℃，重復。引物序列：上游5’－AGCATCCGCCACAC CTC－3’，下游5’－GCCTGTCCTTCTCCTCCTT－3’，β－actin作為內(nèi)參均由Takara公司設計合成。取出RNA樣品，依照復能基因逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明計算RNA需要量，采用三步法進行檢測。

1.3 W estern blot檢測提取細胞蛋白并定量。按說明配制12%SDS－PAGE凝膠。上樣后以20mA恒流電泳。電泳結(jié)束后切取目的條帶，準備濾紙和NC膜，于轉(zhuǎn)膜儀中20 V恒壓轉(zhuǎn)膜20min。麗春紅染色后標記分子量，剪取帶有目的蛋白的NC膜置于5%脫脂牛奶中，室溫封閉1 h。用2．5%脫脂牛奶按說明稀釋一抗，最后置于4℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜3次，5min/次，2．5%脫脂牛奶稀釋二抗，室溫孵育1 h。配制顯影液，于BIO－RAD化學發(fā)光成像儀中顯影。

1.4 siRNA設計、轉(zhuǎn)染及檢測FOXC1的siRNA及對照的設計和合成均由上海吉凱基因公司幫助完成。siRNA轉(zhuǎn)染：取無菌Ep管，首先加入1ml OPTI－MEM培養(yǎng)基，然后加入20μl（5μl×4孔）Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，靜置5min。再取4個Ep管，每管加入250μlOPTI－MEM培養(yǎng)基，然后分別加入siRNA1、2、3及對照，標記后室溫靜置5min。靜置完成后每孔加入上述含轉(zhuǎn)染試劑的OPTI－MEM培養(yǎng)基250μl，靜置20min。去除6孔板內(nèi)培養(yǎng)液，無菌PBS漂洗2次，每孔加入1．5ml OPTI－MEM培養(yǎng)基，最后將4個Ep管內(nèi)混合液按上圖加入相應孔內(nèi)，4 h后換常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。RNA提取及PCR檢測，方法同上。

1.5 M TT法檢測細胞藥物敏感性變化將轉(zhuǎn)染siRNA及相應對照的對數(shù)生長期細胞常規(guī)消化、計數(shù)，取8×103個細胞均勻鋪于96孔板中，每組設3個復孔。24 h后將5－FU、VCR及CDDP等藥物依照500μg/ml、250μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml及0．1μg/ml的濃度依次加入細胞中，常規(guī)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μl避光保存的5mg/ml MTT溶液，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出96孔板，小心吸凈孔內(nèi)液體，然后每孔加入150μl DEMO，于ZW－A微量振蕩器上振蕩10min，最后使用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的吸光光度值并計算IC50值。

1.6 統(tǒng)計學分析用SPSS 18．0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXC1在胃癌多藥耐藥細胞中表達顯著升高qRT－PCR和Western Blot結(jié)果均顯示：與親本細胞SGC7901相比，F(xiàn)OXC1在胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/VCR、SGC7901/ADR中表達顯著升高，兩者表達水平差異具有統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 FOXC1表達的PCR和W estern blot結(jié)果

2.2 siRNA可顯著下調(diào)FOXC1在胃癌多藥耐藥細胞中的表達構(gòu)建了3個針對FOXC1的siRNAs并驗證轉(zhuǎn)染效率。qRT－PCR結(jié)果如圖2所示：針對FOXC1的3個siRNAs均可下調(diào)其在胃癌多藥耐藥細胞中的表達，其中第3個siRNA在兩種耐藥細胞中的干擾效果最佳，因此，后續(xù)的干擾實驗均使用該siRNA完成。

圖2 qRT-PCR驗證siRNA的干擾效率

2.3 M TT實驗證實下調(diào)FOXC1表達可顯著增強胃癌多藥耐藥細胞化療敏感性MTT實驗結(jié)果如圖3所示：與對照組相比，應用siRNA下調(diào)FOXC1表達后，兩種胃癌多藥耐藥細胞對3種化療藥物5－Fu、VCR及CDDP的敏感性顯著增強，表現(xiàn)為IC50值顯著降低。

圖3 下調(diào)FOXC1表達可顯著耐藥細胞化療敏感性

3 討論

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一。研究證實，術(shù)后接受化療或術(shù)前先行新輔助化療再進行手術(shù)是當前晚期胃癌病人最主要的治療手段［8］。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，與單一化療藥物相比，聯(lián)合多種化療藥物治療可顯著提高胃癌患者的總生存期并有效改善晚期患者生活質(zhì)量［9］。然而不幸的是，由于多藥耐藥的發(fā)生，最終導致化療失敗，甚至出現(xiàn)無藥可醫(yī)的局面［10］。盡管當前研究發(fā)現(xiàn)眾多腫瘤耐藥相關(guān)分子，但尚未能完全解釋腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象尤其在胃癌領域。因此，深入探討胃癌多藥耐藥機制勢在必行。

該課題組前期通過對胃癌多藥耐藥細胞進行高通量功能篩查，結(jié)果提示，F(xiàn)OXC1可能在胃癌多藥耐藥細胞中表達升高。既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中過程中發(fā)揮重要作用，廣泛參與腫瘤增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等多個生物學過程［4，7，11］，但有關(guān)耐藥方面報道相對較少。該研究在前期基礎之上，從RNA及蛋白兩個層面對FOXC1進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親本細胞相比，F(xiàn)OXC1在胃癌多藥耐藥細胞中表達顯著升高。那么其對胃癌耐藥過程中是否具備功能呢？筆者接著設計了針對FOXC1的3個siRNA，PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第3個siRNA在兩種耐藥細胞中干擾效果最佳。而MTT實驗結(jié)果證實，當下調(diào)FOXC1的表達后，胃癌多藥耐藥細胞對多種化療藥物的敏感性顯著增加，以上結(jié)果與筆者前期實驗結(jié)果也一致，在一定程度上，有理由相信FOXC1參與調(diào)節(jié)胃癌多藥耐藥。

綜上，F(xiàn)OXC1在胃癌多藥耐藥過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，但其相關(guān)分子機制有待進一步研究。同時由于細胞試驗無法完全模擬體內(nèi)疾病環(huán)境，或者有更深層次的細胞生物學作用，這也是實驗不足之處，下一步將在體外實驗基礎上開展動物實驗并將FOXC1的表達情況與胃癌病人臨床病理參數(shù)進行深入分析以明確FOXC1的調(diào)節(jié)作用。

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［2017－02－15收稿，2017－03－17修回］

［本文編輯：董冰媛］

The expression and significance of FOXC1 in multidrug-resistance cells of gastric cancer

AN Yan-xin①，SUN Li-yong，WANG Qing.
①Department of General Surgery，the General Hospital of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250031，China

Objective To investigate the expression of FOXC1 in multidrug-resistance cells of gastric cancer and its effect on chemosensitivity of gastric cancer cells.M ethods qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of FOXC1 in the cells of SGC7901/ADR，SGC7901/VCR and parent cells of SGC7901；the expression of FOXC1 in SGC7901/ADR and SGC7901/VCR was down-regulated by siRNA，the IC50 values of these cells were detected by MTT assay.Results The expression of FOXC1 in SGC7901/ADR and SGC7901/VCR was significantly higher than that in SGC7901.After the expression of FOXC1 was down-regulated，the sensitivity of SGC7901/ADR and SGC7901/VCR to various chemotherapeutic drugs was significantly increased.Conclusion FOXC1 is involved in multidrug-resistance process of gastric cancer，but its molecular mechanism remains to be further studied.

FOXC1；Gastric cancer；Multidrug resistance

R735.2：R979.1

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.08.006

國家自然科學基金（81602615）

250031山東濟南，原濟南軍區(qū)總醫(yī)院普外科（安艷新，孫力勇），口腔科（王菁）

王菁，Email：wangjing1121@126.com