小鼠腦爆震傷中PI3K/Akt通路及相關凋亡蛋白表達情況

史秀云， 柳云恩， 張玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 叢培芳， 劉 穎， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

·爆震傷·

小鼠腦爆震傷中PI3K/Akt通路及相關凋亡蛋白表達情況

史秀云， 柳云恩， 張玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 叢培芳， 劉 穎， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

目的 探討小鼠腦爆震傷后不同時間點磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路及相關凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達情況。方法 將50只雄性小鼠通過隨機數(shù)字表法分為對照組(n=10)和模型組(n=40)，再將模型組根據(jù)造模成功后時間分為3 h組、6 h組、12 h組和24 h組，每組各10只。測定各組腦組織含水量與伊文思藍含量，并采用Western blot以及實時熒光定量PCR等技術檢測各組小鼠腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2、Bax的含量和mRNA的表達變化。結果 模型組各時間點腦組織含水量與伊文思藍含量較對照組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot檢測與實時熒光定量PCR檢測結果一致。Akt、PI3K和Bcl-2表達，3 h組、6 h組均較對照組顯著降低，6 h組達到最低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12 h組、24 h組較6 h組有所升高，但仍低于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Bax表達，3 h組、6 h組、12 h組均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；24 h組較12 h組有所降低，但仍高于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 顱腦爆震傷中PI3K/Akt通路和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達變化對其判斷和治療有一定提示作用。

顱腦爆震傷； 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路； Bcl-2； Bax

近年來，暴恐襲擊事件增多以及高能武器大量應用使得爆震傷發(fā)生率逐年遞增[1]。爆震傷傷情復雜，死亡率高，其中以頭部損傷造成的后果最為嚴重[2-3]。由于腦部結構復雜，生物機制多變，目前關于腦爆震傷的傷情特點及致傷機制的研究還處于起步階段。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路是重要的細胞存活信號通路，已被證實在腦缺血神經(jīng)細胞凋亡中起調控作用[4]。而Bcl-2和Bax是研究較為深入的與凋亡調控相關的蛋白[5-6]。因此，本研究通過建立腦爆震傷的小鼠模型，檢測不同時間點腦組織含水量與伊文思藍含量，以及腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax的表達情況，探討PI3K/Akt通路及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax在腦爆震傷中的作用，旨在為研究爆震傷致腦損傷的損傷特點及機制提供理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選取50只雄性昆明小鼠，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供并飼養(yǎng)，食物、水由動物實驗中心提供，確保不含對本研究結果引起干擾的成分。將50只雄性小鼠通過隨機數(shù)字表法分為對照組(n=10)和模型組(n=40)，再將模型組根據(jù)造模成功后時間分為3 h組、6 h組、12 h組和24 h組，每組各10只。

1.2 小鼠腦爆震傷模型構建 將小鼠麻醉后，放于保護罩內，保護小鼠其他部位，只顯露腦部，隨后將其固定于自主設計研發(fā)的高仿真爆震傷模型裝置的網(wǎng)狀部位，下方空氣壓縮裝置使空氣壓縮，將0.8 mm的鋁薄放于中間層固定，通電后鋁膜爆破，下方炮筒壓力達0.12 MPa，超壓波顯示壓力為0.55 MPa。

1.3 腦組織含水量與伊文思藍含量檢測 腦組織含水量采用干濕法中的Bliott公式計算，取全腦組織用電子天平稱質量(濕質量，精確到0.1 mg)，置于恒溫箱烘烤24 h后稱干質量。伊文思藍含量檢測需在各組動物處死0.5 h前以2 ml/kg的比例尾靜脈注入2% EB。麻醉后打開胸腔，心內灌注肝素生理鹽水200～300 ml，斷頭取腦稱取質量后剪碎放于二甲基甲酰胺，經(jīng)37℃水浴24 h后,1 000 r/min離心5 min，取上清液測定光密度(OD)并記錄，計算后得到伊文思藍含量。

腦組織水含量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%

1.4 Western blot檢測 分別于腦爆震傷后3、6、12、24 h取小鼠腦組織并將取得的腦組織即刻置于液氮罐中凍存待用。將凍存在液氮中的腦組織取出，置于冰上融化，加入RIPA裂解液后制備成組織勻漿，離心后取上層蛋白溶液，測定其蛋白的濃度并配平，置于-80℃中備用。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)過電泳、轉膜之后，加入一抗GADPH(購自Santa公司)、PI3K(購自Abcam公司)、Akt(購自Abcam公司)、Bcl-2(購自Abcam公司)及Bax(購自Abcam公司)，經(jīng)4℃雜交過夜，二抗孵育，ECL發(fā)光，最后通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.5 實時熒光定量PCR檢測 取適量腦組織置于研缽中，加入液氮后將組織研碎，按Trizol試劑操作說明書進行。RNA沉淀干燥后，加入DEPC水復溶。依照逆轉錄試劑盒說明書操作，得到表達的cDNA。通過SYBR Green實時熒光定量PCR法，對GADPH、PI3K、Akt、Bcl-2和STAT3進行實時熒光定量分析。并以GAPDH為參比基因，計算各目的基因/參比基因的相對定量。

2 結果

2.1 腦組織含水量與伊文思藍含量檢測 模型組各時間點腦組織含水量與伊文思藍含量較對照組均明顯升高，在12 h達到高峰隨后降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 Western blot檢測 通過Western blot實驗檢測小鼠腦組織中相關蛋白表達，結果見圖1。對AKT、PI3K、Bcl-2和Bax的條帶進行半定量分析，結果見圖2。結果顯示，Akt、PI3K和Bcl-2表達，3 h組、6 h組均較對照組顯著降低，6 h組達到最低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12 h組、24 h組較6 h組有所升高，但仍低于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Bax表達，3 h組、6 h組、12 h組均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；24 h組較12 h組有所降低，但仍高于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠腦組織含水量及伊文思藍含量比較

注：與對照組比較，①P<0.05

2.3 實時熒光定量PCR檢測 通過實時熒光定量PCR檢測小鼠腦組織mRNA表達，結果見表2。結果顯示，AKT、PI3K、Bcl-2和Bax的表達水平與Western blot結果相一致。Akt、PI3K和Bcl-2表達，3 h組、6 h組均較對照組顯著降低，6 h組達到最低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12 h組、24 h組較6 h組有所升高，但仍低于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Bax表達，3 h組、6 h組、12 h組均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；24 h組較12 h組有所降低，但仍高于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖3。

圖1 Western blot結果

圖2 Western blot半定量分析結果(與對照組比較，①P<0.05)

組別AKTPI3KBcl-2Bax對照組7.92±1.121.89±0.283.28±0.352.77±0.323h組4.35±1.32①0.92±0.19①1.93±0.21①5.67±1.31①6h組3.56±0.88①0.82±0.17①1.52±0.23①5.77±0.99①12h組5.67±1.011.52±0.342.91±0.255.75±0.84①24h組5.78±1.111.63±0.272.43±0.373.51±0.47

注：與對照組比較，①P<0.05

3 討論

爆震傷導致的顱腦損傷是爆震傷死亡率居高不下的原因之一，其特點是外輕內重、傷情變化快且傷情復雜[7]。爆震傷對腦組織造成的損傷是由炎癥反應、氧化應激等多方面作用的結果，神經(jīng)凋亡在其中處于關鍵的環(huán)節(jié)[8-9]。PI3K/Akt信號傳導通路作為細胞生存重要通路之一，通過影響下游通路相關基因轉錄或其轉錄調控子的生成,常參與調節(jié)機體凋亡和創(chuàng)傷反應的發(fā)生發(fā)展[10]。其相關凋亡蛋白參與腦損傷的修復和發(fā)生的研究已經(jīng)得到較為廣泛的重視。其中，PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用，進一步激活或抑制其下游靶蛋白Bad、caspase9、NF-κB等因子促進細胞存活，是重要的抗凋亡調節(jié)因子[11]。PI3K/Akt信號分子的下調提示顱腦爆震傷初期神經(jīng)凋亡的發(fā)生[12]。有研究通過小鼠液壓傷模型發(fā)現(xiàn)，Akt在造模后1h表達減少,4 h回升,24 h達到正常水平[13]，與爆震傷顱腦外傷變化趨勢趨于一致。同時，細胞凋亡過程中抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，且呈時間依賴性，并伴有促凋亡蛋白Bax的表達升高，導致抗凋亡和促凋亡因素的比例下降，使細胞走向凋亡。

圖3 實時熒光定量PCR結果(與對照組比較，①P<0.05)

腦組織含水量變化可提示腦水腫的發(fā)生，爆震傷小鼠的血腦屏障通透性改變與腦組織含水量顯著降低是顱腦爆震傷的病理性過程，對于后續(xù)相關分子改變和疾病的發(fā)展有重要影響[14-15]。因此，本研究通過測定爆震傷后腦組織水含量和伊文思藍含量，并在不同時間點測量腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2和Bax的變化，進一步明確PI3K/Akt通路和相關凋亡蛋白在腦爆震傷中的作用。結果表明，相關蛋白表達的變化趨勢和mRNA的變化趨勢一致，進一步證明顱腦爆震傷發(fā)生時相關凋亡因子的變化情況。

綜上所述，顱腦爆震傷后機體產(chǎn)生復雜的應激反應。其中，PI3K/Akt 信號通路和相關的凋亡蛋白參與顱腦爆震傷的發(fā)生和發(fā)展，其表達量與損傷時間相關。因此，干預其通路的表達可能成為爆震導致腦損傷的有效治療方法之一。

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Expression of PI3K/Akt pathway and related apoptotic proteinsinmouse braininduced by traumatic shock

SHI Xiu-yun,LIU Yun-en,ZHANG Yu-biao,TONG Chang-ci,SHI Lin,CONG Pei-fang,LIU Ying,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command, Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma PLA, Severe Trauma and Organ Protection key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110016, China)

Objective To investigate the expression of PI3K/Akt pathway and related apoptosis proteins Bcl-2 and Bax at different time points after blast injury.Methods A total of 50 experimental male rats were randomly divided into the control group(n=10)and the model group(n=40).The rats in the model group were divided into the group of 3 hours,6 hours and 24 hours,with 10 rats in each group.Brain water content and Evans blue content were detected in brain tissues.Western-blot and Real-time PCR methods were used for determination of PI3K,Akt,Bcl-2 and Bax content and expression changes of mRNA in mouse brain tissues.Results The brain water content and Evans blue content in model groups at each time point were significantly improved after modeling,and the differences between the groups had statistical significance(P<0.05).Compared with the control group,the expression of PI3K,Akt and anti-apoptotic factor Bcl-2 were significantly lower than those of the control group,and the expression in groups of 12 hours and 24 hours increased back to normal(P<0.05);the expression of pro-apoptotic factor Bax was significantly increased(P<0.05).Conclusion The changes of PI3K/Akt pathway and Bcl-2 and Baxmayhelpdetermine and carry out treatment of craniocerebralblast injury.

Traumatic brain blast injury; PI3K/Akt pathway; Bcl-2; Bax

全軍十二五面上項目(CSY12J002)；全軍重大新藥創(chuàng)制項目(2013ZX09J13109-02B)；全軍十二五面上項目(CSY13J002)； 總后衛(wèi)生部重大新上(ASM14L008)

史秀云(1991-)，女，遼寧鐵嶺人，技師，碩士

侯明曉，E-mail：houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)04-0215-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.05

2017-5-22