紅麻EST-SSR標記的開發(fā)及其多態(tài)性評價

萬雪貝李東旭徐 益徐建堂張力嵐張列梅林荔輝祁建民,*張立武,*

1福建農林大學作物科學學院 /作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室 /福建省作物設計育種重點實驗室;2福建農林大學海峽聯合研究院基因組與生物技術中心,福建福州 350002

紅麻EST-SSR標記的開發(fā)及其多態(tài)性評價

萬雪貝1,2李東旭1,2徐 益1,2徐建堂1張力嵐1,2張列梅1林荔輝1祁建民1,*張立武1,2,*

1福建農林大學作物科學學院 /作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室 /福建省作物設計育種重點實驗室;2福建農林大學海峽聯合研究院基因組與生物技術中心,福建福州 350002

紅麻是最重要的自然纖維作物之一,然而SSR標記的匱乏限制了其遺傳改良。本研究從紅麻90 175個EST序列中挑出含有轉錄因子的EST,開發(fā)了94對SSR引物。以24份不同紅麻種質資源的DNA為模板,利用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測多態(tài)性。結果表明,85對引物(占90.4%)至少在2個材料之間存在多態(tài)性,表明開發(fā)的EST-SSR具有很好的多態(tài)性。其中,三核苷酸重復所占比例最多,重復基元AAT和ATG的多態(tài)性較高。聚類分析表明,24份紅麻種質資源的遺傳相似系數變化在0.62~0.92之間,表現出豐富的遺傳基礎。這些結果不僅豐富了紅麻的分子標記數量,而且為紅麻的遺傳分析提供資源。

紅麻;SSR;遺傳多樣性;標記開發(fā)

紅麻(Hibiscus cannabinus)又叫大麻槿,屬于錦葵科木槿屬一年生草本韌皮纖維作物。具有耐旱、耐鹽堿、抗逆性強、根系發(fā)達、生長速度快、生物產量高、易栽培等特點[1-3]。紅麻主要是作為麻紡工業(yè)的原料,近年來在建材、可降解性塑料、吸污、飼料、造紙、地膜、麻油、藥用等領域都有廣泛的應用[4-6]。其主要種植地區(qū)為中國、泰國、印度、孟加拉國、越南、古巴、巴西、印度尼西亞、伊朗等[7]。

SSR(simple sequence repeat,簡單重復序列),又稱微衛(wèi)星標記,是由1~6個核苷酸組成的短序列串聯重復多次而組成的一段DNA。因為SSR中重復單元的重復次數不同,所以擴增的SSR序列長度呈現出多態(tài)性。SSR標記具有多態(tài)性較高、重復性好、穩(wěn)定性好等特點,被廣泛應用于基因定位、遺傳關系分析、品種鑒定等領域,被認為是十分有效的分子標記之一[8-9]。根據序列來源,SSR標記可以劃分為基因組 SSR和表達序列標簽 SSR(EST-SSR, expressed sequence tags-SSR)。由于EST-SSR來源于轉錄區(qū)域,往往跟功能基因連鎖[10-11]。在真核生物中,存在著大量的轉錄因子(transcription factor),這些轉錄因子在植物的產量、品質、抗逆等性狀中發(fā)揮著重要作用[10-11]。因而,基于轉錄因子開發(fā)EST-SSR標記,在遺傳研究與分子標記輔助育種中具有明顯的優(yōu)勢。

EST-SSR標記已經在小麥[12]、大豆[13]、甘藍[14]、花椰菜[15]、苧麻[16]等領域上有所應用,如王慶彪等[14]篩選出20對核心EST-SSR引物構建了中國50個甘藍代表品種的SSR指紋圖譜;劉晨晨等[16]利用21對EST-SSR引物評價了19個苧麻品種,表明ESTSSR在苧麻近緣種中具有很好的通用性。然而紅麻的分子標記研究起步較晚,僅極少數實驗室開展了有關工作。目前可查的紅麻SSR標記是部分來源于陸地棉SSR[17]。由于缺乏可供利用的SSR標記,一些紅麻遺傳育種研究者只能利用隨機多態(tài)性位點的分子標記,如ISSR、RAPD等。徐偉[18]利用RAPD分子標記對紅麻7個常規(guī)栽培種和12個野生種及5個近緣種進行了親緣關系研究。由于紅麻至今尚無參考基因組序列,因此很難大規(guī)模開發(fā)SSR分子標記。鑒于紅麻SSR數目多,還有大量的未被發(fā)現,且EST-SSR具有重要的理論和應用價值。本研究旨在利用公共數據庫NCBI中轉錄組測序獲得的90 175個EST[19],選擇包含有轉錄因子的EST,開發(fā)SSR標記并鑒定其多態(tài)性,為紅麻的遺傳研究與分子標記輔助育種提供資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于研究的24份紅麻種質資源,由福建農林大學麻類遺傳育種與綜合利用研究室提供(表1),均于2015年5月1日種植于福建農林大學洋中科教基地。

1.2 基因組DNA提取

采用改良的CTAB法提取24份試驗材料的幼苗DNA[7]。

1.3 紅麻表達序列標簽序列來源及SSR引物開發(fā)

紅麻表達序列標簽序列數據來源于NCBI的SRA數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra),登錄號為SRP060459[19]。為了篩選具有潛在功能標記的SSR,選擇包含有轉錄因子的EST,共1031條。根據SSR的重復次數進行篩選:二核苷酸>6次,三核苷酸>4次,四核苷酸>3次,五核苷酸>2次。利用網上的SSRPrimer工具(http://hornbill.cspp.latrobe.edu. au/ssrdiscovery.html)搜索這些序列所包含的 SSR,共得到94對SSR引物,編號分別為HcES0001至HcES0094。這些引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.4 PCR體系及電泳

PCR體系為10 μL,含2.0 μL DNA(50 ng μL–1)、0.5 μL引物(10 μmol μL–1)、3.75 μL 2×Taq Master Mix (試劑購自上海進岸生物科技有限公司)、3.75 μL dd H2O。用10 μL石蠟油覆蓋。

PCR程序為3 min預變性94℃;94℃變性30 s, 60℃退火30 s,72℃延伸45 s,共10個循環(huán),每個循環(huán)退火溫度降低0.5℃;94℃變性30 s,55℃退火30 s, 72℃延伸45 s,共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min, 4℃保存。采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.5 讀帶與數據分析

利用本研究開發(fā)的EST-SSR對供試材料進行基因分型,利用PowerMarker V3.25軟件計算其多態(tài)性信 息 含 量 PIC (polymorphism information content)[10]?；诜羌訖嗥骄鶖礥PGMA(unweight pair-group method using arithmetic averages)方法計算遺傳相似性,利用NTSYSv2.10軟件進行聚類分析[20]。

2 結果與分析

2.1 SSR標記分布頻率及重復基元種類

選擇包含有轉錄因子的EST,總共開發(fā)94對SSR引物,重復基元分為二至六核苷酸。其中三核苷酸重復所占比例最多,為62.7%,其次是二核苷酸重復,占34.0%,四核苷酸重復和六核苷酸重復所占比例較少,分別為2.1%和1.1%。

基于這些SSR引物,分析各重復基元種類及分

布頻率(表2)。發(fā)現二核苷酸重復基元以AT和TA為主,三核苷酸重復基元以CAA、AAT、ATG和GCA為主。

表1 供試紅麻品種(系)的名稱及來源Table 1 Names and origins of tested kenaf varieties(lines)

表2 紅麻EST-SSR中不同重復類型的分布Table 2 Frequencies of EST-SSR repeat types in kenaf

(續(xù)表2)

2.2 EST-SSR引物的多態(tài)性檢測

為了評估這些新開發(fā)的SSR標記多態(tài)性,以24份紅麻DNA為模板進行PCR擴增,利用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行多態(tài)性檢測(圖1和表3)。結果表明,85(90.4%)對引物得到清晰的PCR產物,且至少在2個材料間存在差異,表現出多態(tài)性。

這些SSR引物的多態(tài)性信息含量(PIC)(表3)變化在0~0.88之間,平均值為0.514。根據Bostsein提出的衡量基因變異程度高低的PIC指標[21],即當PIC>0.5時,該位點為高度多態(tài)位點;0.25

2.3 紅麻品種(系)遺傳多樣性分析

圖1 SSR引物HcES0037對紅麻24份品種(系)的擴增結果

24份紅麻品種(系)具有豐富的遺傳基礎,其遺傳相似系數變化在0.62~0.92之間,變異系數為39%。以遺傳相似系數0.77為分割線,可將24份材料劃分為3組(圖2)。其中,45K R2、83K、20215-2、阿聯紅麻、KS029、紅麻A37、福紅15、XK-9 K2聚為一組;6K、53 India S1、雜紅992選、福紅優(yōu)2號選、KS182、Ecerglades 41、閩紅3-1-2、紅B12/LDF選聚為一組;3K、KS006、57KSCS-11-06-1、福紅992、ID85、79K、福紅優(yōu)5號選、ZH-01聚為一組。分析各組的地理來源,可以看出,來自德國的57KSCS-11-06-1與來自埃及的阿聯紅麻被劃分為不同的兩組,表明這2個品種(系)遺傳關系較遠,可能存在較強的雜種優(yōu)勢。這些結果為后續(xù)的紅麻雜交種的親本選配提供參考。

圖2 基于遺傳相似系數的24份紅麻品種(系)UPGMA樹狀圖

3 討論

3.1 紅麻EST-SSR標記的開發(fā)

SSR標記是一種廣泛應用于遺傳研究與分子標記輔助育種的標記類型[12-16]。與主要農作物相比,紅麻的研究相對滯后。由于沒有可供利用的SSR標記,一些紅麻遺傳育種研究者只能利用隨機多態(tài)性位點的分子標記,如鄭海燕等[22]利用SRAP分子標記構建紅麻品種(系)的指紋圖譜。相對于SRAP等標記而言,SSR具有帶型簡單,重復性好等優(yōu)點。為了利用SSR標記,武耀龍[17]對棉花的SSR引物在紅麻上的通用性進行了研究,64對棉花SSR引物中,57對引物擴增出了條帶,通用性比例高達89%。但這是基于同為錦葵科的棉花序列開發(fā)而來,其多態(tài)性重復性尚需進一步驗證。而本研究基于紅麻EST序列開發(fā)了94對SSR引物,并進行多態(tài)性檢測。發(fā)現85對引物擴增出多態(tài)性條帶,占90.4%,其多態(tài)性比例較高,這不僅可以豐富紅麻分子標記的數量,而且為剖析紅麻重要性狀的遺傳機制提供了資源。雖然兩者SSR多態(tài)性比例相當,但本研究是基于紅麻轉錄組測序得到的表達序列標簽序列。與基于棉花序列開發(fā)的SSR標記相比,本研究開發(fā)的SSR標記對不同的紅麻品種(系)將具有更好的通用性。

在這新開發(fā)的SSR引物中,大部分SSR重復基元為二至六核苷酸。其中,三核苷酸重復基元所占比例最多,為62.7%。這和大部分植物基因組中三核苷酸重復的分布頻率較高的結果一致[23-24]。Hong等[23]分析白菜基因組中的SSR重復基元表明,三核苷酸重復基元序列比例為37.0%。Goff等[24]在水稻基因組中,發(fā)現三核苷酸重復基元序列比例為59.0%。繼而分析其重復基元,發(fā)現紅麻含有重復基元AAT和ATG的SSR引物,多態(tài)性較高。

3.2 EST-SSR標記為紅麻的遺傳分析提供資源

通過多態(tài)性SSR引物的聚類分析,可將24份紅麻種質資源劃分為3組,表明這些標記可用于紅麻種質資源的遺傳多樣性分析。來自德國的57KSCS-11-06-1與來自埃及的阿聯紅麻被劃分至不同的兩組,表明這2個品種(系)具有明顯的遺傳差異。根據雜交種的親本選配的遺傳差異原則,這些紅麻品種(系)配制的雜交種可能具有較強的雜種優(yōu)勢。

劉強等[25]發(fā)現,轉錄因子可以通過調節(jié)植物防衛(wèi)基因的超量表達來激活植物多個抗逆功能基因的表達,從而提高植物的抗逆性。因此,基于轉錄因子基因開發(fā)的SSR標記是具有潛在的功能標記。本研究開發(fā)的SSR標記基于紅麻轉錄因子序列,是潛在的功能標記,但尚需進一步驗證。在未來的紅麻分子標記輔助育種或指紋圖譜構建等遺傳研究中,研究人員可以優(yōu)先考慮使用這些SSR引物。

4 結論

利用紅麻含有轉錄因子的EST開發(fā)出94對SSR引物,這些SSR標記具有較好的多態(tài)性和穩(wěn)定性,是潛在的功能標記。(AAT)n和(ATG)n三核苷酸重復基元多態(tài)性高,可作為紅麻SSR引物設計的首選。24份紅麻種質資源可劃分為3組,表現出豐富的遺傳基礎。

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Development and Polymorphism Evaluation of EST-SSR Markers in Kenaf

WAN Xue-Bei1,2,LI Dong-Xu1,2,XU Yi1,2,XU Jian-Tang1,ZHANG Li-Lan1,2,ZHANG Lie-Mei1,LIN Li-Hui1,QI Jian-Min1,*,and ZHANG Li-Wu1,2,*

1College of Crop Science/Key Laboratory for Genetics,Breeding and Multiple Utilization of Crops of Ministry of Education/Fujian Key Laboratory for Crop Breeding by Design,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2Center for Genomics and Biotechnology,Haixia Institute of Science and Technology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China

Kenaf is one of the most important crops for natural fber production.However,the lack of SSR markers has resulted in a large gap in kenaf genetic improvement.In this study,94 SSR primers were developed on the basis of the sequences containing transcription factors from 90 175 expressed sequence tags(ESTs)in kenaf.A total of 24 kenaf accessions were used to evaluate the polymorphism of these developed SSRs using 9%polyacrylamide gel electrophoresis.Eighty-five SSR primers(90.4%)were successfully amplified and presented the polymorphism between at least two accessions,indicating their high rate of polymorphism.Among them,AAT and ATG were the dominant repeat motifs.Cluster analysis showed that the genetic similarity coefficient varied from 0.62 to 0.92,indicating an abundant genetic basis among these accessions.These developed EST-SSRs not only enrich molecular markers,but also enhance the resource for genetic analysis in kenaf.

Kenaf(Hibiscus cannabinus);Simple sequence repeat;Genetic diversity;Marker development

(

):2016-07-04;Accepted(接受日期):2017-04-20;Published online(網絡出版日期):2017-05-08.

10.3724/SP.J.1006.2017.01170

本研究由福建農林大學杰出青年科研基金項目(xjq201401),國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-19-E06),農業(yè)部東南黃紅麻實驗觀測站(農科教發(fā)2011),福建省科技廳對外合作項目(2015I0001)和福建省麻類種質資源共享平臺項目(2010N2002)資助。

This study was supported by the Distinguished Young Research Fund in Fujian Agriculture and Forestry University(xjq201401),the China Agriculture Research System(CARS-19-E06),the Experiment Station of Jute and Kenaf in Southeast China(Nongkejiaofa 2011),Foreign Cooperation Project of Science and Technology Department in Fujian,China(2015I0001),and Construction of Germplasm Resources Platform for Bast Fiber Crops in Fujian,China(2010N2002).

*通訊作者(Corresponding authors):祁建民,E-mail:qijm863@163.com,Tel:0591-87644898;張立武,E-mail:lwzhang@fafu.edu.cn

聯系方式:E-mail:524073779@qq.com

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170508.1006.004.html