大豆轉(zhuǎn)錄因子基因GmNF-YCa可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透脅迫的耐性

李 敏于太飛徐兆師張雙喜閔東紅陳 明馬有志柴守誠(chéng),*鄭煒君,*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 /旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊凌 712100;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 /國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程 /農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081;3寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所,寧夏永寧750105

大豆轉(zhuǎn)錄因子基因GmNF-YCa可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透脅迫的耐性

李 敏1,2于太飛1,2徐兆師2張雙喜3閔東紅1陳 明2馬有志2柴守誠(chéng)1,*鄭煒君1,*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 /旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊凌 712100;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 /國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程 /農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081;3寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所,寧夏永寧750105

植物的核因子Y(NF-Y)是由3個(gè)亞基A、B和C組成,在響應(yīng)非生物脅迫過程中起著重要的作用。本研究以大豆鐵豐8號(hào)為材料,建立大豆cDNA文庫(kù),以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌,通過酵母雙雜交技術(shù)篩選大豆cDNA文庫(kù),獲得了大豆NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族亞基C的一個(gè)成員,命名為GmNF-YCa。該基因全長(zhǎng)為864 bp,編碼287個(gè)氨基酸,屬于NF-YC亞家族。GmNF-YCa分子量為31.6 kD,等電點(diǎn)為5.07親水性蛋白,具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,無信號(hào)肽。序列分析表明,NF-YC亞家族具有很高的保守性。GmNF-YCa基因啟動(dòng)子含有ARE、Box4、GATA-motif、Box I、ACE、ABRE和CAT-Box等脅迫和光響應(yīng)元件。組織特異性分析表明,GmNF-YCa基因在種子萌發(fā)期表達(dá)量最高。實(shí)時(shí)定量結(jié)果表明,GmNF-YCa受蔗糖和甘露醇的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將大豆GmNF-YCa基因?qū)霐M南芥,并進(jìn)行了功能分析。發(fā)芽率試驗(yàn)分析表明,GmNF-YCa的轉(zhuǎn)基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)期對(duì)滲透脅迫的耐性;改良了在蔗糖和甘露醇處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥的根系生長(zhǎng)和側(cè)根發(fā)育。

大豆;核因子Y;表達(dá)模式;啟動(dòng)子;滲透脅迫

病蟲害等生物脅迫以及旱鹽等非生物脅迫嚴(yán)重威脅著植物的生長(zhǎng),影響著作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。由土壤水分缺失導(dǎo)致的滲透脅迫是其中主要脅迫之一。因此,研究潛在的滲透脅迫分子機(jī)制有助于了解植物適應(yīng)逆境的機(jī)制,改善其產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。

植物在抵御環(huán)境脅迫的進(jìn)化中形成許多分子機(jī)制,包括增強(qiáng)脅迫保護(hù)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)脅迫響應(yīng)的功能基因中起著重要作用[1-2]。核因子Y(NF-Y)轉(zhuǎn)錄因子家族就是其中之一。植物中的NF-Y家族是異源三聚體結(jié)構(gòu),分別由A、B、C亞基組成[4]。亞基NF-YA能夠與CCAAT結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合[5]。NF-YB和NF-YC通過各自的組氨酸結(jié)構(gòu)域形成緊密的二聚體。NF-Y通過二聚體與NF-YA互作來發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用[6]。NF-YA的氮末端和NF-YC的碳末端是由富含谷氨酰胺的疏水結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,是NF-Y復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄激活域[7]。

在動(dòng)物中,NF-Y復(fù)合體已經(jīng)研究得較透徹。據(jù)報(bào)道,在動(dòng)物體內(nèi)NF-Y能夠激活發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄基因,尤其是在細(xì)胞周期間[4,8]。比如,NF-Y能夠控制有絲分裂細(xì)胞周期蛋白的激活[9-10]。另外,NF-Y在細(xì)胞增殖和早期發(fā)育中起著中心調(diào)控的作用。一項(xiàng)研究表明,轉(zhuǎn)基因鼠中NF-YA基因的失活導(dǎo)致發(fā)育早期發(fā)生胚致死現(xiàn)象[11]。與動(dòng)物相比,NF-Y在植物中的研究甚少。動(dòng)物體內(nèi),一個(gè)NF-Y亞基是由一個(gè)基因編碼的。而在植物體內(nèi),一個(gè)NF-Y亞基是由一個(gè)基因家族編碼的,每個(gè)家族是由8~35個(gè)基因組成。在擬南芥中,NF-Y是由10個(gè)NF-YA、10個(gè)NF-YB以及9個(gè)NF-YC編碼[12]。Stephenson等[13]通過計(jì)算分析整個(gè)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),小麥中有37個(gè)基因家族編碼NF-Y(10個(gè)NF-YA、11個(gè)NF-YB和14個(gè)NF-YC)。植物基因組的一個(gè)顯著性特征是由整個(gè)基因組復(fù)制或單個(gè)基因串聯(lián)復(fù)制導(dǎo)致基因復(fù)制[14]。據(jù)報(bào)道,許多種類的基因,包括轉(zhuǎn)錄因子,超過90%的數(shù)量增多是由整個(gè)基因組復(fù)制的結(jié)果[15]。例如,AtNF-YB6可能是薔薇亞綱里的基因組按照一定的規(guī)律進(jìn)化而來;MtNF-YB5可能是大豆基因組按照自然規(guī)律進(jìn)化得到的[16]。

隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)NF-Y在植物中所起的作用越來越重要。研究表明,NF-Y家族中的一些基因在植物的各生長(zhǎng)發(fā)育階段起著關(guān)鍵的作用。Kumimoto等[17]證明NF-Y與植物的開花有關(guān),發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNF-YB2與其親緣關(guān)系極近的蛋白AtNFYB3通過激活開花調(diào)節(jié)因子的表達(dá)來控制花期,特別是在光誘導(dǎo)的條件下能夠促進(jìn)植物開花。另外,在酵母中發(fā)現(xiàn)NF-YB亞基能夠直接與CCAAT-box中的開花軌跡T啟動(dòng)子結(jié)合,進(jìn)而控制植物開花時(shí)間。LEC1(LEAFY COTYLEDON 1)在擬南芥種子成熟的過程中起著重要的作用。Yamamoto等[18]發(fā)現(xiàn)擬南芥基因AtLEC1與NF-YC亞基結(jié)合后,通過與種子中的ABRE特異結(jié)合因子互作,激活下游基因轉(zhuǎn)錄,說明NF-Y也參與植物種子的生長(zhǎng)和發(fā)育。Stephenson等[13]通過試驗(yàn)驗(yàn)證了小麥基因TaNF-YB3在幼苗和葉子中受光調(diào)節(jié)顯著,能夠上調(diào)與光合作用相關(guān)的基因。轉(zhuǎn)基因小麥中轉(zhuǎn)基因系的葉子葉綠素含量、光合作用速率和早期生長(zhǎng)速率都有顯著增加,說明NF-Y與光合作用有關(guān)。據(jù)報(bào)道,NF-Y家族基因在提高抵御非生物脅迫能力方面也起著重要作用。Nelson等[19]通過對(duì)處理后的材料進(jìn)行各脅迫相關(guān)參數(shù)的測(cè)量和計(jì)算,發(fā)現(xiàn)AtNF-YB1和ZmNF-YB2能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱的耐性,進(jìn)而提高作物的產(chǎn)量。

大豆(Glycine max L.)是世界上種植面積最大的油料作物,為人類和動(dòng)物提供脂肪酸和蛋白,對(duì)滲透脅迫比較敏感。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中,鑒定出7個(gè)大豆Di19基因[20],其中GmDi19-5受干旱、過氧化物、ABA等脅迫誘導(dǎo)上調(diào),GmDi19-5啟動(dòng)子在干旱、過氧化物、ABA等處理下能夠增加GUS的活性[21]。為了進(jìn)一步研究GmDi19-5的功能,本實(shí)驗(yàn)室以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌篩選大豆cDNA文庫(kù),得到了一些可能與其互作的候選蛋白基因,其中包括NF-Y家族成員,命名為GmNF-YCa。本文旨在研究GmNF-YCa對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)及其功能,為改良大豆抗逆性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆品種鐵豐8號(hào)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所邱麗娟研究員提供。以鐵豐8號(hào)為材料建立大豆cDNA文庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中鑒定了7個(gè)大豆Di19基因,其中GmDi19-5對(duì)非生物脅迫響應(yīng)比較明顯,以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌篩選大豆cDNA文庫(kù)得到本文的GmNF-YCa基因。

1.2 植物材料的脅迫處理

將大豆鐵豐8號(hào)種植于蛭石中,在培養(yǎng)室(23℃, 16 h光照和8 h黑暗)中生長(zhǎng)10 d至2片葉時(shí)進(jìn)行滲透脅迫處理。在甘露醇(200 mmol L–1)和蔗糖(8%)處理0、1、3、6、12、24和48 h時(shí)取樣,迅速凍于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA的提取與表達(dá)模式分析

利用植物總RNA提取試劑盒(天根,北京)提取大豆樣品,用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大連)合成cDNA。以cDNA為模板,大豆Actin基因(上游引物5'-CAGAGAAAGTGC CCAAATCATGT-3',下游引物5'-TTGCATACAAGG AGAGAACAGCTT-3')作為內(nèi)參,設(shè)計(jì)GmNF-YCa特異引物(上游引物5'-CGTGAATCTCGAACACAT AAGAG-3',下游引物5'-GGAAGAATTGATCGATG CAG-3'),以 SYBR Green染料法,在 Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體總系為20 μL,含2×SuperReal Pre Mix Plus(含熒光染料)(天根,北京)10 μL,正向引物和反向引物各 0.6 μL,50×ROX Reference Dye?0.4 μL,RNase-free ddH2O 8.4 μL。所用程序?yàn)?5℃預(yù)變性15 min,95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s,并收集熒光信號(hào),40個(gè)循環(huán),用2–??Ct法計(jì)算該基因表達(dá)量,整理并分析數(shù)據(jù)[21]。

1.4 GmNF-YCa的生物信息學(xué)分析

使用 SWISS-MODEL在線軟件(https://www. swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)GmNF-YCa蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu);根據(jù)GmNF-YCa的氨基酸序列,在NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)中Blast其同源序列,使用在線軟件 PHYRE2(http://www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/)及DNAMAN進(jìn)行不同物種之間氨基酸同源比對(duì);為進(jìn)一步研究NF-YC進(jìn)化關(guān)系,使用MEGA6軟件繪制系統(tǒng)樹;從大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal. html)截取GmNF-YCa基因上游1300 bp作為啟動(dòng)子。利用植物順式作用元件在線數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE(http:// www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和 PlantCARE (plant cis-acting regulatory elements,http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析基因啟動(dòng)子,預(yù)測(cè)順式作用元件。使用在線軟件The BAR and The Bio-Analytic Resource for Plant Biology(http:// bar.utoronto.ca/efpsoybean/)預(yù)測(cè)GmNF-YCa基因在大豆中的表達(dá)模式。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥轉(zhuǎn)化及純合株系的獲得

所用擬南芥為哥倫比亞型CK。參考Beehtold等[22]的方法對(duì)基因GmNF-YCa遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥,將收獲的T0代擬南芥種于含有潮霉素(700 μL L–1)的MS培養(yǎng)基中,篩選、擴(kuò)繁至T2代獲得轉(zhuǎn)基因株系和同一時(shí)期的CK擬南芥種子。選取長(zhǎng)勢(shì)相同的,兩周齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥和非擬南芥(CK)幼苗,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用GmNF-YCa基因特異性引物和大豆Actin基因,進(jìn)行半定量RT-PCR,反應(yīng)總體系為20 μL,含2×Taq PCR Start Mix with Loading Dye (天根,北京)10 μL,上游引物和下游引物1 μL,模板1 μL,ddH2O 7 μL;反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min, 95℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。選取表達(dá)量高的株系繼續(xù)篩選、繁殖至T3純合,用于下一步的表型分析實(shí)驗(yàn)。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥在蔗糖和甘露醇處理下的功能分析

轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和CK經(jīng)70%的酒精處理1 min后用水清洗3次;于0.7%NaClO靜置10 min,用水洗去NaClO,重復(fù)3次。將晾干的種子點(diǎn)于MS板上,MS板上分別添加4%、6%、8%的蔗糖和50、100和150 mmol L–1的甘露醇。其中,沒有添加任何處理的MS板作為對(duì)照。每個(gè)株系64粒種子,重復(fù)3次。低溫處理3 d后,放于23℃的培養(yǎng)箱中(16 h光照,8 h黑暗)。每隔12 h計(jì)數(shù)一次發(fā)芽率,直至MS板上種子全部發(fā)芽。同時(shí)將MS板上長(zhǎng)至5 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥和CK幼苗小心地轉(zhuǎn)移至添加不同濃度處理(4%、6%、8%的蔗糖和50、100和150 mmol L–1的甘露醇)的MS板上,垂直培養(yǎng)1周之后使用根系掃描儀(WINRHIZO proLA2400)分析其根長(zhǎng),并統(tǒng)計(jì)鮮重,試驗(yàn)重復(fù)3次。用方差分析確定轉(zhuǎn)基因擬南芥和CK之間的表型差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmNF-YCa基因的克隆

為了進(jìn)一步研究GmDi19-5的功能,以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌篩選大豆cDNA文庫(kù)(圖1),得到了一些可能與其互作的候選蛋白基因,包括GmNF-YCa。在大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索發(fā)現(xiàn),大豆NF-YC家族有25個(gè)成員,其中GmNF-YCa編碼的氨基酸序列在第10~第70位氨基酸之間含有1個(gè)NF-YC基序,屬于NF-YC家族。

圖1 GmDi19-5互作蛋白的篩選

2.2 GmNF-YCa基因的序列分析

對(duì)大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),GmNF-YCa基因包含864 bp的開放閱讀框(包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,外顯子和內(nèi)含子交替分布),328 bp的5'非編碼區(qū),276 bp的3'非編碼區(qū);編碼287個(gè)氨基酸,分子量為31.6 kD,等電點(diǎn)為5.07。氨基酸序列分析表明,GmNF-YCa為親水性蛋白,在開放閱讀框內(nèi)的前100個(gè)氨基酸中有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,無信號(hào)肽。用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)GmNF-YCa蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2),為該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的“飄帶模型”。建模所需的模板序列與目的序列的相似度達(dá)到60%,說明預(yù)測(cè)結(jié)果接近實(shí)際結(jié)果。因此,GmNF-YCa蛋白是由無數(shù)個(gè)如圖2所示的蛋白亞基按照一定的非共價(jià)鍵方式連接在一起,經(jīng)過各種修飾加工后具有其蛋白活性進(jìn)而行使其調(diào)節(jié)功能。

圖2 GmNF-YCa蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

以GmNF-YCa蛋白為探針?biāo)阉鱊CBI數(shù)據(jù)庫(kù),采用PHYRE2及DNAMAN進(jìn)行氨基酸同源比對(duì),對(duì)該蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)(圖3),該蛋白與紅豆、菜豆、金絲棗、蘋果、蔓花生及陸地棉的相似度高達(dá)99.0%,與苜蓿、百脈根、木豆、可可及克萊門柚的相似度達(dá)97.5%,而與核桃和木薯的相似性也達(dá)到了96.0%,說明NF-YC家族在進(jìn)化過程中具有極高的保守性。進(jìn)化樹分析顯示, GmNF-YCa與紅豆的親緣關(guān)系最近(圖4)。

圖3 物種間NF-YC保守域序列比對(duì)分析

2.3 GmNF-YCa啟動(dòng)子序列分析

為了研究GmNF-YCa基因的調(diào)控機(jī)制,本研究對(duì)GmNF-YCa啟動(dòng)子進(jìn)行分析。采用在線分析工具PLACE和PlantCARE對(duì)GmNF-YCa的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)大量順式作用元件。其中,啟動(dòng)子的基本的調(diào)控元件TATA-Box位于起始密碼子上游 –391 bp處,增強(qiáng)子CAAT-Box位于起始密碼子上游 –34、–322和–711 bp處;另外,該啟動(dòng)子還包括多種發(fā)育和脅迫響應(yīng)元件,如光響應(yīng)元件ARE、Box 4、GATA-motif、Box I和ACE;ABA響應(yīng)元件ABRE;與分生組織表達(dá)有關(guān)的CAT-Box元件;厭氧響應(yīng)元件ACE等(圖5和表1)。表明GmNF-YCa基因可能參與了ABA等脅迫響應(yīng)、光反應(yīng)過程以及大豆的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過程。

圖4 GmNF-YCa基因在不同物種中的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 啟動(dòng)子GmNF-YCa序列及預(yù)測(cè)的順勢(shì)作用元件

表1 啟動(dòng)子GmNF-YCa序列中的順式作用元件及預(yù)測(cè)的功能Table 1 The cis-acting elements and predicted function of promoter GmNF-YCa

2.4 GmNF-YCa組織特異性及表達(dá)模式分析

將GmNF-YCa的初始基因ID輸?shù)皆诰€軟件The BAR and the Bio-Analytic Resource for Plant Biology的相應(yīng)方框內(nèi),對(duì)GmNF-YCa進(jìn)行組織特異性分析,結(jié)果表明(圖6),GmNF-YCa主要在根毛、根瘤、根、以及種子萌發(fā)期表達(dá),其中在種子萌發(fā)期表達(dá)量最高,為41.28 TPM(transcripts per million);在根尖表達(dá)量最低,為12.50 TPM。這表明GmNF-YCa主要在根的部位以及萌發(fā)期表達(dá),可能與根吸收外界營(yíng)養(yǎng)、滲透脅迫有關(guān),可能與根瘤的產(chǎn)生和生長(zhǎng)有關(guān)。

圖6 GmNF-YCa基因在不同大豆組織中的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of GmNF-YCa gene in different soybean tissuesTPM:transcripts per million.

為了進(jìn)一步解析滲透脅迫對(duì)GmNF-YCa基因表達(dá)的影響,對(duì)10 d的大豆幼苗進(jìn)行蔗糖和甘露醇脅迫處理,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GmNF-YCa在滲透脅迫下的表達(dá)量。如圖7所示,蔗糖和甘露醇脅迫處理對(duì)GmNF-YCa基因表達(dá)量都有影響,但是表達(dá)方式不同。在蔗糖處理下,表達(dá)量開始逐漸上升到12 h時(shí)達(dá)到峰值,為處理前表達(dá)量的3倍,之后GmNF-YCa基因表達(dá)量隨著時(shí)間的增加逐漸下降;而在甘露醇處理下,GmNF-YCa基因表達(dá)量逐漸上升,至6 h時(shí)達(dá)最高值,表達(dá)量提高了2倍。這些數(shù)據(jù)表明,GmNF-YCa基因受蔗糖和甘露醇的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測(cè)以及純合株系的獲得

本試驗(yàn)使用半定量PCR對(duì)所有T2代株系的模板進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)(圖8)。在內(nèi)參Actin基因跑出條帶亮度幾乎相同的情況下,GmNF-YCa基因相對(duì)應(yīng)的條帶亮度的大小表明該基因在擬南芥中表達(dá)量的高低。本實(shí)驗(yàn)從6個(gè)株系中找到表達(dá)量比較高的3個(gè)株系1、3和6,為方便下一步發(fā)芽試驗(yàn),分別命名為35S::GmNFYCa-1、35S::GmNFYCa-2和35S:: GmNFYCa-3。

圖7 GmNF-YCa基因在滲透脅迫處理下的表達(dá)情況

圖8 GmNFYCa轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的表達(dá)量檢測(cè)Fig.8 Expression level of GmNFYCa in transgenic Arabidopsis

2.6 GmNF-YCa在滲透脅迫下的發(fā)芽率

轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與對(duì)照擬南芥植株的發(fā)芽率在不同濃度的蔗糖(4%、6%和8%)和甘露醇(50、100和150 mmol L–1)處理中存在明顯的差異。其中,在對(duì)照MS板上,GmNF-YCa轉(zhuǎn)基因與對(duì)照擬南芥在整個(gè)萌發(fā)過程中基本沒有明顯差異(圖9-A)。經(jīng)過處理的擬南芥的發(fā)芽時(shí)間比未處理的擬南芥的發(fā)芽時(shí)間要晚,但是同一濃度的脅迫處理下,轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率始終高于CK(圖9-B和9-C),且隨著甘露醇和蔗糖處理的濃度的增加,顯著性升高。在4%、6%蔗糖和100 mmol L–1和150 mmol L–1甘露醇的處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率高于CK且已達(dá)到極顯著水平(圖9-D和圖9-E)。例如6%濃度的蔗糖處理下,轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)芽率平均達(dá)到41.5%,而對(duì)照組發(fā)芽率平均為31%;100 mmol L–1甘露醇處理中,轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)芽率90%左右,而對(duì)照只有60%左右。說明GmNF-YCa的轉(zhuǎn)基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)期對(duì)滲透脅迫的耐性。

圖9 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在蔗糖和甘露醇條件下的發(fā)芽率分析Fig.9 Germination rate of transgenic Arabidopsis lines in sucrose and mannitol treatments

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥苗期在滲透脅迫下的表型

轉(zhuǎn)基因擬南芥在模擬滲透脅迫下的根長(zhǎng)發(fā)育試驗(yàn)表明,在正常MS培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)與CK比較沒有明顯差別,而在不同濃度蔗糖和甘露醇處理的根長(zhǎng)有明顯差異(圖10)。在各脅迫處理下,擬南芥根長(zhǎng)小于未處理的擬南芥根長(zhǎng),但是同一個(gè)培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)要高于CK(圖10-A, B),而有的已經(jīng)達(dá)到顯著水平(圖10-C,D)。其中,8%的蔗糖處理下的轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)平均為14.4 cm,而對(duì)照組擬南芥平均為10.4 cm;150 mmol L–1的甘露醇處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)平均為15.2 cm,而對(duì)照組擬南芥的根長(zhǎng)僅為10.0 cm(圖10-C,D)。以上結(jié)果表明在植物中GmNF-YCa基因的表達(dá)可以顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥苗期的滲透脅迫耐性。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動(dòng)子的順式元件結(jié)合調(diào)節(jié)下游基因表達(dá),對(duì)植物各生長(zhǎng)階段以及逆境脅迫響應(yīng)等具有重要作用[1-2]。本研究中GmNF-YCa屬于NF-YC亞家族。NF-YC亞家族在植物中是個(gè)龐大的家族,在進(jìn)化中,保守域在各個(gè)物種、各個(gè)進(jìn)化階段都高度保守,如本次試驗(yàn)中與蘋果、核桃、克萊門柚等作物的相似度高達(dá)96%以上。

很多報(bào)道證明,NF-YC家族能夠受光照的調(diào)節(jié)而影響開花。在植物中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)并克隆出的基因?yàn)閿M南芥AtNF-YC2,它是由光合作用基因AtpC通過酵母雙雜交技術(shù)篩庫(kù)得到的,說明兩者的互作與光照有關(guān)[23]。有試驗(yàn)證實(shí),NF-YC通過與CO特異性結(jié)合影響植物的開花,其中,CO能夠激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來控制植物開花[24]。NF-YC還能夠上調(diào)云杉花粉的生長(zhǎng)[25]。5個(gè)小麥NF-YC基因(TaNFYC5、TaNF-YC8、TaNF-YC9、TaNF-YC11和TaNF-YC12)受光照的調(diào)節(jié),而TaNF-YC11與光合作用的基因共調(diào)節(jié)[26]。GmNF-YCa啟動(dòng)子順式元件中光響應(yīng)元件較多,預(yù)測(cè)GmNF-YCa的功能可能與光照和植物開花有關(guān),但是具體的作用機(jī)制還要進(jìn)一步探究。

圖10 轉(zhuǎn)基因GmNF-YCa擬南芥植株在蔗糖和甘露醇條件下的根長(zhǎng)試驗(yàn)分析Fig.10 Root primary length analysis under sucrose and mannitol conditions

滲透脅迫威脅著作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。NF-Y家族基因在滲透脅迫中起著極其重要的作用。大豆基因GmNF-YA3的轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠提高抗旱能力,并且在ABA處理下通過激活A(yù)BA相關(guān)表達(dá)基因提高對(duì)ABA的脅迫響應(yīng)能力[27]。白楊基因PdNF-YB7轉(zhuǎn)入擬南芥中也被發(fā)現(xiàn)具有抗旱能力[28]。通過逆境下相關(guān)參數(shù)如葉綠素的含量、氣孔開度、葉表溫度等的測(cè)量,轉(zhuǎn)基因ZmNF-YB2玉米在干旱的處理下能夠提高作物的產(chǎn)量[19]。微列陣分析顯示,擬南芥基因AtNF-YA5通過介導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)能夠提高作物的抗旱能力[29]。而關(guān)于NF-YC亞家族的研究著重于生物鐘等方面,但抗逆相關(guān)的報(bào)道很少。一般情況下,NF-Y家族的3個(gè)亞家族都是結(jié)合為三聚體才能發(fā)揮其作用,而NF-YA、NFYB已經(jīng)報(bào)道在許多逆境中起著不同的作用。所以,NF-YC亞家族可能也與逆境脅迫相關(guān)。GmNF-YCa啟動(dòng)子順式元件中含有在干旱和高鹽脅迫條件下能夠提高基因的表達(dá)的ABRE元件,可猜測(cè)其與干旱、高鹽等滲透脅迫有關(guān)。本試驗(yàn)用不同濃度的蔗糖和甘露醇脅迫處理模擬滲透脅迫,轉(zhuǎn)基因GmNF-YCa擬南芥植株的忍受脅迫能力都比對(duì)照高(圖9和圖10),說明GmNFYCa參與滲透脅迫響應(yīng),而NF-YC亞家族在抗逆方面的作用仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過酵母雙雜交技術(shù)篩庫(kù)獲得了大豆GmDi19-5的互作候選蛋白基因GmNF-YCa,該基因轉(zhuǎn)化擬南芥后受蔗糖和甘露醇上調(diào)誘導(dǎo)表達(dá);在甘露醇和蔗糖處理下,轉(zhuǎn)基因擬南芥比CK發(fā)芽率高、根長(zhǎng)和側(cè)根伸長(zhǎng)明顯。

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Soybean Transcription Factor Gene GmNF-YCa Enhances Osmotic Stress Tolerance of Transgenic Arabidopsis

LI Min1,2,YU Tai-Fei1,2,XU Zhao-Shi2,ZHANG Shuang-Xi3,MIN Dong-Hong1,CHEN Ming2,MA You-Zhi2,CHAI Shou-Cheng1,*,and ZHENG Wei-Jun1,*

1College of Agronomy,Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling 712100,China;2Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops,Ministry of Agriculture,Beijing 100081,China;3Institute of Crop Science, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Yongning 750105,China

Biotic stresses,like plant diseases and insect pests,and abiotic stresses,such as drought and salt,heavily threaten plant growth and influence crop yield and quality.Osmotic stress resulting from water deficiency in the soil is one of major hurdles. Nuclear Factor Y(NF-Y)is a heterotrimeric protein,consisting of NF-YA,NF-YB,and NF-YC in plant.NF-Y plays significant roles in the pathway responding to osmotic stresses in plants.We acquired a gene GmNF-YCa,a member of regulatory subunit NF-YC family in soybean(Glycine max L.),by screening a soybean cDNA library using yeast two-hybrid system.The full sequence of GmNF-YCa is 864 bp,encoding 287 amino acids and having a NF-YC motif,belonging to NF-YC subfamily. GmNF-YCa is a hydrophilic protein with a molecular weight of 31.6 kD and isoelectric point of 5.07,and containing a transmembrane domain and no any signal peptides.Sequence analysis showed that NF-YC subfamily was highly conserved among various species.Promoters of GmNF-YCa contained various abiotic stresses and light responsive elements,such as ARE, Box 4,GATA-motif,Box I,ACE,ABRE,and CAT-Box.According to tissue-specific analysis,GmNF-YCa had the highestexpression level in germination stage.Quantitative real-time PCR suggested that GmNF-YCa was induced by sucrose stress and mannitol treatment.GmNF-YCa was transformated to Arabidopsis successfully by Agrobacterium-mediated method and the overexpressed Arabidopsis was prepared for the function characterization analysis.Overexpression of GmNF-YCa could improve tolerance of transgenic Arabidopsis to osmotic stress in the germination stage,and enhance root development with more lateral roots in sucrose and mannitol treatments.

Soybean;Nuclear Factor Y;Expression pattern;Promoter;Osmotic stress

(

):2016-12-20;Accepted(接受日期):2017-04-20;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2017-05-11.

10.3724/SP.J.1006.2017.01161

本研究由國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX0800916B)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371620)資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops(2014ZX0800916B)and the National Natural Science Foundation of China(31371620).

*通訊作者(Corresponding authors):鄭煒君,E-mail:zhengweijun@nwsuaf.edu.cn;柴守誠(chéng),E-mail:chaishoucheng@126.com

聯(lián)系方式:E-mail:13664207046@163.com

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170511.1152.002.html