中醫(yī)不同治法對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Hedgehog信號通路mRNA和蛋白表達的影響

鄧洋洋 李佳 孫鑫 蔣寧 鄭洪新

遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧沈陽110032

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨組織微細結(jié)構(gòu)破壞為特征，繼而導致骨脆性增加和骨折危險性增高的一種全身性骨骼疾?。?］。該病以腰腿部骨骼疼痛，身高縮短，甚至易發(fā)生骨折及脊柱變形為主要臨床表現(xiàn)，尤其是在突然活動發(fā)力、久坐、久立、久行時更為明顯。隨著我國老齡社會的加速到來，OP的發(fā)生率正逐步上升，已經(jīng)嚴重威脅到老年人的生活質(zhì)量。中醫(yī)認為骨質(zhì)疏松癥是以腎精虧虛為本，血行瘀滯為標，兼有脾虛氣弱的疾病。而骨質(zhì)疏松癥的骨痛多由不榮則痛和不通則痛而導致。此次實驗在前期補腎填精法研究的基礎(chǔ)上，增立活血化瘀法和補腎活血法，三法比較，觀察中醫(yī)不同治法對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的治療效果，從而為臨床上治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥提供最佳的中醫(yī)藥治療方案。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級雌性2～3月齡SD大鼠60只，體重250～270克g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證書號:SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 飼養(yǎng)條件:飼養(yǎng)溫度為恒溫24℃，濕度40%，各組大鼠正常光照(12 h晝/12 h夜)，自由進食水，飼料為SPF大小鼠飼料，購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.1.3 藥物:補腎填精復方為左歸丸(熟地、山藥、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟絲子、鹿膠、龜膠，遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院);活血化瘀復方為身痛逐瘀湯(秦艽、川芎、桃仁、紅花、甘草、羌活、沒藥、當歸、靈脂、香附、川牛膝、地龍，遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院);補腎活血復方為左歸丸與身痛逐瘀湯加減(熟地、菟絲子、鹿膠、龜膠、川芎、桃仁、紅花、川牛膝，遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院);陽性對照藥為骨疏康顆粒(遼寧康辰藥業(yè)有限公司，批號:20100830)。

1.1.4 試劑:大鼠 VEGF ELISA試劑盒(R＆D systems)、Trizol(Invitrogen)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)、熒光定量 PCR 試劑盒(Agilent Technologies)。

1.2 方法

1.2.1 分組:大鼠按體重分層后隨機分為6組:正常組、模型組、補腎填精組、活血化瘀組、補腎活血組、陽性對照組，每組10只。

1.2.2 造模:采用一次性手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢造模法。除正常組外，大鼠經(jīng)氯胺酮(50 mg/mL)肌肉注射麻醉，0.1 mL/100 g體重。麻醉后的大鼠從腰背部脊柱兩側(cè)做縱行切口切開皮膚及肌肉，見到呈深粉紅色卵巢組織，提起后絲線結(jié)扎其周圍相連組織，將其完整切除，摘除兩側(cè)卵巢組織后逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。術(shù)后給與青霉素肌肉注射，連續(xù)注射3 d。

1.2.3 給藥;手術(shù)后1周開始灌胃給藥，每日1次。正常組、模型組給等量生理鹽水，補腎填精組、活血化瘀組、補腎活血組、陽性對照組用藥量按人體公斤體重(g/kg)每日用藥量的6.3倍計算，體積為1 mL/100 g，給藥12周。

1.2.4 取材

最后一次灌胃后，禁食24 h，10%水合氯醛注射麻醉(36 mg/kg)后，用碘伏消毒手術(shù)部位，開腹，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，取出雙腎及股骨，并于高溫滅菌EP管中－70℃冰箱保存。

1.2.5 指標與檢測:①骨密度測定:取大鼠左后肢股骨，通過雙能 X線骨密度分析儀(美國，NORLAND)對大鼠離體股骨進行檢測，結(jié)果采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含量(g/cm2)表示，應用The Small Subject Scout Scan軟件進行數(shù)據(jù)分析。②血清ALP、TRACP測定:將取材時獲得的血清分裝，應用多功能酶標儀(型號Infinite M200，瑞士TECAN公司)測定血清ALP、TRACP含量。③骨組織SHH、GLI1蛋白含量測定:將股骨放入約5倍于組織體積量的MSH緩沖液中洗凈，晾干、稱重后，用剪刀剪碎置入勻漿瓶中;以500 r/min勻漿充分;將勻漿后的組織放入離心管中離心，2 000 r/min，10 min;提取上清液放入高溫滅菌EP管中。具體檢測步驟按ELISA試劑盒說明書進行。④骨組織 SHH、GLI1mRNA表達測定:定量PCR法測定骨中SHH、GLI1mRNA 相對表達量。使用 Primer-BLAST［2］設計引物，各引物序列見下表1利用測得Ct值計算相對表達量［3］。

表1 各引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0軟件處理所得數(shù)據(jù)，選用ONEWay ANOVA進行統(tǒng)計析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。當P＜0.05時認為作比較的兩組數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上具有差異。

2 結(jié)果

2.1 骨密度及骨代謝變化

2.1.1 各組大鼠股骨骨密度結(jié)果(見表2):各組大鼠骨密度結(jié)果表示，切除大鼠卵巢13周后，與正常組相比模型組大鼠股骨骨密度顯著降低，用藥12周后，各用藥組均可以提高大鼠股骨骨密度。與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義，其中補腎填精組略高于活血組，補腎活血組和對照藥物骨疏康組比較，但差異無統(tǒng)計學意義，說明補腎填精中藥復方具有提高去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨密度，防止骨質(zhì)丟失的作用。

表2 各組大鼠股骨骨密度檢測結(jié)果比較(g/cm2，±s)Table 2 Comparison among the groups on rats’femur BMD test results(g/cm2，±s)

表2 各組大鼠股骨骨密度檢測結(jié)果比較(g/cm2，±s)Table 2 Comparison among the groups on rats’femur BMD test results(g/cm2，±s)

注:與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

股骨骨密度正常組 0.1874±0.0036組別(n=10)##模型組 0.1360 ±0.0057＊＊補腎填精組 0.1591±0.0038＊＊##活血化瘀組 0.1515±0.0048＊＊#補腎活血組 0.1529±0.0033＊＊##陽性對照組 0.1546±0.0039＊＊##

2.1.2 各組大鼠骨代謝結(jié)果(見表3):各組大鼠血清堿性磷酸酶含量測定結(jié)果表示，與正常組相比，模型組血清堿性磷酸酶水平顯著降低，提示骨形成顯著下降，而用藥12周后，各用藥組可以提高血清堿性磷酸酶水平，促進骨形成。各組大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶水平測定結(jié)果表示，與正常組相比，模型組血清抗酒石酸酸性磷酸酶水平顯著升高，提示骨吸收顯著升高，而用藥12周后，各用藥組可以下調(diào)抗酒石酸酸性磷酸酶水平，降低骨吸收。

2.2 骨組織SHH以及Gli1 mRNA表達(見表4)

骨組織SHH mRNA相對表達量測定:與正常組比較，模型組大鼠SHH mRNA相對表達量顯著降低(P＜0.05);與模型組比較，補腎填精組、補腎活血組、陽性對照組大鼠SHH mRNA相對表達量顯著升高(P ＜0.05)。補腎填精組SHH mRNA相對表達量含量顯著高于各用藥組(P＜0.05)。

表3 大鼠血清堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶結(jié)果比較(±s)Table 3 Comparison among the groups on rats’ALP and TRAP test results(±s)

表3 大鼠血清堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶結(jié)果比較(±s)Table 3 Comparison among the groups on rats’ALP and TRAP test results(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P＜0.01;與補腎組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與活血組比較，※P＜0.05，※※ P＜0.01

含量正常組 325.8707±3.4387##▲▲※※ 145.7332±3.5338##▲▲組別(n=10) ALP含量 TRACP模型組 144.1321±2.4134＊＊▲▲ 451.5920±2.6201＊＊▲▲補腎填精組 206.2904±4.3182＊＊##※※ 223.1013±3.2815＊＊##▲▲活血化瘀組 144.2597±3.0048＊＊▲▲ 207.6755±3.5741＊＊##補腎活血組 194.3663±2.1777＊＊##▲▲※※ 210.4100±4.4453＊＊##陽性對照組 208.4726±1.2690＊＊##※※ 197.5354±4.4705＊＊##

骨組織GLI1 mRNA相對表達量測定:與正常組比較，模型組大鼠GLI1 mRNA相對表達量顯著降低(P ＜0.05);與模型組比較，補腎填精組、活血化瘀組、補腎活血組、陽性對照組大鼠GLI1 mRNA相對表達量顯著升高(P ＜0.05)。補腎填精組、活血化瘀組、補腎活血組之間互相比較差異無統(tǒng)計學意義。

表4 大鼠骨SHH以及GLI1 mRNA相對表達量結(jié)果(±s)Table 4Rats’bone tissue Gli1 mRNA test results(±s)

表4 大鼠骨SHH以及GLI1 mRNA相對表達量結(jié)果(±s)Table 4Rats’bone tissue Gli1 mRNA test results(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，☆P ＜0.05，☆☆P＜0.01;與補腎組比較，◇P ＜0.05，◇◇P＜0.01;與活血逐瘀組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與補腎活血組比較，□P ＜0.05，□□P ＜0.01

GLI1正常組組別 例數(shù) 骨SHH 骨10 1．00 ±0．06 1．006 ±0．116模型組 10 0．09±0．05＊＊ 0．270±0．067＊＊補腎填精組 10 0．77±0．09＊＊☆☆ 0．857±0．078＊＊☆☆活血化瘀組 10 0．36±0．09＊＊☆☆◇◇ 0．568±0．079＊＊☆☆◇◇補腎活血組 10 0．60±0．08＊＊☆☆◇◇△△ 0．681±0．112＊＊☆☆◇◇△陽性對照組 10 0．48±0．12＊＊☆☆◇◇△△□□ 0．753±0．141＊＊☆☆◇△△

2.3 骨組織SHH以及GLI1蛋白表達(見表5)

骨組織SHH蛋白含量測定:與正常組比較，模型組大鼠SHH含量顯著降低(P＜0.05);與模型組比較，補腎填精組、活血化瘀組、補腎活血組、陽性對照組大鼠SHH含量顯著升高(P＜0.05)。

骨組織GLI1蛋白含量測定:與正常組比較，模型組大鼠GLI1含量顯著降低(P ＜0.05);與模型組比較，補腎填精組、活血化瘀組、補腎活血組、陽性對照組大鼠GLI1含量顯著升高(P ＜0.05)。補腎填精組GLI1含量顯著高于活血化瘀組(P ＜0.05)。

表5 大鼠骨SHH、GLI1蛋白含量結(jié)果(±s)Table 5 Rats’bone tissue SHH and GLI1 protein test results(±s)

表5 大鼠骨SHH、GLI1蛋白含量結(jié)果(±s)Table 5 Rats’bone tissue SHH and GLI1 protein test results(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，☆P ＜0.05，☆☆ P＜0.01;與補腎組比較，◇P ＜0.05，◇◇P ＜0.01;與活血組比較，△P＜0.05，△△P ＜0.05;補腎活血組比較，□P ＜0.05，□□P＜0.01

ELISA-GLI1正常組組別 例數(shù) 骨ELISA-SHH 骨8 11．38 ±0．70 2290．45 ±100．28模型組 8 4．09±0．42＊＊ 992．82±125．43＊＊補腎填精組 8 6．88 ±0．53＊＊☆☆ 1465．14 ±100．17＊＊☆☆活血化瘀組 8 6．01±0．15＊＊☆☆◇◇ 1259．75±25．20＊＊☆☆◇◇補腎活血組 8 6．20±0．42＊＊☆☆◇◇ 1382．86±23．87＊＊☆☆△陽性對照組 8 8．77±0．54＊＊☆☆◇◇△△□□ 1625．30±119．74＊＊☆☆◇◇△△

3 討論

3.1 骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)病因病機及治法

中醫(yī)學古典醫(yī)籍中沒有“骨質(zhì)疏松癥”的這一病名的記載，但在《內(nèi)經(jīng)》等經(jīng)典醫(yī)籍中可以見到與骨質(zhì)疏松癥病理變化及臨床表現(xiàn)相似的論述。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，當屬中醫(yī)學“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”等范疇，就其臨床癥狀而言主要以骨痛為主，其病機主要與腎精虧虛導致不榮則痛、血行瘀滯導致不通則痛有關(guān)。

①腎虛髓減、骨失所養(yǎng)

腎藏精，主生長、發(fā)育、生殖，在體合骨，主骨生髓，為先天之本。骨的生長發(fā)育都有賴于腎中精氣的充盈。清·唐宗?！吨形鲄R通醫(yī)經(jīng)精義－臟腑所合》曰:“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也;髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)．髓足者則骨強?！比裟I精虧虛，生髓乏源，骨失所養(yǎng)，導致骨代謝異常形成骨質(zhì)疏松癥。宋·竇才《扁鵲心書·骨縮病》曰:“此由腎氣疲憊，腎主骨，腎水既涸，則諸骨皆枯，漸至短縮”指出骨痿病因是“腎氣衰憊”，癥狀是“身上縮短”、疼痛，這和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生之后腰椎發(fā)生擠壓的癥狀非常的相似。由此可見，腎虛髓減、骨失所養(yǎng)是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的根本。

中醫(yī)對通過補腎中藥治療骨質(zhì)疏松癥具有很好的效果。本研究團隊前期研究結(jié)果表明:補腎填精中藥能促進骨形成因子、抑制骨吸收因子的活性，其作用機理之一可能是通過調(diào)控某些影響骨形成及骨吸收的信號通路和局部細胞生長因子及凋亡基因而達到的［4，5］。

②氣血不暢、瘀血阻絡

骨痛是骨質(zhì)疏松癥常見的癥狀。中醫(yī)認為痛則不通，骨痛是瘀血阻絡的主要臨床表現(xiàn)之一。由于絕經(jīng)后婦女臟腑功能衰退，所以多見虛證。又由于其機體功能衰退，體虛氣弱，易受外邪侵襲，導致氣機不利，氣虛無力推動血行脈中，使經(jīng)絡不通、氣血不暢，往往伴隨血瘀的存在［6］。瘀阻經(jīng)絡、經(jīng)絡不通則出現(xiàn)疼痛、功能障礙。瘀血一旦形成，不但在局部產(chǎn)生疼痛癥狀，而且使氣血運行障礙，營養(yǎng)物質(zhì)不能濡養(yǎng)臟腑，骨骼失養(yǎng)，脆性增加，加重骨質(zhì)疏松癥。眭承志等［7］對60例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者進行研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥存在著血瘀的客觀性病理變化，血瘀是引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要病機之一。

綜上所述，骨質(zhì)疏松癥是以腎精虧虛為本，血行瘀滯為標的疾病。而骨質(zhì)疏松癥的骨痛多由不榮則痛和不通則痛而導致。此次本課題在前期補腎填精法研究的基礎(chǔ)上，增立活血化瘀法和補腎活血法，三法比較，觀察中醫(yī)不同治法對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的治療效果，從而為臨床上治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥提供最佳的中醫(yī)藥治療方案。

本實驗采用的補腎活血方劑由熟地、菟絲子、川芎、桃仁、紅花、川牛膝、龜膠7味中藥組成，方中以熟地為君藥，滋補腎陰，填精益髓;桃仁、紅花相須為用，活血通經(jīng)、祛瘀止痛;川芎活血行氣、祛風止痛，為血中之氣藥，走而不守，上行可達巔頂，下行可達血海，適宜各種血瘀病癥，三藥共為臣藥;龜膠滋陰補血、補腎生精益髓;菟絲子、牛膝共歸肝、腎兩經(jīng)，補腎活血、強腰膝、健筋骨，共為佐藥。諸藥合用，共奏補腎活血、填精益髓之功。

3.2 骨代謝與堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶

骨質(zhì)疏松癥是以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點的代謝性骨病變。在人類原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中，骨代謝呈高轉(zhuǎn)換型特點，骨吸收強于骨形成的作用。檢測骨代謝標志物能夠很好的反應骨轉(zhuǎn)化情況，ALP是成骨細胞分泌的一種酶蛋白，是檢測成骨細胞分化的特異性指標。ALP在成骨過程中通過去磷酸化，使磷酸根與鈣離子結(jié)合成磷酸鈣礦化物沉積于骨中，有利于骨的形成［8］。血清 TRACP是由破骨細胞分泌的一種活性酶，是骨吸收和破骨細胞活性的標志物，在骨吸收過程中，TRACP與其他酶一起對骨基質(zhì)中鈣磷礦化物降級，在大鼠模型中TRACP表達升高，表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松。

3.3 Hedgehog信號通路與骨代謝

Hedgehog(Hh)基因發(fā)現(xiàn)于1980年，Nüsslein-Volhard等在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一種基因［9］，由其突變導致果蠅皮膚外表有著連續(xù)的刺猬(hedgehog)樣刺狀突起，該基因被分離出來后，便被命名為Hedgehog(Hh)基因。以后10年中，包括人類和小鼠在內(nèi)的許多脊椎動物中與果蠅Hh同源的基因逐漸被分離和鑒定出來［10］。Hh信號通路是調(diào)節(jié)昆蟲和胚胎發(fā)育的經(jīng)典通路之一［11］，是一個高度保守的細胞間信號傳導系統(tǒng)［12］。Hh通路在動物發(fā)育過程中起重要的細胞間通訊作用［13］。

Hedgehog信號通路由 Hh配體，膜蛋白受體復合物Patched、Smo、核轉(zhuǎn)錄因子Glis和下游靶基因4部分組成。哺乳動物的 Hh配體包括 sonic Hh(Shh)、desert Hh(Dhh)、indianHh(Ihh)3 種［14］。Hedgehog信號通路在體外能誘導成骨細胞系分化及促進一些間充質(zhì)細胞向成骨細胞方向發(fā)育。體外實驗表明Hedgehog和BMP通路協(xié)調(diào)作用促進成熟成骨細胞的產(chǎn)生［15］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)音猬因子(sonic hedgehog，Shh)在Hedgehog家族中表達最廣泛，在該信號傳導通路上對軸骨、四肢骨、顱面骨等骨骼的形成起著重要作用［16］。

本實驗結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織中SHH以及GLI1蛋白及mRNA表達量顯著降低，提示SHH以及GLI1表達的變化與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)，SHH、GLI1表達降低是骨質(zhì)疏松癥的病理機制之一。運用補腎、活血中藥復方干預后，各組SHH、GLI1蛋白含量有不同程度的顯著升高，與單純的活血化瘀法相比較，補腎填精法，補腎活血法效果更好。各干預組SHH、GLI1mRNA表達量亦顯著增高，與單純的活血化瘀法相比較，補腎填精法、補腎活血法效果更好。

綜上所述，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生可能與Hedgehog信號通路中SHH、GLI1表達降低密切相關(guān)，通過補腎填精、補腎活血法提高SHH、GLI1表達水平可能是補腎填精、補腎活血中藥復方治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制之一。