DNA復(fù)制的酶學(xué)機(jī)理

林 權(quán) 胡雪峰

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108)

DNA復(fù)制分為解螺旋、合成新鏈、形成兩個(gè)子代DNA分子三個(gè)主要步驟，每個(gè)步驟對(duì)應(yīng)著更為復(fù)雜的過程，這些過程均需要酶的催化。人教版高中生物學(xué)教材必修2中簡(jiǎn)單介紹了DNA復(fù)制的過程，本文結(jié)合高中生物學(xué)教材的內(nèi)容，在DNA復(fù)制流程的基礎(chǔ)上，介紹相關(guān)酶的功能及其作用機(jī)理。

1 DNA解旋酶作用氫鍵解開DNA雙鏈

DNA復(fù)制是指以親代DNA的兩條單鏈區(qū)域?yàn)槟０搴铣勺哟鶧NA的過程，發(fā)生在有絲分裂間期的S期和減數(shù)第一次分裂前間期的S期。DNA分子為反向平行雙螺旋結(jié)構(gòu)，復(fù)制起始需在復(fù)制起始識(shí)別蛋白和DNA解旋酶共同作用下打開DNA雙鏈片段，為后續(xù)新鏈的合成提供模板。

解旋酶是指利用ATP水解獲得能量打開氫鍵解開雙鏈DNA，并附著于DNA分子上沿一定方向移動(dòng)的一類酶。復(fù)制起始識(shí)別蛋白識(shí)別復(fù)制起點(diǎn)，隨后環(huán)狀結(jié)構(gòu)的解旋酶圍繞在復(fù)制起點(diǎn)處的一條DNA鏈上，沿復(fù)制叉(以解開的兩條DNA單鏈區(qū)域?yàn)槟０?，從一個(gè)固定的起點(diǎn)開始復(fù)制，形成的結(jié)構(gòu)類似叉子，故稱復(fù)制叉[1])前進(jìn)的方向移動(dòng)并斷開堿基對(duì)之間的氫鍵，解開局部雙鏈。緊接著，單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于DNA單鏈區(qū)域，阻止單鏈DNA重新締合成雙鏈。

2 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶消除正超螺旋

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的主要功能是消除正超螺旋。DNA復(fù)制過程中復(fù)制叉向前移動(dòng)會(huì)積累巨大的張力，致使DNA分子的雙螺旋變緊，即產(chǎn)生正超螺旋，阻礙了DNA的解旋和復(fù)制。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶分為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ斷開一條DNA鏈上的磷酸二酯鍵，而DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ作用于兩條DNA鏈上的磷酸二酯鍵，使單鏈或雙鏈DNA片段適當(dāng)旋轉(zhuǎn)舒展DNA鏈，再連接磷酸二酯鍵，達(dá)到釋放張力的目的。因此，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶可作為DNA解旋酶的“先導(dǎo)部隊(duì)”，消除阻礙解旋進(jìn)行的正超螺旋[2]。

3 DNA新鏈的合成

3.1 引發(fā)酶催化合成RNA引物 DNA聚合酶不能從頭起始DNA新鏈的復(fù)制，只能在已有引物的3′-OH末端繼續(xù)延伸。引發(fā)酶利用核糖核苷酸為底物，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成RNA引物產(chǎn)生3′-OH末端，為DNA聚合酶合成新鏈做鋪墊。DNA半保留復(fù)制中，DNA的結(jié)構(gòu)為反向平行，合成DNA的底物為5′-核苷三磷酸，只能5′-位的磷酸基團(tuán)連接到引物的3′-OH上形成磷酸二酯鍵，故DNA復(fù)制的方向只能按新鏈5′→3′方向進(jìn)行。復(fù)制時(shí)，DNA的一條新鏈按與復(fù)制叉移動(dòng)方向一致的方向進(jìn)行合成，即沿新鏈DNA 5′→3′方向連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈；另一條鏈按與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反的方向，沿新鏈DNA 5′→3′方向合成多個(gè)小片段DNA，小片段DNA稱為岡崎片段，再通過連接酶將岡崎片段連接成完整的鏈，稱為后隨鏈[1]。前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制，只需要一個(gè)RNA引物，而后隨鏈的合成是不連續(xù)的，每個(gè)岡崎片段都需要一個(gè)RNA引物。

3.2 DNA聚合酶合成親代DNA的互補(bǔ)鏈 DNA聚合酶Ⅲ是原核生物DNA復(fù)制的主要酶，具有5′→3′的聚合酶活性。DNA復(fù)制以復(fù)制叉處解開的兩條DNA單鏈區(qū)域?yàn)槟０?，利用游離脫氧核苷酸的5′-核苷三磷酸與RNA引物的3′-OH發(fā)生酯化反應(yīng)，形成磷酸二酯鍵，展開前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成。真核生物中，DNA聚合酶α結(jié)合在引物-模板接頭上，起始新鏈的合成。然而其持續(xù)性低，每次與引物-模板結(jié)合最多只能添加100個(gè)左右的脫氧核苷酸[3]。后續(xù)的DNA合成由具備高持續(xù)合成能力的DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε完成[1]。

4 形成兩個(gè)新的DNA分子

前導(dǎo)鏈和岡崎片段一旦合成，其RNA引物就要被切除。原核生物中，引物切除后的空缺由DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合酶活性利用脫氧核苷酸進(jìn)行補(bǔ)齊，最后DNA連接酶連接岡崎片段形成一條完整的后隨鏈。新合成的兩條鏈與其對(duì)應(yīng)的模板鏈相互纏繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，形成兩個(gè)相同的DNA分子。

4.1 RNA引物的酶切 前導(dǎo)鏈上有一個(gè)RNA引物需切除，而后隨鏈有多個(gè)RNA引物需要切除。原核生物中切除RNA引物的酶為DNA聚合酶Ⅰ或核糖核酸酶H[4]。DNA聚合酶Ⅰ使用5′→3′外切酶活性切除5'端的引物，核糖核酸酶H是一種專門水解與DNA雜交的RNA的核酸內(nèi)切酶。真核生物的DNA聚合酶無5′→3′外切酶活性，不能切除RNA引物，而是使用核糖核酸酶和翼式核酸內(nèi)切酶-1(FEN-1)進(jìn)行切除，F(xiàn)EN-1具有5′→3′外切酶活性和內(nèi)切酶活性切除RNA 引物[1]。

4.2 DNA連接酶連接岡崎片段 DNA連接酶在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組的過程中具有十分重要的作用，其所催化的連接反應(yīng)需要ATP或NAD+提供能量。不管是依賴ATP還是NAD+提供能量的DNA連接酶，其反應(yīng)機(jī)理是相近的。第一步：連接酶腺苷酸化，ATP或NAD+中的腺苷?；?AMP)移動(dòng)至酶活性中心的賴氨酸殘基的ε-氨基上，暴露出連接酶上的DNA結(jié)合位點(diǎn)，形成共價(jià)復(fù)合物中間體；第二步：中間體的腺苷?；?AMP)轉(zhuǎn)移給切口處DNA的5′-P，產(chǎn)生焦磷酸鍵，活化切口處DNA的5′-P，形成DNA-AMP中間復(fù)合物；第三步：被激活的5′-P與相鄰DNA的3′-OH生成磷酸二酯鍵，釋放出AMP，兩個(gè)DNA片段連接完成(圖1)。

圖1 DNA連接酶催化DNA片段的連接

5 小結(jié)

總之，DNA復(fù)制的過程非常復(fù)雜，需要多種酶及蛋白因子的共同協(xié)作配合。其在復(fù)制叉處進(jìn)行的基本過程包括松弛超螺旋，解開DNA區(qū)域雙鏈，合成RNA引物，延伸前導(dǎo)鏈及后隨鏈，RNA引物切除，岡崎片段的連接。原核生物DNA復(fù)制與真核生物DNA復(fù)制不同之處主要是：①原核生物的DNA在細(xì)胞中呈裸露狀態(tài)，而真核生物的DNA與組蛋白緊密結(jié)合形成核小體顆粒，核小體盤繞螺旋構(gòu)成染色質(zhì)。因此，真核生物DNA復(fù)制前要先解開核小體，降低了其DNA復(fù)制的速度。②真核生物有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，只有全部染色體完成第一輪復(fù)制，各個(gè)起點(diǎn)才能展開第二輪的DNA復(fù)制；原核生物雖只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，但是第一輪DNA復(fù)制還未結(jié)束，復(fù)制起點(diǎn)便又開始第二輪的復(fù)制。③真核生物DNA復(fù)制涉及的酶和蛋白因子種類比原核生物多。④真核生物的岡崎片段比原核生物小。

(基金項(xiàng)目：福建省“大規(guī)模教育考試試題難度影響和難度預(yù)測(cè)的研究”，No.FJJKCG14-083；* 通信作者)