轉(zhuǎn)基因豬育種中的小鼠模型

肖紅衛(wèi) 鄭新民

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064）

轉(zhuǎn)基因豬育種中的小鼠模型

肖紅衛(wèi) 鄭新民*

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064）

本研究旨在研究轉(zhuǎn)基因豬育種中的小鼠模型，探討轉(zhuǎn)基因小鼠傳代中可能出現(xiàn)的情況，為轉(zhuǎn)基因豬育種工作提供參考。選用昆明小白鼠制作轉(zhuǎn)基因小鼠，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代，并對小鼠進(jìn)行檢測，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的數(shù)量，研究轉(zhuǎn)基因小鼠傳代過程中陽性率的變化以及轉(zhuǎn)基因個體的選擇、表型分析、性狀分析、育種規(guī)劃以及育種中的線性模型分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因所得的首建陽性小鼠的比例為2.3%，轉(zhuǎn)基因陽性小鼠與野生型交配傳代時陽性后代的比例為50%左右；結(jié)果提示，原核顯微注射法制作的轉(zhuǎn)基因陽性個體在傳代過程中，后代的比例不會超過50%。該結(jié)果將直接用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因豬的育種工作，即在轉(zhuǎn)基因豬育種中要加強(qiáng)選擇。

轉(zhuǎn)基因豬；育種；小鼠模型

自從1908年Nilsson-Ehle提出微效多基因假說（multiple-factor hypothesis）[1]以及1941年Lush[2]提出遺傳力概念后，育種學(xué)擁有了合理的內(nèi)核。20世紀(jì)60年代到70年代，隨著計算機(jī)的普及以及在動物育種上的應(yīng)用，數(shù)量遺傳學(xué)及其相應(yīng)的育種學(xué)進(jìn)入高速發(fā)展時期。然而正是由于計算機(jī)的應(yīng)用使得育種規(guī)模越來越大，限制了其潛力的發(fā)揮。

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)，開辟了在短期內(nèi)直接改造生物遺傳性的新天地，使以幾十年為進(jìn)化單位的常規(guī)育種縮短到幾年，能將生物種屬間不可逾越的鴻溝徹底填平，并可賦予群體特定的性狀，因此在育種上具有巨大的潛能。

育種——原意是培育新品種，但是由于親本枯竭，新品種培育理論研究陷于停滯，雜種優(yōu)勢的應(yīng)用和理論研究發(fā)展緩慢，育種學(xué)家轉(zhuǎn)而研究雜種優(yōu)勢利用，但進(jìn)展緩慢，于是部分科學(xué)家把目光集中到轉(zhuǎn)基因動物育種上來[3-6]。由于轉(zhuǎn)基因豬的制作成本太大，轉(zhuǎn)基因豬的育種工作具有長期性，因此，我們在啟動轉(zhuǎn)基因豬育種的同時，還開展以轉(zhuǎn)基因小鼠為育種模型的研究，以期為轉(zhuǎn)基因豬育種工作提供參考。

1 材料和方法

以前期所做9種基因（pOMT-PGH、hDAF、pBHSA、pSHSA、PT-HBV 1.3、Bcl-xL、hCD59、GFP、hCD59+MCP）的轉(zhuǎn)基因小鼠傳代數(shù)據(jù)為研究對象，研究轉(zhuǎn)基因小鼠傳代過程中陽性率的變化以及轉(zhuǎn)基因個體的選擇、表型分析、性狀分析、育種規(guī)劃以及育種中的線性模型分析。

表1 轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率

2 結(jié)果及分析

2.1 原核顯微注射所得后代陽性率的檢測結(jié)果

結(jié)果見表1。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳規(guī)律

將4只原代轉(zhuǎn)Bcl-xL基因小鼠分別與野生型小鼠交配傳代[7]，用PCR和Southern雜交確認(rèn)后代中的轉(zhuǎn)基因小鼠；后代中的陽性小鼠再與野生型小鼠交配傳代。依此方式傳至第五代。各世代轉(zhuǎn)基因小鼠的比例如表2。

表2 轉(zhuǎn)BcL-xL基因小鼠各世代的比例 （%）

10號陽性鼠經(jīng)過選擇后的后代，陽性率維持在50%左右，與孟德爾遺傳的理論值相符，表明外源基因已經(jīng)整合在小鼠兩條染色體中的一條上，且遺傳是穩(wěn)定的；而其他3只小鼠，隨著世代的增加，陽性率呈下降趨勢，表明外源基因在傳代中有丟失現(xiàn)象。

2.3 演化

Fisher曾證明，88.7%的新生基因在無任何壓力影響下，只是隨機(jī)影響，15代以內(nèi)不可避免地消失。消失的極限概率為1，保留的極限概率為0[8]。因此，在轉(zhuǎn)基因育種上，我們也要進(jìn)行選擇，否則所得到的轉(zhuǎn)基因個體（突變體）也會消失。

演化的模型為：

G0代轉(zhuǎn)基因純合子個體第n代后代中的陽性個體比例為：

G0代轉(zhuǎn)基因雜合子個體第n代后代中的陽性個體比例為：

2.4 選擇

2.4.1 表型選擇

采用表型選擇的方法育成一個純種群（p=99.96%即視為成功構(gòu)建純種群）需要的代數(shù)是：

小鼠的世代間隔是9周齡（6周齡性成熟，妊娠期3周），育成一個純種群需要經(jīng)過49×（9/52）=8.5年。

2.4.2 測交法選擇純合子種畜留種的方法

采用測交法選擇純合子公畜留種的方法育成一個純種群（p=99.96%即視為成功構(gòu)建純種群）需要的代數(shù)是：

小鼠的世代間隔是9周齡（6周齡性成熟，妊娠期3周），育成一個純種群至少需要經(jīng)過6×（9/52）=1年。

2.4.3 染色體熒光原位雜交法選擇純合子種畜留種的方法

DDS產(chǎn)生的信號，經(jīng)過放大才能在示波器上顯示完整而穩(wěn)定的波形。信號放大模塊采用的是NE5532芯片[9]。其引腳圖如圖7所示。1引腳、7引腳為輸出引腳；2引腳、6引腳為反相輸入引腳；3引腳、5引腳是同相輸入引腳；4引腳、8引腳分別是負(fù)電源和正電源引腳。

在獲得轉(zhuǎn)基因動物個體之后，用染色體熒光原位雜交法可以在一周內(nèi)鑒定出所測個體是否為純合子，節(jié)約了測交的時間。

綜上，在選擇時應(yīng)該采用染色體熒光原位雜交法選擇純合子的方法，可以節(jié)約大量的培育時間。

2.5 表型值剖分

轉(zhuǎn)基因研究中的目的是通過外源基因的表達(dá)從而使個體產(chǎn)生一個表型，如該表型為個體基因與外源基因所貢獻(xiàn)，則研究人員需要對表型值進(jìn)行剖分。

上述9種轉(zhuǎn)基因小鼠研究的目的是通過外源基因的表達(dá)從而使小鼠產(chǎn)生一個有別于自身現(xiàn)有的表型，該表型全部為外源基因所貢獻(xiàn)，因此，研究人員不需要對該表型值進(jìn)行剖分。

2.5.1 基因型與群體均值的關(guān)系

小鼠獲得的外源基因就是小鼠的基因型，其特點(diǎn)是表型決定于基因型，偏離群體均值以上的部分就是外源基因的貢獻(xiàn)。

2.5.2 基因的平均效應(yīng)

將外源基因以隨機(jī)方式與群體的基因（或基因樣本）相結(jié)合而形成的合子的平均基因型值對群體平均值的離差，就是該基因在特定群體中的平均效應(yīng)。

2.5.3 基因取代的平均效應(yīng)

如果以一個等位基因（A1）隨機(jī)取代另一個等位基因（A2）所產(chǎn)生的基因型值變化，稱為基因取代的平均效應(yīng)。被取代的等位基因來自純合子和雜合子的概率。

2.5.4 基因取代的平均效應(yīng)與基因平均效應(yīng)的直接轉(zhuǎn)換

基因取代的平均效應(yīng)是取代基因的平均效應(yīng)與被取代基因頻率之比，也是被取代基因平均效應(yīng)與取代基因頻率之比的負(fù)值。

2.5.5 關(guān)于育種值的群體遺傳學(xué)分析

個體育種值是個體所有位點(diǎn)全部基因的平均效應(yīng)之和，對于轉(zhuǎn)基因動物而言，主要是考察外源基因的效應(yīng)。育種值具備世代連續(xù)性：個體傳遞給后代的是基因而不是基因型，只有基因決定的加性效應(yīng)即育種值是聯(lián)系世代的唯一能夠穩(wěn)定遺傳的成分。

2.6 來自轉(zhuǎn)基因性狀的遺傳參數(shù)

由于大部分轉(zhuǎn)基因動物中的目的性狀是質(zhì)量性狀，因此，其遺傳參數(shù)是0或者1。如果轉(zhuǎn)基因動物的目的性狀是數(shù)量性狀，并且針對外源基因進(jìn)行選擇，那么其遺傳參數(shù)還是0或者1。

2.7 育種規(guī)劃

在轉(zhuǎn)基因陽性動物中并不全部為純合子，雜合子也表現(xiàn)為陽性，而且在雜合子的后代中會出現(xiàn)野生型的后代，因此在育種開始之前所用的親本育種素材必須全部是純合子[10]。

2.8 畜禽育種中的線性模型

常規(guī)育種所用的模型多能用數(shù)學(xué)方程式來表達(dá)，數(shù)學(xué)期望、方差以及協(xié)方差可以描述，可以假設(shè)及約束條件[11]。而轉(zhuǎn)基因育種時首要選擇的是質(zhì)量性狀即表達(dá)了外源基因的個體，淘汰沒有表達(dá)外源基因的個體。在完成外源基因在染色體上的純合后，可以借鑒常規(guī)育種中所用的線性模型。

3 討論

當(dāng)今的動物育種科學(xué)已經(jīng)從過去的表型育種、雜交育種進(jìn)入到分子育種或基因工程育種的新階段。轉(zhuǎn)基因動物育種與傳統(tǒng)的動物育種相比，因其在改良動物遺傳特性、提高其經(jīng)濟(jì)性狀等上面所需要的時間短，就成為動物分子育種學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。然而，轉(zhuǎn)基因育種與常規(guī)育種存在巨大的分歧，并隨著研究的深入逐漸顯示出來。

3.1 常規(guī)育種

目前，在商品豬生產(chǎn)上利用的是豬的雜交優(yōu)勢，在育種上是培育有特色經(jīng)濟(jì)性狀的品系，然后篩選配合力高的組合，雜種后代性狀突出、體型又符合主流育種界認(rèn)可就可以推向市場[3]。在經(jīng)過幾個世代之后，所用的品種會逐漸退化。

3.2 轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因豬育種工作既要考慮外源基因在后代的傳遞，又要考慮不同組合間的配合力。在早期的轉(zhuǎn)基因動物研究中，我們發(fā)現(xiàn)外源基因的整合發(fā)生在二細(xì)胞胚胎后期，會產(chǎn)生嵌合體的現(xiàn)象，導(dǎo)致出現(xiàn)外源基因不能穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象。且G0代與野生型交配傳代到F1代時所有個體中陽性個體的比例是50%或100%，F(xiàn)1代陽性個體與野生型交配傳代到F2代時所有個體中陽性個體的比例是25%，F(xiàn)2代陽性個體與野生型交配傳代到F3代時所有個體中陽性個體的比例是12.5%。即外源基因在G0代陽性個體后代中的比例是遞減的，這個發(fā)現(xiàn)使轉(zhuǎn)基因動物育種有別于常規(guī)育種，即在做轉(zhuǎn)基因育種研究時必須先得到純合的G0代轉(zhuǎn)基因動物，之后還要考慮不同血統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物存在。

[1]Nilsson-Ehle H.Einige Ergebnisse von Krenzunger bei Hafer und Weizen[J].Bot.Notiser,1908:257-294.

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Mice Model in Transgenic Pig Breeding

XIAO HongweiZHENG Xinmin
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding,Hubei Academy of A-griculture Sciences,Wuhan 430064,China)

This study was focused on the transgenic mouse model for transgenic pig breeding and to explore the possible occurrence of transgenic mice which will provide reference for the transgenic pig breeding.The transgenic mice were made from Kunming mice,and the transgenic mice were passaged.The positive offspring number of transgenic mice,the change of positive rate in the passage of transgenic mice,the selection of individual gene, phenotype analysis,character analysis,breeding program and linear model analysis in breeding were discussed. The results showed that the G0 transgenic mice is 2.3%and the positive offspring by mating G0 transgenic mice with wild type mice were about 50%.The results suggested that the proportion of offspring during passage of transgenic positive individuals by pronuclear microinjection was no more than 50%.The results will be used directly to guide the breeding of transgenic pigs and to strengthen selection in transgenic pig breeding.

Transgenic pig;breeding;mice model

*通訊作者：鄭新民（1960-），男，漢族，陜西渭南人，研究員，主要從事動物生物技術(shù)研究，E-mail：anbit20＠163.com

S813.2

1673-4645(2017)07-0044-04

2017-06-08

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2016ZX08010003-006），湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心（2017-620-004-001），湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金（2016NKYJJ19），湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競爭性項(xiàng)目（2016jzxjh013），湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)重大項(xiàng)目（2016ABA117）

肖紅衛(wèi)（1979-），男，漢族，江蘇鹽城人，碩士，助理研究員，主要從事轉(zhuǎn)基因豬遺傳繁育研究，E-mail：xiaohongwei2003＠163.com