臨床微生物形態(tài)學(xué)及特殊耐藥性檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立及應(yīng)用

魏蓮花，鄒鳳梅，劉剛，楊永清，王晚霞，吳玲，李軍春，王欣，陳玉芊，陳曉青，李可可，邵海鑫，朱吉超

(1.甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅省臨床檢驗(yàn)中心，蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004)

·質(zhì)量管理研究·

臨床微生物形態(tài)學(xué)及特殊耐藥性檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立及應(yīng)用

魏蓮花1，鄒鳳梅1，劉剛1，楊永清1，王晚霞1，吳玲1，李軍春1，王欣1，陳玉芊1，陳曉青2，李可可2，邵海鑫2，朱吉超3

(1.甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅省臨床檢驗(yàn)中心，蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004)

目的 研究臨床微生物形態(tài)學(xué)及特殊耐藥性檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(external quality assessment, EQA)體系的建立、運(yùn)行與實(shí)施，探討該體系的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 每年2次定期在甘肅省對(duì)各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放已知的臨床微生物細(xì)(真)菌落、革蘭染色、抗酸染色圖片，以及美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)更新的知識(shí)點(diǎn)(特殊耐藥性檢測(cè))結(jié)果圖片。要求各參評(píng)單位在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成判讀并上報(bào)結(jié)果。回報(bào)結(jié)果以完全符合、基本符合和不符合的形式進(jìn)行總結(jié)、分析。結(jié)果 臨床微生物形態(tài)學(xué)及特殊耐藥性檢測(cè)EQA體系運(yùn)行2年，共進(jìn)行24次，年度完全符合率逐年上升，2015年達(dá)到91.3%。結(jié)論 臨床微生物形態(tài)學(xué)及CLSI標(biāo)準(zhǔn)知識(shí)點(diǎn)考核EQA體系可督導(dǎo)二級(jí)以上醫(yī)院臨床微生物檢驗(yàn)人員掌握形態(tài)學(xué)識(shí)別技能及學(xué)習(xí)CLSI知識(shí)點(diǎn)，全面提高臨床微生物人員專業(yè)技能。

微生物形態(tài)學(xué)；CLSI；特殊耐藥；室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

近年來，隨著自動(dòng)化細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀、質(zhì)譜技術(shù)等快速檢測(cè)技術(shù)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用，部分檢驗(yàn)人員過分依賴自動(dòng)化儀器的現(xiàn)象較為嚴(yán)重，以致自動(dòng)化儀器鑒定錯(cuò)誤時(shí)不能結(jié)合微生物形態(tài)學(xué)等傳統(tǒng)手段加以綜合分析。微生物形態(tài)學(xué)檢測(cè)或傳統(tǒng)鑒定方法應(yīng)用已普遍成為當(dāng)前國內(nèi)臨床微生物檢驗(yàn)人員的薄弱環(huán)節(jié)。而細(xì)(真)菌菌落形態(tài)、鏡下形態(tài)是準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌、真菌的重要手段之一。美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)制定的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是我國微生物實(shí)驗(yàn)室遵循的指導(dǎo)性文件[1]，加上CLSI每年有更新，其中也涉及特殊耐藥性檢測(cè)的方法。很多臨床微生物檢驗(yàn)人員對(duì)此主動(dòng)學(xué)習(xí)不夠，致使缺乏相關(guān)知識(shí)和基本檢測(cè)技能。基于此，2014年，我們?cè)谌珖氏乳_始探索臨床微生物形態(tài)學(xué)、細(xì)菌特殊耐藥檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(external quality assessment,EQA)體系，并在全省范圍內(nèi)應(yīng)用。本研究通過對(duì)近2年EQA結(jié)果的分析，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 細(xì)(真)菌菌落圖片及鏡下形態(tài)圖片制作 收集質(zhì)控菌株、臨床標(biāo)本中分離的典型菌株。細(xì)菌按照標(biāo)準(zhǔn)劃線方法接種于血平板上，35 ℃溫育18 h；絲狀真菌接種于沙氏平板，25 ℃溫育48 h。用高像素相機(jī)拍攝菌落形態(tài)圖片；根據(jù)考核要求，按照常規(guī)方法涂片、革蘭染色、抗酸染色，油鏡下拍攝鏡下形態(tài)圖片。部分圖片見圖1-4。

圖1 黏液型銅綠假單胞菌革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

圖2 “鬼影細(xì)胞”革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

圖3 曲霉乳酸酚棉藍(lán)染色鏡下形態(tài)(×1 000)

圖4 諾卡菌革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

1.2 特殊耐藥檢測(cè)考核圖片制作 根據(jù)CLSI[2]要求進(jìn)行特殊耐藥性檢測(cè)(如：ESBLs檢測(cè)、MRSA檢測(cè)、耐青霉素的交叉耐藥性檢測(cè)和協(xié)同試驗(yàn)等)并拍照制成圖片。

1.3 EQA方法 根據(jù)已知的細(xì)菌、真菌菌落形態(tài)及細(xì)菌特殊耐藥現(xiàn)象檢測(cè)進(jìn)行定靶。甘肅省臨床檢驗(yàn)中心對(duì)全省130家二級(jí)以上醫(yī)院檢驗(yàn)科，2014和2015年每年統(tǒng)一發(fā)放2次，每次發(fā)放6張圖片，共計(jì)24張圖片，分別按照年份加序號(hào)編號(hào)：2014年為201401-201412，2015年為201501-201512，并同時(shí)對(duì)患者主要癥狀、體征或臨床診斷等做簡明闡述。要求參評(píng)單位在規(guī)定時(shí)間內(nèi)回報(bào)結(jié)果，結(jié)果回報(bào)方式為選擇題或自主回答2種方式，如判斷特殊耐藥試驗(yàn)的陰陽性，根據(jù)菌落形態(tài)或涂片染色鏡檢形態(tài)報(bào)告疑似菌名。檢驗(yàn)中心收到回報(bào)結(jié)果后按照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將質(zhì)評(píng)結(jié)果、正確結(jié)果、誤差原因分析、有關(guān)新資料等信息及時(shí)反饋給參評(píng)實(shí)驗(yàn)室。

2 結(jié)果

2.1 回報(bào)率 2次EQA共24張圖片，2014年參評(píng)單位119家，2次回報(bào)率均為68.07%(81/119);2015年參評(píng)單位103家，2次回報(bào)率分別為65.05%(67/103)和77.67%(80/103)?？偦貓?bào)率由2014年的68.07%提高到2015年的71.36%。

2.2 考核結(jié)果符合率

2.2.1 菌落及顯微鏡下形態(tài)學(xué) 2014年臨床微生物菌落形態(tài)EQA考核內(nèi)容為衛(wèi)星試驗(yàn)和馬爾尼菲藍(lán)狀菌，完全符合率分別為98.77%和61.73%；2015年的考核內(nèi)容為變形桿菌的遷徙現(xiàn)象，完全符合率為91.04%。2014年鏡下形態(tài)考核內(nèi)容有銅綠假單胞菌“臘腸樣”、抗酸染色陽性、淋球菌、“鬼影”細(xì)胞、絲狀真菌及奴卡菌等圖片，完全符合率分別為71.60%、97.53%、98.77%、66.67%、80.25%及98.77%。見表1。

表1 2014至2015年臨床微生物菌落及鏡下菌體形態(tài)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

2.2.2 細(xì)菌特殊耐藥現(xiàn)象 2014年細(xì)菌特殊耐藥現(xiàn)象考核內(nèi)容有D-試驗(yàn)、ESBLs篩查試驗(yàn)、β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)及肺炎鏈球菌青霉素E-試驗(yàn)，完全符合率分別為96.30%、82.72%、92.59%及51.85%。2015年考核內(nèi)容有替加環(huán)素E-試驗(yàn)、改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果判斷、MRSA篩選、Carba NP試驗(yàn)、D-試驗(yàn)、ESBLs篩查試驗(yàn)及耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)篩查，完全符合率分別為75.00%、98.51%、71.25%、92.50%、100%、97.50%及47.50%。見表2。

表2 2014至2015年臨床微生物特殊耐藥檢測(cè)方法圖片室間質(zhì)評(píng)結(jié)果回報(bào)

3 討論

甘肅省臨床檢驗(yàn)中心自2014年開始在以往傳統(tǒng)的EQA項(xiàng)目的基礎(chǔ)上，結(jié)合省內(nèi)臨床技術(shù)人員的現(xiàn)狀，對(duì)臨床微生物室間質(zhì)評(píng)的調(diào)查內(nèi)容進(jìn)行創(chuàng)新改革，增設(shè)細(xì)(真)菌形態(tài)學(xué)及特殊耐藥現(xiàn)象判斷的考核。通過將相關(guān)內(nèi)容制作成圖片，在省檢驗(yàn)中心網(wǎng)站上統(tǒng)一發(fā)布，要求參評(píng)單位認(rèn)真參照?qǐng)D片，按照要求回答考核點(diǎn)并及時(shí)回復(fù)結(jié)果。菌落質(zhì)評(píng)圖以細(xì)(真)菌常見典型菌落或特殊菌落為主；顯微鏡下形態(tài)以典型形態(tài)和特殊形態(tài)為主；細(xì)菌特殊耐藥考核涉及多方面，包括E-試驗(yàn)判讀、特殊耐藥性檢測(cè)(ESBLs、AmpC、Hodge試驗(yàn)、β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)及判斷等。發(fā)放范圍包括二級(jí)以上參評(píng)實(shí)驗(yàn)室，以自愿參加為原則，質(zhì)評(píng)結(jié)果以“完全符合、部分符合及不符合”進(jìn)行評(píng)價(jià)。每年固定進(jìn)行2次，考核的內(nèi)容逐漸擴(kuò)大，但保證每年有CLSI的最新更新內(nèi)容。

特殊試驗(yàn)及菌落形態(tài)考核，我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)圖片：衛(wèi)星試驗(yàn)是鑒定嗜血桿菌屬中流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌的關(guān)鍵試驗(yàn)，第一次調(diào)查時(shí)衛(wèi)星試驗(yàn)圖片參評(píng)實(shí)驗(yàn)室合格率較高，達(dá)98.77%，說明各單位對(duì)判該實(shí)試驗(yàn)的判斷要領(lǐng)已基本掌握。馬爾尼菲藍(lán)狀菌是引起艾滋病患者感染的真菌，為了讓參評(píng)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)識(shí)該真菌在沙氏瓊脂平板上培養(yǎng)2周左右呈玫瑰紅色菌落[3]，我們?cè)?014年EQA活動(dòng)中發(fā)放了1張?jiān)摼湫螒B(tài)圖片，完全符合率僅為61.73%，這也從一個(gè)側(cè)面反映出微生物實(shí)驗(yàn)室在日常工作中對(duì)該菌存在漏檢或錯(cuò)誤鑒定的問題。提示質(zhì)評(píng)組織者今后還需反復(fù)發(fā)放該菌菌落圖片，以強(qiáng)化檢驗(yàn)人員真正認(rèn)識(shí)該菌。變形桿菌遷徙現(xiàn)象較常見，第一次發(fā)放完全符合率達(dá)到91.04%，提示組織者對(duì)一些基本理論及基本現(xiàn)象可以通過這種形式督導(dǎo)檢驗(yàn)人員學(xué)習(xí)掌握。

顯微鏡下形態(tài)學(xué)考核圖片較多，包括黏液型銅綠假單胞菌“臘腸樣”、抗酸染色陽性、淋球菌、“鬼影”細(xì)胞、絲狀真菌、諾卡菌、曲霉、淋球菌、念珠菌、靈芝孢子等，其中，黏液型銅綠假單胞菌“臘腸樣”鏡下判斷符合率僅為71.60%。說明有一部分檢驗(yàn)人員對(duì)此形態(tài)學(xué)并不認(rèn)識(shí)。

抗酸桿菌在革蘭染色時(shí)不易著色，有經(jīng)驗(yàn)者在顯微鏡下可觀察到白色的條狀影子，稱之為“鬼影”細(xì)胞[4]，提示操作者可再進(jìn)行抗酸染色以驗(yàn)證，無經(jīng)驗(yàn)者因不認(rèn)識(shí)這種形態(tài)就容易漏檢?！肮碛啊奔?xì)胞圖片第一次調(diào)查完全符合率僅有66.67%，今后還將繼續(xù)發(fā)放?；颊呖诜`芝孢子后留取痰液標(biāo)本時(shí)易受此污染，不熟悉或不認(rèn)識(shí)此形態(tài)者易將此判為寄生蟲卵，第一次調(diào)查時(shí)完全符合率僅為72.50%。其他圖片如抗酸染色、革蘭陰性雙球菌(疑似淋球菌)、絲狀真菌、奴卡菌、曲霉、念珠菌等有比較好的符合率。

特殊耐藥性檢測(cè)考核中設(shè)計(jì)了11項(xiàng)考核點(diǎn)，圍繞CLSI M100-S24、S25中規(guī)定的檢測(cè)方法進(jìn)行。CLSI規(guī)定當(dāng)肺炎鏈球菌對(duì)青霉素抑菌環(huán)直徑小于19 mm時(shí)，必須用E-test或其他方法檢測(cè)該菌的最低抑菌濃度(MIC)，以確認(rèn)是否真正耐青霉素肺炎鏈球菌菌株。2014年第一次發(fā)放E-試驗(yàn)結(jié)果判讀調(diào)查圖片，要求準(zhǔn)確判讀E-試驗(yàn)結(jié)果，但由于很多實(shí)驗(yàn)室日常工作中對(duì)CLSI M100-S24、S25中涉及到的檢測(cè)方法領(lǐng)會(huì)不深，甚至在工作中并未按照CLSI指南進(jìn)行常規(guī)工作，因此，在結(jié)果判讀上出現(xiàn)很多錯(cuò)誤，完全符合率僅為51.85%；2015年，進(jìn)行第二次調(diào)查，要求通過圖片判斷是否“PRSP”，結(jié)果完全符合率甚至比第一次還低，僅僅為47.50%。說明參評(píng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)CLSI M100-S24、S25知識(shí)點(diǎn)的掌握還不夠牢固。相反，在室間質(zhì)評(píng)中也發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)人員對(duì)CLSIM100-S24、S25上的一些簡單知識(shí)點(diǎn)掌握較好，如金黃色葡萄球菌D-試驗(yàn)，第一次考核時(shí)完全符合率達(dá)到96.30%，第二次考核完全符合率為100%。

我們從2014年開始，通過設(shè)置一系列新的考核點(diǎn)，逐步建立、完善并實(shí)施微生物形態(tài)學(xué)EQA體系，對(duì)錯(cuò)誤結(jié)果進(jìn)行反饋分析并發(fā)放相關(guān)新資料，這種新形式的臨床微生物EQA體系的建立及實(shí)施使我省大部分實(shí)驗(yàn)室開始重視形態(tài)學(xué)技能及CLSI知識(shí)點(diǎn)的學(xué)習(xí)。有的圖片如D-試驗(yàn)，通過反復(fù)發(fā)放，完全符合率明顯提高，說明臨床微生物形態(tài)學(xué)及CLSI中規(guī)定的特殊耐藥檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立及應(yīng)用是提高細(xì)(真)菌檢驗(yàn)及督促學(xué)習(xí)CLSI M100進(jìn)而提高藥敏試驗(yàn)水平的重要手段之一。另一方面，本研究中的部分結(jié)果，如淋球菌、馬爾尼菲藍(lán)狀菌等僅根據(jù)染色形態(tài)難以準(zhǔn)確鑒定到種，回報(bào)單位僅僅是報(bào)告疑似結(jié)果，不要求報(bào)告鑒定結(jié)果，這在一定程度上影響了回報(bào)結(jié)果的完全符合率，也是我們下一步需要著重解決的問題之一。

致謝：衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室陳東科老師提供部分圖片，特此致謝！

[1]張雅薇，王輝. 2016年CLSI M100S(第26版)主要更新內(nèi)容解讀[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，39(3)：165-169.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute. M100S. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-sixth edition[S].Wayne,PA:CLSI,2016.

[3]陳東科, 孫長貴. 實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2011.

[4]Trifiro S, Bourgault AM, Lebel F,etal. Ghost mycobacteria on Gram stain[J]. J Clin Microbiol, 1990, 28(1):146-147.

(本文編輯：劉群)

Establishment and application of external quality assessment system for microbial morphology and detection of special drug-resistance in clinical laboratory

WEILian-hua1,ZOUFeng-mei1,LIUGang1,YANGYong-qing1,WANGWan-xia1,WULing1,LIJun-chun1,WANGXin1,CHENYu-qian1,CHENXiao-qing2,LIKe-ke2,SHAOHai-xing2,ZHUJi-chao3

( 1.DepartmentofClinicalLaboratory,GansuProvincialCenterforClinicalLaboratory,GansuProvincialHospital,Lanzhou730000,Gansu; 2.GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu; 3.SchoolofClinicalMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,Ningxia,China)

Objective To investigate the establishment, operation and performance of external quality assessment(EQA) system for microbial morphology and detection of special drug-resistance in clinical laboratory, and explore the value of the developed system in clinical application. Methods The pictures of known bacteria and fungi colony, gram staining and acid-fast staining from clinical microbiology were distributed to the participating laboratories in Gansu province twice a year at regular intervals. The pictures of standard knowledge points from CLSI, such as special drug resistance were distributed simultaneously. All the participating laboratories were required to complete the interpretation for the pictures and report their results in a scheduled time. Then the results were summarized and analyzed as 3 modes: complete consistency, general consistency and non-consistency. Results During the 2 years when the EQA system for microbial morphology and detection of special drug-resistance were performed for 24 times, the rate of annual complete consistency increased year by year and reached to 91.3% in 2015. Conclusion The EQA system based on the examinations of microbial morphology and CLSI standard knowledge points for clinical laboratory may supervise the staff of clinical microbiology laboratories in the hospitals at second grade or above to master the skills of morphological identification and learn CLSI knowledge points, so their professional skills of clinical microbiology could be comprehensively improved.

microbial morphology; CLSI; special drug-resistance; external quality assessment

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.16

魏蓮花，1965年生，女，主任技師，博士，從事臨床微生物檢驗(yàn)及臨床微生物室間質(zhì)量評(píng)價(jià)管理工作。

R446.5

A

2017-03-02)