DNA甲基化與去甲基化調(diào)控肌肉發(fā)育研究進(jìn)展

王 波 羅海玲

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

DNA甲基化與去甲基化調(diào)控肌肉發(fā)育研究進(jìn)展

王 波 羅海玲*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

肌肉發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其調(diào)控機(jī)制尚不完善。但近年來(lái)表觀遺傳修飾對(duì)肌肉發(fā)育的調(diào)控作用逐漸成為熱點(diǎn)領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與去甲基化修飾對(duì)肌肉發(fā)生與發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。肌肉干細(xì)胞特異位點(diǎn)通過(guò)DNA甲基化修飾，影響肌肉發(fā)育過(guò)程關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控早期發(fā)育的生肌過(guò)程。本文主要圍繞肌肉發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化及去甲基化修飾的變化、重要的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)DNA甲基化修飾影響肌肉發(fā)生的作用進(jìn)行論述。

DNA甲基化；去甲基化；肌肉發(fā)生；酶；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，目前已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的表觀基因組。表觀基因組的遺傳修飾機(jī)制主要包括DNA甲基化[1]、組蛋白修飾[2-3]和非編碼RNA[4]三大部分。1975年發(fā)現(xiàn)的DNA甲基化作為一種表觀遺傳修飾方式[5-6]，是目前表觀遺傳修飾機(jī)制中研究最多且最深入的。DNA甲基化修飾即將甲基供體提供的甲基，通過(guò)共價(jià)鍵鏈接到胞嘧啶核苷酸的5號(hào)碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)，并且這種修飾在植物、動(dòng)物及真菌模型上均能夠較穩(wěn)定的存在[7]。在動(dòng)物模型中，這種修飾通常發(fā)生在DNA鏈的CpG豐富且對(duì)稱的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域通常被稱為CpG島，CpG島大部分存在于管家基因和發(fā)育基因的啟動(dòng)子區(qū)域[8]。而該區(qū)域的DNA甲基化則會(huì)通過(guò)甲基CpG結(jié)合區(qū)域蛋白阻礙轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶與模板鏈的結(jié)合，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程[9]，影響相應(yīng)區(qū)域的基因表達(dá)水平，最終引起機(jī)體相應(yīng)生物學(xué)功能發(fā)生改變。

肌肉組織作為構(gòu)成機(jī)體的重要組成部分，其發(fā)育過(guò)程也受到DNA甲基化水平的調(diào)控。肌肉組織是由中胚層的祖細(xì)胞通過(guò)增殖、分化、融合以及成熟，最終形成骨骼肌纖維，這個(gè)過(guò)程也被稱為肌肉發(fā)生。Brunk等[10]研究證實(shí)，肌分化因子MyoD基因的表達(dá)活性依賴于DNA的去甲基化狀態(tài)，首次直接建立了DNA甲基化與肌肉細(xì)胞分化的聯(lián)系。隨后關(guān)于DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控肌肉發(fā)生過(guò)程的研究也引起了眾多學(xué)者的興趣，使得肌肉發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵基因的修飾狀態(tài)、關(guān)鍵的調(diào)控酶逐漸清晰。而且隨著人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)的重視，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也會(huì)通過(guò)影響DNA甲基化進(jìn)而影響肌肉相關(guān)基因的表達(dá)，并有可能引起相應(yīng)的生理狀態(tài)發(fā)生變化。因而，通過(guò)探究DNA甲基化與肌肉發(fā)育的關(guān)系，有利于人們認(rèn)識(shí)肌肉的發(fā)育過(guò)程及營(yíng)養(yǎng)對(duì)肌肉發(fā)育的調(diào)控作用。

1 DNA甲基化和去甲基化機(jī)制

1.1 DNA甲基化作用機(jī)制

多項(xiàng)研究證實(shí)，DNA甲基化對(duì)哺乳動(dòng)物是一種非常重要的表觀修飾：如X染色體的失活[11]、基因印記[12]、沉默轉(zhuǎn)座子等基因組原件從而保證基因組的穩(wěn)定性[13]，改變機(jī)體眾多基因的轉(zhuǎn)錄水平等過(guò)程均有DNA甲基化參與調(diào)控[14-15]。其中對(duì)DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)水平的機(jī)制是關(guān)注最多的。早期研究表明，通過(guò)DNA甲基化抑制轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的結(jié)合，進(jìn)而抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，這也得到了眾多學(xué)者的認(rèn)同。近年來(lái)，Schüebeler[16]又提出了DNA甲基化潛在的5種可能調(diào)控基因表達(dá)機(jī)制(圖1)：a)甲基不敏感轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合后可以抑制該區(qū)域的DNA甲基化；b)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)一種特異的結(jié)合方式與甲基化的起始位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；c)甲基敏感轉(zhuǎn)錄因子由于起始區(qū)域的胞嘧啶發(fā)生甲基化而無(wú)法與該區(qū)域結(jié)合進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄；d)在胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤含量高的起始位點(diǎn)區(qū)域(圖中陰影表示)，發(fā)生甲基化后易于與甲基化CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白(methyl-CpG-binding domain protein，MBD)結(jié)合，從而間接的抑制轉(zhuǎn)錄因子與該位點(diǎn)的結(jié)合；e)甲基不敏感轉(zhuǎn)錄因子首先與起始位點(diǎn)結(jié)合，形成一個(gè)低甲基化的結(jié)合位點(diǎn)，之后甲基敏感轉(zhuǎn)錄因子再與該位點(diǎn)結(jié)合，從而保證正常的其實(shí)轉(zhuǎn)錄。在這5種模型中，c和d 2種模型相對(duì)較成熟，而其余3種仍有待進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

DNA甲基化可以發(fā)生在DNA鏈上多個(gè)區(qū)域，如在基因內(nèi)和基因間均存在DNA甲基化現(xiàn)象，而不同的區(qū)域甲基化造成的影響也有所不同。研究表明，基因內(nèi)的甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響存在多樣化特征，同時(shí)還可以調(diào)控可變剪切過(guò)程[17-18]；而基因間的DNA甲基化則會(huì)通過(guò)抑制增強(qiáng)子的方式從而抑制基因活性[19]。但非CpG位點(diǎn)的甲基化的功能目前尚不明確。因而，DNA甲基化修飾對(duì)調(diào)控機(jī)體基因表達(dá)具有重要的作用，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的組織發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生影響。

5mC：5-甲基胞嘧啶 5-methylcytosine；MDB：甲基化CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白 methyl-CpG-binding domain protein。

圖1 DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用關(guān)系

Fig.1 Interplay functions between DNA methylation and transcription-factors[16]

1.2 甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶

DNA甲基化與去甲基化在機(jī)體發(fā)育中是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，具有一定的可塑性。在這個(gè)過(guò)程中，甲基化的形成、維持及甲基的移除，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMT)和去甲基化酶——10-11易位酶(ten-eleven translocation enzymes,TET)家族發(fā)揮著重要的作用。

1.2.1 甲基轉(zhuǎn)移酶家族

DNMT的主要作用在于，通過(guò)催化反應(yīng)將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5號(hào)碳原子上，從而形成5mC[20]。DNMT家族主要有DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及DNMT3L。其中DNMT1主要在有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮作用，也即維持復(fù)制過(guò)程中新合成鏈的DNA甲基化模式與模板鏈相同。DNMT3a和DNMT3b具有高度的同源性，主要功能為形成新的DNA甲基化，但其作用的發(fā)育階段又有其特異性。DNMT3b主要是胚胎早期發(fā)育形成新的DNA甲基化過(guò)程中發(fā)揮作用的酶，尤其是在著床過(guò)程中；DNMT3a主要在胚胎發(fā)育的后期及細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮作用[21]。另外，也有研究認(rèn)為，DNMT3a和DNMT3b還承擔(dān)著在維持子代全基因組甲基化模式過(guò)程中阻礙DNMT1發(fā)揮作用的功能[22]。DNMT3L功能為輔助DNMT3a和DNMT3b形成新的甲基化，并促進(jìn)其作用到核染色質(zhì)上[23]。由此可見(jiàn)，DNMT家族在形成DNA甲基化及維持甲基化狀態(tài)的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。

1.2.2 去甲基化調(diào)控通路

DNA甲基化修飾在機(jī)體中可以通過(guò)去甲基化途徑進(jìn)行消除。去甲基化過(guò)程中，TET家族(包括TET1、TET2和TET3 3種同型酶)具有重要的調(diào)控作用。在TET酶的作用下，首先將5mC羥化成5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl cytosine,5hmC)，進(jìn)一步將5hmC氧化成5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)[24-25]，進(jìn)而消除5mC，但形成的5caC能否通過(guò)去羧基反應(yīng)生成胞嘧啶尚不明確。另外，TET催化反應(yīng)的中間產(chǎn)物5fC和5caC還可以在胸腺嘧啶DNA糖苷酶(thymine DNA glycosylase,TDG)的作用下，依據(jù)堿基切除修復(fù)機(jī)制清除[26]。Seisenberger等[27]進(jìn)一步提出了機(jī)體甲基清除路徑的可能機(jī)制(圖2)，主要包括被動(dòng)去甲基和主動(dòng)去甲基2種方式，該路徑中尚有部分過(guò)程需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，從而完善去甲基化通路。在機(jī)體中，DNA甲基化和去甲基化過(guò)程均有關(guān)鍵酶的參與進(jìn)行調(diào)控，而其具體調(diào)控過(guò)程可能因發(fā)育的不同階段而產(chǎn)生差異，從而進(jìn)行精準(zhǔn)地表觀遺傳修飾，維持機(jī)體的正常發(fā)育過(guò)程。而肌肉發(fā)生過(guò)程中，也存在著DNA甲基化和去甲基化的調(diào)控，肌肉發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控基因也受到表觀修飾的影響。

C：胞嘧啶 cytosine；5mC：5-甲基胞嘧啶 5-methylcytosine；5hmC：5-羥甲基胞嘧啶 5-hydroxymethyl cytosine；5fC：5-甲酰胞嘧啶 5-formylcytosine；5caC：5-羧基胞嘧啶 5-carboxylcytosine；T：胸腺嘧啶 thymine；5hmU：5-羥甲基尿嘧啶 5-hydroxymethyluracil；TET：10-11易位酶 ten-eleven translocation enzymes；TDG：胸腺嘧啶DNA糖苷酶 thymine DNA glycosylase；MBD4：甲基化CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白4 methyl-CpG-binding domain protein 4；SMUG：?jiǎn)捂溸x擇性單功能尿嘧啶DNA糖基化酶 single-strand-selective monofunctional uracil-DNA glycosylase; AID/APOBEC：活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶/載脂蛋白B mRNA編輯酶 activation-induced cytidine deaminase/apolipoprotein B mRNA-editing enzyme；DNMT：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 DNA methyltransferases；BER：堿基切除修復(fù) base excision repair。

實(shí)線為通過(guò)酶活性主動(dòng)去甲基路徑，虛線為DNA復(fù)制過(guò)程中缺乏甲基化狀態(tài)的維持形成的被動(dòng)去甲基路徑。藍(lán)色路徑為去氨基作用，棕色為T(mén)ET酶作用途徑。Full line mean actively processed by enzymatic activity, and dashed line mean DNA methylation can be lost passively owing to a lack of maintenance at DNA replication. Deamination pathways were shown by blue lines, and function of TET enzyme family were shown by brown lines.

圖2 DNA去甲基化路徑

Fig.2 DNA demethylation pathways[27]

2 肌肉發(fā)生過(guò)程及DNA甲基化調(diào)控

2.1 調(diào)控肌肉發(fā)育的基因網(wǎng)絡(luò)

骨骼肌起源于胚胎發(fā)育中胚層的祖細(xì)胞，該細(xì)胞群經(jīng)過(guò)增殖、分化、融合及成熟后形成骨骼肌纖維。在肌肉形成過(guò)程中細(xì)胞經(jīng)過(guò)胚胎祖細(xì)胞、衛(wèi)星干細(xì)胞、定向衛(wèi)星細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、肌小管/肌纖維階段。伴隨肌肉的形成，主要有2類(lèi)調(diào)控因子參與：生肌調(diào)控因子(主要包括Myf5、MyoD、Myf6及MyoG)和存在于生肌調(diào)控因子上游的Pax3和Pax7。

Pax3和Pax7屬于保守序列的Pax家族，在調(diào)控組織分化和器官發(fā)育方面起著關(guān)鍵作用，且其表達(dá)不具有組織特異性。胚胎發(fā)育階段，Pax3參與胚胎期軸下軀干肌的形成及層離過(guò)程，同時(shí)成肌祖細(xì)胞遷移到其他生肌部分(如四肢)也需要Pax3參與[28]。而表達(dá)Pax3的遷移細(xì)胞會(huì)形成表達(dá)Myf5和MyoD的細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)肌肉的生成，并形成衛(wèi)星細(xì)胞池。形成胎肌時(shí)，Pax3表達(dá)量下調(diào)，Pax7成為調(diào)控所有成肌干細(xì)胞的主要因子。而在四肢中，起始時(shí)Pax7與Pax3均表達(dá)，通過(guò)基因追蹤試驗(yàn)表明所有后期表達(dá)Pax7的細(xì)胞均起源于曾表達(dá)Pax3的細(xì)胞[29]，且Pax7也是維持成體干細(xì)胞群的重要因素。出生前，Pax7并非胎兒肌肉發(fā)育的必要條件，這可能是由于Pax3可以在一定程度上彌補(bǔ)Pax7的功能；出生后，Pax7卻是肌肉發(fā)育的必要條件，這可能是由于出生后Pax7和Pax3的功能發(fā)生分化，分別承擔(dān)著肌肉發(fā)生過(guò)程的不同調(diào)控功能。因而，Pax3和Pax7在肌肉發(fā)生過(guò)程中，相互依存，又彼此獨(dú)立，共同調(diào)控肌肉的發(fā)生。

Myf5、Myf6及MyoD是生肌的決定因子，也是肌肉生成的必要因子，而MyoG作為一種分化因子，可與Myf6、MyoD共同調(diào)控肌小管分化為成熟肌纖維的過(guò)程[30]。Myf5是肌肉發(fā)育過(guò)程中最先表達(dá)的肌肉生成調(diào)控因子，是胚胎期骨骼肌細(xì)胞決定和分化的重要因子；Myf6不僅在骨骼肌細(xì)胞決定過(guò)程發(fā)揮作用，而且還在肌管分化過(guò)程被激活，進(jìn)而參與肌管分化。MyoD的表達(dá)則在軸上和軸下生皮肌節(jié)Myf5表達(dá)之后，其初始表達(dá)活性依賴于Myf5及Pax3，之后可以通過(guò)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制激活自身表達(dá)活性[31]。MyoG的表達(dá)受MyoD和Myf5的調(diào)控，且在分化過(guò)程中，MyoG和MyoD共同激活終端分化基因。隨著成肌分化進(jìn)行，編碼承擔(dān)結(jié)構(gòu)和酶功能的肌肉蛋白如：α-肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白、原肌球蛋白及肌酸激酶等的基因，其起始活性均被MyoG激活。故而生肌決定因子和分化因子共同促進(jìn)成肌過(guò)程，且依靠不同的表達(dá)順序和相互作用，精細(xì)的調(diào)控肌肉發(fā)生過(guò)程。

2.2 肌肉發(fā)生過(guò)程中的DNA甲基化與去甲基化

在肌肉發(fā)生過(guò)程中，對(duì)應(yīng)的基因甲基化狀態(tài)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的且復(fù)雜的變化過(guò)程。隨著細(xì)胞分化程度的增加，整體的甲基化狀態(tài)上升，然而細(xì)胞基因表達(dá)具有特異性，不同細(xì)胞在某些特殊位點(diǎn)的甲基化程度卻在下降。這可能是由于整體基因甲基化程度的增加是為了降低細(xì)胞的多能性，而不同類(lèi)型細(xì)胞基因表達(dá)隨著機(jī)體發(fā)育具有特異性，特異位點(diǎn)的甲基化含量下降從而保證特異基因的正常表達(dá)。

2.2.1 DNA甲基化

不同的組織或細(xì)胞DNA甲基化模式有特異性，通過(guò)比較肌肉組織與它們之間的甲基化模式有助于研究人員發(fā)現(xiàn)DNA甲基化調(diào)控肌肉發(fā)育的過(guò)程。通過(guò)比較骨骼肌與血細(xì)胞、精子、腦組織及脾臟細(xì)胞的甲基化模式，發(fā)現(xiàn)骨骼肌有178個(gè)特異的高甲基化的位點(diǎn)[32]。之后，Calvanese等[33]鑒定出47個(gè)在骨骼肌中顯著低甲基化的基因，其中部分基因編碼收縮蛋白如遮蔽蛋白、肌收縮蛋白、慢收縮阻凝蛋白等。由此可知，不同組織表現(xiàn)出不同的甲基化模式，從而適應(yīng)其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能。Tsumagari等[34]通過(guò)比較肌肉細(xì)胞和30種非肌肉組織的甲基化模式，發(fā)現(xiàn)94%的差異甲基化位點(diǎn)在肌肉中均表現(xiàn)出低甲基化，且47%的低甲基化位點(diǎn)同樣在成肌細(xì)胞或肌管細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，而在成肌祖細(xì)胞中高甲基化的差異位點(diǎn)僅有3%。這說(shuō)明肌肉的甲基化模式具有特異性，且不同階段的生肌細(xì)胞其甲基化模式是動(dòng)態(tài)變化的，從而調(diào)控不同階段的基因表達(dá)，保證肌肉發(fā)育的正常進(jìn)行。同時(shí)該研究也表明肌肉組織新形成的甲基化主要發(fā)生在成肌細(xì)胞前階段，去甲基化過(guò)程發(fā)生在形成肌管細(xì)胞前后階段，通過(guò)這種方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程，且去甲基化過(guò)程中TET1和TET2在活化去甲基化過(guò)程及形成穩(wěn)定的5hmC產(chǎn)物過(guò)程發(fā)揮重要作用。Tsumagari等[34]報(bào)道還指出Pax3基因無(wú)論在肌源性細(xì)胞還是成熟骨骼肌中均保持高甲基化水平，這可能影響肌肉發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞遷移。然而，Miyata等[35]在研究肌肉發(fā)生過(guò)程中甲基化狀態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)，從成肌細(xì)胞到肌管細(xì)胞階段基因組的甲基化水平有少量的改變，但卻表現(xiàn)出顯著性的上升；而且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些顯著高甲基化位點(diǎn)啟動(dòng)子區(qū)域基因(轉(zhuǎn)錄因子ID4和ZNF238)與肌肉收縮及其他肌肉發(fā)生過(guò)程相關(guān)。該結(jié)果與之前報(bào)道有所不同，可能是由于其使用的是Illumina公司的450K DNA甲基化微珠芯片，在測(cè)定的結(jié)果中未區(qū)分5mC和5hmC。通過(guò)這些研究發(fā)現(xiàn)，在肌肉發(fā)生過(guò)程中，處于不同分化階段肌細(xì)胞其DNA甲基化具有特異性，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，同一階段的DNA甲基化模式也不盡相同，仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，隨著生肌過(guò)程的進(jìn)行，特異位點(diǎn)發(fā)生DNA去甲基化從而保障該過(guò)程對(duì)應(yīng)基因的正常表達(dá)，這方面的研究也吸引了越來(lái)越多學(xué)者的興趣。關(guān)于DNA甲基化修飾產(chǎn)生的階段，大多數(shù)學(xué)者均認(rèn)為甲基化修飾變化更多發(fā)生在細(xì)胞命運(yùn)決定階段前，而在細(xì)胞發(fā)育成熟后僅有少量的修飾發(fā)生，但成熟后受外界環(huán)境因素刺激的影響目前鮮見(jiàn)報(bào)道。

2.2.2 DNA去甲基化

在肌肉發(fā)生過(guò)程中，不同分化階段有不同的生肌調(diào)控因子參與，而這些因子的表達(dá)均與其DNA甲基化狀態(tài)相關(guān)。研究表明，生肌調(diào)控因子Myf5/Myf6的110 kb的增強(qiáng)子區(qū)域有大量的增強(qiáng)子元件，Carrió等[36]通過(guò)比較胚胎干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞、成肌細(xì)胞及肌管細(xì)胞該區(qū)域發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞該區(qū)域均表現(xiàn)出高甲基化，而骨骼肌干細(xì)胞、成肌細(xì)胞及肌管細(xì)胞均表現(xiàn)出低甲基化，且這種低甲基化增加了Myf5基因表達(dá)量，同時(shí)也證實(shí)了DNA甲基化程度在細(xì)胞分化階段調(diào)控Myf5增強(qiáng)子具有特異性，主要調(diào)控肌肉發(fā)生過(guò)程。MyoD是肌肉發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵基因，其功能的發(fā)揮也與其甲基化狀態(tài)相關(guān)。Brunk等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在MyoD遠(yuǎn)端增強(qiáng)子區(qū)域所有的肌源性細(xì)胞均未甲基化，而在非肌肉細(xì)胞和組織(肝臟、心臟、腦等)中平均甲基化水平高達(dá)50%；研究還指出，MyoD遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的甲基化雖然并不會(huì)直接阻止胚胎MyoD的活性，但保持去甲基化狀態(tài)可能是為了產(chǎn)生特異的發(fā)育信號(hào)需要，從而使增強(qiáng)子對(duì)進(jìn)一步的傳導(dǎo)信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，從而激活MyoD基因。MyoG的活性也與甲基化狀態(tài)密切相關(guān)。Lucarelli等[37]研究表明，MyoG在分化階段肌細(xì)胞中的表達(dá)依賴于低甲基化狀態(tài)，但在非肌肉組織(如脾臟、腦)以及增殖期的肌管細(xì)胞中均處于甲基化狀態(tài)；而增殖期的肌管細(xì)胞使用甲基化抑制劑處理后，MyoG的表達(dá)則因甲基化水平降低而會(huì)增加。MyoG啟動(dòng)子區(qū)域需要在去甲基化狀態(tài)下才能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，而在甲基化狀態(tài)時(shí)MBD則與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合阻止其正常轉(zhuǎn)錄[38]。近年來(lái)，也有研究發(fā)現(xiàn)在肌源性細(xì)胞的非CpG區(qū)域也存在甲基化現(xiàn)象，同樣也存在去甲基化現(xiàn)象，但是關(guān)于該區(qū)域的甲基化狀態(tài)對(duì)肌肉發(fā)生過(guò)程的調(diào)控尚不明確，有待進(jìn)一步探討。

2.2.3 DNMT和TET在肌肉發(fā)生過(guò)程中作用

肌肉發(fā)生過(guò)程中，DNMT和TET的活性對(duì)理解甲基化和去甲基化過(guò)程也有重要作用，同時(shí)也是保證機(jī)體正常發(fā)育的重要條件。DNMT和TET在由于其功能的特異性，在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中也表現(xiàn)出不同的表達(dá)特性。DNMT1在肌源性細(xì)胞分化過(guò)程中，其表達(dá)水平下調(diào)，這也與其功能相對(duì)應(yīng)。通過(guò)基因敲除試驗(yàn)證實(shí)，DNMT家族也是機(jī)體正常發(fā)育必須的，敲除DNMT1的胚胎甲基化水平下降約70%，且胚胎不能正常發(fā)育[39]；胚胎期敲除DNMT3a的小鼠存活期僅為4周，而敲除DNMT3b的小鼠則不能存活[40]，這就表明DNA甲基化是發(fā)育必須的。Dawlaty等[41]通過(guò)敲除TET家族對(duì)應(yīng)基因，發(fā)現(xiàn)整體的5mC水平增加，也即甲基化水平程度增加；進(jìn)一步分析高甲基化的啟動(dòng)子與相應(yīng)下調(diào)的表達(dá)基因，表明表達(dá)下調(diào)的基因主要參與胚胎發(fā)育和分化，并顯著的富集于骨骼肌發(fā)育通路。由此可見(jiàn)，DNMT和TET可以通過(guò)影響甲基化和去甲基化狀態(tài)，調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響正常的發(fā)育過(guò)程，生肌過(guò)程也離不開(kāi)二者的共同參與。

3 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)肌肉DNA甲基化的影響

組織或細(xì)胞的發(fā)育離不開(kāi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，因而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)發(fā)育過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。近年來(lái)，關(guān)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)表觀遺傳修飾調(diào)控機(jī)體發(fā)育的研究逐漸增多，尤其是在胚胎發(fā)育及斷奶前這一階段，如母體蛋白水平、高脂飼糧、妊娠期營(yíng)養(yǎng)不平衡、過(guò)度采食等均會(huì)通過(guò)影響DNA甲基化水平造成子代發(fā)育不正常，并易患如糖尿病、肥胖癥、高血壓等疾病[42]。但是關(guān)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)肌肉發(fā)生過(guò)程中的DNA甲基化修飾的研究相對(duì)較少。在DNA甲基化過(guò)程中，甲基供體可由葉酸、蛋氨酸、膽堿、甜菜堿等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為前提物質(zhì)提供，進(jìn)而參與DNA甲基化水平調(diào)控；該過(guò)程還需要ATP的參與，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生ATP，也有可能影響甲基化過(guò)程。在去甲基化過(guò)程中，TET在參與去甲基化過(guò)程中需要三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物α-酮戊二酸參與。因而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能通過(guò)改變細(xì)胞代謝途徑進(jìn)而影響DNA甲基化過(guò)程。研究表明，在妊娠期蛋白限飼，可能會(huì)通過(guò)DNA甲基化修飾影響子代肌肉的氧化磷酸化，并造成肌肉功能紊亂[43]。在人類(lèi)的健康研究中指出，短期大量攝入脂肪，肌肉的DNMT3a和DNMT1的表達(dá)量卻顯著升高，DNA甲基化模式也有較大的改變，且這種改變的可塑性較差[44]。這表明成熟的肌細(xì)胞其甲基化狀態(tài)受營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的影響較大，并且這種影響具有較長(zhǎng)的持續(xù)性。Oster等[45]研究表明給妊娠期豬添加甲基供體如蛋氨酸、葉酸、膽堿、維生素B6等，能夠調(diào)控子代肌肉胰島素樣生長(zhǎng)因子途徑，提高子代初生重，同時(shí)也證實(shí)了子代的這種改變?cè)诩∪庵惺茱暭Z刺激的可塑性較差，可以長(zhǎng)時(shí)間的作用于子代發(fā)育。肌肉發(fā)育作為機(jī)體發(fā)育的一個(gè)重要組成部分，受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響較大，而目前關(guān)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)DNA甲基化途徑對(duì)肌肉發(fā)育造成的影響尚存在眾多未知，這方面的研究將有助于深入探究營(yíng)養(yǎng)對(duì)肌肉發(fā)育的影響，從而更好地調(diào)控肌肉發(fā)育。

4 小 結(jié)

肌肉發(fā)育過(guò)程中，DNA甲基化具有重要的調(diào)控作用。在甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的催化下，不同生肌階段細(xì)胞特異位點(diǎn)通過(guò)合理水平的DNA甲基化修飾，可以保證該過(guò)程重要基因表達(dá)的時(shí)間和空間的特異性，維持正常的生肌過(guò)程。但由于肌肉發(fā)育中的DNA甲基化水平是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，目前研究尚不完善，如生肌細(xì)胞分化過(guò)程中刺激產(chǎn)生甲基化和去甲基化的因子或信號(hào)，非CpG位點(diǎn)的甲基化對(duì)肌肉發(fā)育調(diào)控的作用，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)DNA甲基化調(diào)控肌肉發(fā)育等，均有待深入研究。而探究肌肉發(fā)育過(guò)程的表觀修飾，有助于進(jìn)一步精確的掌握肌肉發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，對(duì)動(dòng)物健康生長(zhǎng)發(fā)育及提高產(chǎn)肉量等也有促進(jìn)作用。

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*Corresponding author, professor, E-mail: luohailing@cau.edu.cn

(責(zé)任編輯 田艷明)

Advances on Regulation of DNA Methylation and Demethylation on Muscle Development

WANG Bo LUO Hailing*

(StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

Muscle development is a complicated biology process, which has remained largely unclear about its regulatory mechanism. The regulatory function in terms of epigenetic modifications on muscle development have turned into hot topic, and it was proved that DNA methylation and demethylation played a critical modulation role during myogenesis. Muscle stem cell specific-region modified by DNA methylation to regulate the myogenic process involves in affecting the key regulatory genes expression during muscle early development. This paper focused on the dynamic process of DNA methylation and demethylation during different stages of myogenesis, important methyltransferases and demethylases, effects of nutrition on muscle development by DNA methylation.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2622-2629]

DNA methylation; demethylation; myogenesis; enzymes; nutrient

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.002

2017-01-17

國(guó)家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-39)

王 波(1989—)，男，河南新縣人，博士研究生，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail: wangboforehead@163.com

*通信作者:羅海玲，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: luohailing@cau.edu.cn

S811

A

1006-267X(2017)08-2622-08