纖維蛋白原Bβ455G/A基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的相關(guān)性

秦曙光，田紅燕，張軍波，孟 燕

（1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安710004；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安710004）

·論著·

纖維蛋白原Bβ455G/A基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的相關(guān)性

秦曙光1，田紅燕2，張軍波2，孟 燕2

（1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安710004；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安710004）

目的 通過檢測(cè)深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）患者纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）Bβ-455G/A基因，分析其基因多態(tài)性與DVT的相關(guān)性。方法利用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性對(duì)2014年1月至2016年1月在西安交通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的、已確診為DVT的100例住院患者和同期門診體檢的100名健康人員，進(jìn)行FgBβ-455G/A基因型分析，并比較兩組血漿Fg濃度。結(jié)果DVT組FgBβ-455G/A基因多態(tài)性頻率及構(gòu)成比明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DVT組Fg濃度明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（3.85±1.44）g/Lvs.（2.80±0.71）g/L，P＜0.01］。方差分析結(jié)果示每種FgBβ455G/A基因型之間血漿中Fg濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論FgBβ455G/A基因多態(tài)性與DVT無明顯相關(guān)性。

深靜脈血栓形成；纖維蛋白原；基因多態(tài)性

深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）是一類致殘率及病死率均較高的血栓性疾病，其病因復(fù)雜，發(fā)生機(jī)制亦尚未明確［15］。纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）是重要的凝血因子，在凝血、血小板聚集、纖溶調(diào)節(jié)、動(dòng)脈硬化的發(fā)生及發(fā)展等諸多方面起著重要的作用。近年來，已見報(bào)道10多個(gè)Fgβ基因多態(tài)性位點(diǎn)，但這些基因多態(tài)性是否對(duì)血漿Fg濃度及血栓性疾病有影響卻存在爭(zhēng)議［6］。文獻(xiàn)報(bào)道FgBβ455G/AmRNA的合成是整個(gè)Fg分子合成的限速步驟［7］。大多研究表明，F(xiàn)gBβ-455G/A基因多態(tài)性與動(dòng)脈血栓性疾病具有密切相關(guān)性，但是對(duì)于FgBβ455G/A基因多態(tài)性與靜脈血栓類疾病的關(guān)系還知之甚少。本研究將對(duì)比分析DVT患者及健康對(duì)照者FgBβ455G/A基因多態(tài)性，探討DVT患者FgBβ455G/A基因多態(tài)性與DVT的相關(guān)性，為DVT易感人群的防治提供可能的理論依據(jù)。

1資料和方法

1.1一般資料

選擇2014年1月至2016年1月在西安交通大學(xué)附屬醫(yī)院住院的急性期、亞急性期DVT患者（即發(fā)病1個(gè)月內(nèi)）100例作為病例組，其中男47例，女53例，年齡（53.11±14.6）歲，以4070歲年齡段為發(fā)病高峰（占總DVT人數(shù)的72%）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）DVT經(jīng)過下肢深靜脈造影證實(shí)；（2）發(fā)病≤30 d；（3）病變部位為單側(cè)或雙側(cè)下肢；（4）肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）及下腔靜脈血栓形均經(jīng)過肺動(dòng)脈造影確診；（5）診斷符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)血管外科學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。選取同期門診體檢的100名健康人員為對(duì)照組，其中男55例，女45例，年齡（49.20±13.6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）肺、心、腹常規(guī)體檢及血液生化檢查無明顯異常；（2）無血栓類病史；（3）無心、腦、肝、腎等重要臟器疾病；（4）無血液、腫瘤、風(fēng)濕類風(fēng)濕疾病；（5）近期無感染手術(shù)外傷史；（6）Wells臨床評(píng)分［9］＜1。兩組研究對(duì)象在年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)量指數(shù)上比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有入組人員均為久居西安市區(qū)及周邊地區(qū)的漢族人，無血緣關(guān)系，且簽署知情同意書，并得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本收集用3.8%構(gòu)椽酸鈉抗凝，按照1∶9的比例抽取外周靜脈血6 mL，3 000 r/min離心，收集血漿于我院檢驗(yàn)科應(yīng)用大型血漿分析儀利用凝固法檢測(cè)血漿Fg濃度。

1.2.2抽提基因組DNA采用上海天根公司人全血DNA提取盒提??；樣本組DNA濃度均＞50 ng/μL，純度為1.751.90 μg/μL。

1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成：利用軟件PR IM ER 5.0和Hooft等［10］設(shè)計(jì)引物，委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。兩個(gè)基因位點(diǎn)的引物：上游引物序列為AAGAATTT GGGAATGCAATCTCTGCTACCT，下游引物序列為CTCCTCATTGTCGTTGACACCTTGGGAC。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系總體積 50 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL；DNA模板（500 ng/2 μL）2 μL；水21 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：93℃ 預(yù)變性 5 min；93℃ 變性 1 min；55℃退火1 min；72℃延伸2 min；共經(jīng)35個(gè)循環(huán)；72℃再次延伸5 min。

1.2.4限制性片段長度多態(tài)性酶切反應(yīng)體系共51 μL：PCR15 μL；Hea III10 U；Buffer 5 μL；水21 μL。上述成分混合后37℃酶切4 h；取10 μL酶切產(chǎn)物上1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.5電泳分析方法限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）電泳：酶切產(chǎn)物10 μL、10×Loading Buffer1 μL電泳，100 V電壓電泳20 min，溴化乙錠（EB）染色，紫外凝膠觀察并照相。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。基因頻率采用基因記數(shù)法，基因型和等位基因頻率比較采用卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，以（）表示，采用t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)（α=0.05），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組纖維蛋白原濃度比較

DVT組Fg濃度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（3.85±1.44）g/Lvs.（2.80±0.71）g/L，P＜0.01］。

2.2纖維蛋白原Bβ455G/A基因多態(tài)性酶切結(jié)果

將所有DNA樣本（共計(jì)200份）進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到一個(gè)1 300 bp的片段，有兩處HeaIII酶的酶切位點(diǎn)，電泳后發(fā)現(xiàn)3組酶切產(chǎn)物：AA型、AG型、GG型。AA型：酶切后有343 bp、958 bp兩條帶；AG型：酶切后有343 bp、383 bp、575 bp、95 bp共4條帶；GG型：酶切后有343 bp、383 bp、575 bp共3條帶；酶切電泳如圖1。

圖1 FgBβ-455G/A酶切電泳結(jié)果圖

2.3纖維蛋白原Bβ455G/A基因的HardyWeinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

DVT組AA、A/G、GG實(shí)際例數(shù)分別為11、48、41；A等位基因頻率為35%，G等位基因頻率為65%。對(duì)照組AA、A/G、GG實(shí)際例數(shù)分別為8、33、59；A等位基因頻率為24.5%，G等位基因頻率為75.5%。DVT組AA、A/G、GG預(yù)期頻率為12.25%、45.5%、42.25%；預(yù)期例數(shù)為12、46、42例。對(duì)照組中AA、A/G、GG預(yù)期頻率為6%、37%、57%；預(yù)期例數(shù)為6、37、57例。DVT組與對(duì)照組觀察值與期望值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），符合HardyWeinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，提示本組研究樣本具有群體代表性。

2.4纖維蛋白原Bβ455G/A基因頻率分布的分析結(jié)果

DVT組FgBβ455位點(diǎn)A等位基因分布頻率高于對(duì)照組；兩組FgBβ455G/A基因型頻率構(gòu)成、A等位基因及G等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 DVT組與對(duì)照組FgBβ-455G/A基因型分布比較 ［n（%）］

2.5纖維蛋白原Bβ455G/A基因多態(tài)性與血漿中纖維蛋白原濃度的關(guān)系

FgBβ455G/A基因型為AA的觀察者血漿中Fg濃度為（3.78±1.52）g/L，基因型為AG的觀察者血漿中Fg濃度為（3.37±1.12）g/L，基因型為GG的觀察者血漿中Fg濃度為（3.19±1.28）g/L。方差分析結(jié)果示每種基因型之間血漿中Fg濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且每兩種基因型之間血漿Fg濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具體如表2。

表2 不同F(xiàn)gBβ-455G/A基因多態(tài)性間Fg濃度比較［g/L，±s］

表2 不同F(xiàn)gBβ-455G/A基因多態(tài)性間Fg濃度比較［g/L，±s］

基因多態(tài)性AA AG GG n 11 48 41 Fg濃度3.78±1.52 3.37±1.12 3.19±1.28 P值0.193 0.339 0.059

3討論

本研究DVT患者共100例，其中混合型DVT共73例，構(gòu)成比明顯高于其他類型DVT，此構(gòu)成比與國內(nèi)多數(shù)研究相類似。本研究中，DVT組Fg濃度明顯高于對(duì)照組，認(rèn)為血漿Fg濃度升高可能參與了血栓事件的發(fā)生；結(jié)論同IIIRaga［11］相類似，認(rèn)為血漿Fg濃度的升高可能會(huì)增加靜脈血栓風(fēng)險(xiǎn)。考慮血栓事件風(fēng)險(xiǎn)的增加可能和Fg通過與血小板、紅細(xì)胞的相互作用，增高血液黏度；同時(shí)促發(fā)內(nèi)、外源凝血系統(tǒng)并降低纖溶活性有關(guān)［12］。

本研究DVT組及對(duì)照組基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，說明樣本具有一定的群體代表性；其中DVT組中AA及AG基因分布較對(duì)照組明顯升高，與呂柏楠等［13］研究認(rèn)為AA基因、A等位基因與DVT形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的結(jié)論相類似。其原因可能與Bβ455位點(diǎn)G基因突變?yōu)锳基因，F(xiàn)g分子結(jié)構(gòu)功能異常，機(jī)體凝血纖溶系統(tǒng)病理改變有關(guān)，使DVT風(fēng)險(xiǎn)增加。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)gBβ455G/A基因型AA、AG、GG患者Fg濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)論同張秀華等［14］報(bào)道相類似。然而，尚不能得出血漿FgBβ455G/A基因型AA、AG頻率與血漿Fg濃度具有相關(guān)性的結(jié)論，與Thomas和Kessler等［1516］研究報(bào)道結(jié)果類似。而Leiden的血栓形成傾向研究中報(bào)道Bβ-455A基因和靜脈血栓逆關(guān)聯(lián)，并且其基因型和血漿Fg濃度也沒有相關(guān)性。

綜合這些研究推測(cè)：FgBβ455G/A基因的突變可能與其他致病基因相關(guān)聯(lián)，而其本身并非血栓事件的致病基因；也可能通過這一基因的突變，使Fg凝血功能隨之變化，致使血栓事件風(fēng)險(xiǎn)增大，而并非通過升高其血漿濃度；與陳永玲等［17］DVT相關(guān)因子基因多態(tài)性相關(guān)研究結(jié)果類似。

綜上所述，F(xiàn)g基因多態(tài)性發(fā)生頻率升高對(duì)增加血栓事件風(fēng)險(xiǎn)的進(jìn)一步證實(shí)，也是對(duì)機(jī)體凝血機(jī)制的擴(kuò)充。但由于不同基因位點(diǎn)的作用機(jī)制不盡相同、基因之間交聯(lián)作用、相同位點(diǎn)的研究結(jié)果存在差異?？紤]到人種、遺傳、地域的差別以及生活環(huán)境等多方面因素的影響，要求我們?cè)谘芯繒r(shí)應(yīng)針對(duì)不同地域的人群進(jìn)行獨(dú)立分析，并擴(kuò)大樣本量，綜合分析各因素間的相互作用來得出客觀并且準(zhǔn)確的結(jié)論。Fg基因多態(tài)性及DVT的深入研究，有助于我們進(jìn)一步識(shí)別DVT的高危人群，對(duì)靜脈血栓性疾病進(jìn)行一級(jí)預(yù)防、指導(dǎo)用藥和預(yù)后評(píng)估。相信隨著對(duì)Fg基因多態(tài)性研究的不斷深入，以及對(duì)DVT認(rèn)識(shí)的逐步提高，必將改善其預(yù)防及治療的水平。

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Correlation between fibrinogen B β-455G/A polymorphism and deep vein thrombosis

QIN Shuguang1，TIAN Hong-yan2，ZHANG Junbo2，MENG Yan2
（1Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China；2Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

ObjectivesTo investigate the association between polymorphism of fibrinogen gene（Fg）Bβ455G/A and deep venous thrombosis（DVT）by detecting the Fgβ455G/A gene of patients with DVT.MethodsFrom January 2014 to January 2016，100 hospital patients with DVT were selected to case group，at the same time，100 volunteers who were healthy during health examination in The Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University constituted control groupAfter blood collection，the two groups were measured plasma concentration of Fg and then detected the FgB β455G/A polymor?phism by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism（PCRRFLP）ResultsPlasma con centration of Fg in case group was higher than that in control group［（3.85±1.44）g/Lvs.（2.80±0.71）g/L，P＜0.01］；FgBβ-455G/A genotypes and alleles frequency were higher in case group than the ones in control group（P＜0.05）Variance analysis indicated that plasma concentration of Fg among different FgBβ455G/A genotypes had no significant differences（P＞0.05）ConclusionFgBβ-455G/A gene polymorphism and DVT has no obvious correlation

deep venous thrombosis；fibrinogen；gene polymorphism

R543.6

A

10079688（2017）04043504

20160224）

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.04.19

秦曙光（1984），女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)樾难芗膊〉陌l(fā)病機(jī)理與臨床綜合治療。