雌激素對兔脊髓缺血再灌注損傷保護作用的機制研究

劉紅光，張超，曾愈程，劉芳，康穎

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫(yī)學院外科學教研室，湖南 衡陽 421001）

雌激素對兔脊髓缺血再灌注損傷保護作用的機制研究

劉紅光1，張超1，曾愈程1，劉芳1，康穎2

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫(yī)學院外科學教研室，湖南 衡陽 421001）

目的研究雌激素對脊髓缺血再灌注損傷保護作用的機制。方法按隨機數(shù)表字法把成年的新西蘭大白兔分為A～E 5組，每組9只。鉗夾腎下腹主動脈20 min恢復再灌注；B組，接受與A組同樣的麻醉和手術準備，但不行缺血/再灌注損傷；C組，再灌注開始時從兔耳的緣靜脈注射200μg/kg雌激素；D組，再灌注開始時從兔耳的緣靜脈注射400μg/kg雌激素；E組，再灌注開始時從兔耳的緣靜脈注射800μg/kg雌激素。再灌注48 h后根據(jù)Tarlov法對下肢的神經功能進行評分，然后取脊髓組織蘇木素-伊紅染色法（HE）進行病理分析。結果Tarlov評分中雌激素組的神經功能評分高于A組，與A組比較有統(tǒng)計學意義（<0.05）。組織病理表明脊髓的前角運動神經元出現(xiàn)凋亡，有顯著壞死。A組脊髓的前角運動神經元計數(shù)少于雌激素組，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（<0.05）。結論雌激素可明顯改善兔脊髓缺血再灌注的下肢神經功能，使脊髓的前角正常運動神經元的數(shù)量增加，減小缺血再灌注的損傷。

雌激素；脊髓缺血；再灌注損傷

臨床中在行脊髓手術或者腹主動脈瘤等手術時，需要對動脈進行阻斷，因此，會造成脊髓不同程度的缺血，或者發(fā)生神經功能的一過性障礙，甚至嚴重的患者還會表現(xiàn)出急性或者遲發(fā)性截癱[1-2]。為使患者得到有效治療，防治上訴情況的方法也成為目前的研究熱點與難點。雌激素對帕金森病、腦中風預后以及阿爾茨海默病有緩解作用，但對脊髓缺血再灌注損傷保護作用的機制報道很少[3-4]。本研究探討雌激素對兔脊髓缺血再灌注損傷的保護作用以及可能的機制，且初步研究使用的最佳劑量，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器

雄性新西蘭大白兔[動物許可證號：SCXK（湘）2010-0004，體重2.0～2.5 kg]45只，購自南華大學實驗動物中心。雌激素為新疆新姿源生物制藥有限責任公司產品，戊巴比妥鈉購自上海新亞藥業(yè)有限公司，甲醛溶液購自武漢佳華園化工有限公司，蘇木素-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）試劑盒購自天津百浩生物科技有限公司。溫度探頭購自北京精航遠洋科技有限公司，壓力傳感器購自上海狄佳傳感科技有限公司。手術器械：手術刀、手術剪、血管鉗、止血鉗、注射器、套管針及灌注針頭等。

1.2 模型的復制及分組

按隨機數(shù)表法把成年的新西蘭大白兔均分為A～E 5組，每組9只。A組單純阻閉腎下腹主動脈20 min，再灌注2 d；B組接受同樣的麻醉和手術準備，但不行缺血/再灌注損傷；C～E 3組，阻閉腎下腹主動脈20 min，再灌注開始時分別從兔耳的緣靜脈注射200、400及800μg/kg雌激素。

1.3 處理方法

所有的新西蘭大白兔在實驗的前晚僅給予飲水，飲水量不限，對其禁食。實驗前給予40 mg/kg戊巴比妥鈉（濃度：3%w/v）從兔的耳緣靜脈注射麻醉。術中按4 ml/（kg·h）的復方乳酸鈉給予維持。進行股動脈穿刺，股動脈壓的監(jiān)測采用壓力傳感器，脈率（pulse rate，PR）的讀取依據(jù)為壓力波形。溫度的監(jiān)測采用溫度探頭測量肛溫，術中使肛溫保持在38～39℃。抽取缺血前與缺血10 min及再灌注10 min的動脈血樣對血氧分壓（partial pressure of oxygen，PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（partial pressure of carbon dioxide in artery，PaCO2）、pH等進行測定。

1.4 復制兔脊髓缺血的模型

取兔的腹正中作為切口，剪開兔的皮膚與腹膜，其位置為劍突下兩指，使腹主動脈及其左側腎臟暴露出來，腹主動脈的阻閉選擇在左腎動脈的分支下0.8 cm之處，恢復再灌注的時間為阻閉后20 min。腹主動脈阻閉前5 min耳緣靜脈給予150 u/kg肝素鈉預防血栓形成，檢查腹腔無出血，逐層縫合腹壁，0.25%布比卡因浸潤鎮(zhèn)痛，移除所有套管針，肌內注射慶大霉素40 000 u以預防感染。術后動物室溫下蘇醒后返回飼養(yǎng)籠觀察至再灌注后48 h術后動物自由飲水，術后8 h恢復自由飲食。對于術后截癱的動物，必要時擠壓下腹部人工輔助排尿。阻閉成功的標志為股動脈的壓力波形消失，遠端的動脈壓力值平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）≤10 mmHg。開放時的標準為股動脈的壓力波形恢復。

1.5 后肢運動的功能評分

手術結束后恢復兔的飲食自由。再灌注后2 d，對兔的后肢運動進行功能評分，評分根據(jù)Tarlov標準進行：4分表示后肢的功能恢復完全，可以正常行走；3分表示能夠站立但是不能夠行走；2分表示無法站立但是后肢能夠自由活動；1分表示能夠觀察到關節(jié)的自主活動；0分表示未能夠觀察到下肢的活動[5]。

1.6 病理學觀察

兔在再灌注2 d完成神經功能的評分后，給予40 mg/kg戊巴比妥鈉靜脈注射進行深麻醉，然后自胸骨處剪開胸腔，使心臟暴露出來，把灌注針頭插入到兔的自主動脈根部并用1 000 ml生理鹽水進行灌注，用10%的500 ml甲醛溶液滴注固定組織。灌注固定完成之后，從背側使脊髓暴露出來，并取出腰膨大（L5～L7）部位的脊髓組織，放在10%的甲醛溶液中浸泡過夜。24 h后乙醇脫水變干后，石蠟包埋。沿冠狀切面切成6μm厚的脊髓組織，把蠟膜除去后，進行常規(guī)的蘇木精伊紅染色。病理學的改變在200倍的顯微鏡下進行觀察。胞核的固縮或者溶解是損傷及其壞死神經元的表現(xiàn)，胸漿的染色呈嗜伊紅，尼氏體在胞漿中消失，部分細胞有明顯程度固縮紅染。正常的神經元為多角形的結構，胞核具有清晰的結構，胞漿中存在尼氏體。病理的損傷程度根據(jù)脊髓前角的正常神經元計數(shù)進行評定。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）來表示，比較做單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兔缺血前后的生理學指標比較

對A～E 5組的脊髓缺血的過程各組的MAP、PaO2、PaCO2、pH、肛溫等指標，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間如動脈阻斷前、阻斷期、再灌注10 min的MAP、PaO2、PaCO2、pH、肛溫等指標的水平值比較，差異無統(tǒng)計學意義（=3.236、2.874、2.998、1.092和4.367，=0.092、0.104、0.101、0.145和0.078）；②A～E 5組間的MAP、PaO2、PaCO2、pH、肛溫等指標的水平值比較，差異有統(tǒng)計學意義（=9.127、6.238、8.945、5.376和7.921，=0.000、0.024、0.005、0.031和0.007）；③A～E 5組間的MAP、PaO2、PaCO2、pH、肛溫等指標的水平值的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（=11.147、9.538、8.905、8.376和10.921，=0.000、0.000、0.003、0.006和0.000），見表1。

表1 兔缺血前后的生理學指標比較

2.2 兔后肢運動的功能評分比較

A～E 5組在4、8、12、24和48 h的運動功能評分比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點運動功能評分比較差異有統(tǒng)計學意義（=11.379，=0.000）；②A～E 5組間的運動功能評分比較差異有統(tǒng)計學意義（=12.098，=0.000）；③A～E 5組間的運動功能評分的水平值變化趨勢有統(tǒng)計學意義（=19.013，=0.000），見表2。

2.3 病理學結果

再灌注48 h后，A組脊髓前角的光鏡觀察中正常的神經元數(shù)量減少，神經細胞發(fā)生嚴重的缺血變性壞死，胞漿中可見深色的陽性染色產物，細胞核發(fā)生固縮，核仁消失，空泡出現(xiàn)在細胞周圍。E組中箭頭所指為細胞核形態(tài)，可見形態(tài)正常，細胞核的核仁清晰可見。而C組照片中由于神經細胞發(fā)生嚴重的缺血變性壞死，箭頭所指為細胞核發(fā)生固縮，核仁消失，空泡出現(xiàn)在細胞周圍（見附圖）。A組正常的神經元數(shù)量低于E組（=6.475，=0.000）（見表3）。E組有較多的正常運動神經元，胞體的形狀呈多角形，有較為清晰的核仁，有清晰的胞漿尼氏體。

表2 兔后肢運動的功能評分（=9，分，±s）

表2 兔后肢運動的功能評分（=9，分，±s）

組別48 h A組1.18±0.561.05±0.210.99±0.130.76±0.090.88±0.12 B組4.00±0.004.00±0.004.00±0.004.00±0.004.00±0.00 C組1.83±0.441.63±0.231.78±0.231.70±0.231.73±0.23 D組1.97±0.431.89±0.361.88±0.341.98±0.372.00±0.34 E組2.67±0.552.90±0.683.09±0.713.12±0.592.88±0.644 h8 h12 h24 h

附圖再灌注48 h兔的脊髓前角光鏡圖（×200）

表3 再灌注48 h后脊髓前角的正常運動神經元計數(shù)的比較（=9±s）

表3 再灌注48 h后脊髓前角的正常運動神經元計數(shù)的比較（=9±s）

組別A組B組正常神經元計數(shù)13.65±4.37 89.37±19.37 C組32.48±8.34 D組35.19±9.37 E組42.18±10.14值76.298值0.000

3 討論

近年來，關于雌激素的研究越來越多。有研究發(fā)現(xiàn)17B-雌二醇能夠有效地降低血漿的肌酸磷酸激酶以及乳酸脫氫酶和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，并能降低MDA的活性減輕缺血再灌注的損傷，雌激素對缺血再灌注損傷具有很明顯的保護作用。

本實驗的研究結果顯示，在再灌注剛開始時，經過兔耳緣給予200、400和800μg/kg雌激素靜脈注射，劑量的增加能夠增加兔脊髓前角正常運動的神經元數(shù)目，對兔缺血后造成的下肢功能障礙有明顯的改善效果，可以緩解兔脊髓缺血后再灌注造成的損傷[6-7]。

組織器官的再灌注以后氧自由基的損傷，于再灌注區(qū)的中性粒細胞會發(fā)生聚集，很多細胞因子以及炎癥介質發(fā)生釋放，其內皮細胞發(fā)生腫脹進而導致微循環(huán)發(fā)生障礙，NO以及內皮素的比例失調，NF-kB的作用以及其他因素被認為是缺血再灌注后發(fā)生組織損傷的重要原因。而雌激素可以降低髓過氧化物酶的活性來降低中性粒細發(fā)生胞聚集的程度。進而導致對脊髓的缺血再灌注損傷形成保護作用。

本研究的病理研究結果發(fā)現(xiàn)，A組脊髓前角中嗜伊紅染色壞死神經元的數(shù)量很大，雌激素治療后減少了壞死神經元。C組與D組脊髓前角的正常運動神經元與E組比較差異有統(tǒng)計學意義，神經功能的評分結果也得出一致的結論。說明800μg/kg體內可能發(fā)揮出了比較強的生物學作用，相關的參考文獻也顯示[8-9]，暫時臨時的使用該劑量的雌激素沒有明顯的副作用發(fā)生。因此，此劑量可以作為下一步進行雌激素作用機制深入研究的劑量。

脊髓組織缺血會導致三磷酸腺苷的數(shù)量減少是脊髓缺血再灌注損傷機制的主要體現(xiàn)，使細胞膜的離子泵功能發(fā)生衰竭[10-11]。鈉離子發(fā)生內流導致細胞出現(xiàn)水腫，溶酶體發(fā)生破裂導致谷氨酸等的興奮性氨基酸增加其釋放量，鈣離子大量內流出現(xiàn)鈣超載，使多種酶類被激活，引起大量的自由基生成，進而發(fā)生嚴重的炎癥反應，最后細胞組織出現(xiàn)水腫性破壞致使血管痙攣阻塞，組織的缺血再灌注損傷由此形成。相關文獻報道[12]，雌激素能夠對局部炎癥反應進行緩解，使抗凋亡的系統(tǒng)得到激活。

雌激素對神經的保護作用可能通過線粒體途徑參與。線粒體作為細胞的氧化磷酸化主要場所，是細胞的能量加工廠，死亡扳機點是細胞功能衰竭的原因[13-14]。再灌注出現(xiàn)后，大量的氧自由基會在線粒體內產生，對細胞的呼吸鏈造成破壞，使細胞出現(xiàn)能量衰竭導致死亡。本研究發(fā)現(xiàn)應用雌激素治療的兔缺血脊髓在勻漿后檢查，超氧化物歧化酶的活性顯著上升，歧化酶是細胞中主要抗氧化酶以及自由基的清除劑，水平出現(xiàn)降低，表明對組織細胞的保護受毒性氧自由基損傷效能降低[15-16]。進而雌激素對兔脊髓缺血再灌注損傷的作用可能與歧化酶水平的增加密切相關，清除過多的氧自由基使損傷得以減輕，其保護作用得到發(fā)揮[17-18]。下一步更深入的研究，可以從細胞體內的兩個層面開展，對雌激素保護作用和線粒體的損傷關系進行研究[19]。

綜上所述，雌激素可明顯改善兔脊髓缺血再灌注的下肢神經功能，使脊髓的前角正常運動神經元的數(shù)量增加，減少缺血再灌注的損傷。

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（張蕾編輯）

Protective effect of estrogen on spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits

Hong-guang Liu1,Chao Zhang1,Yu-cheng Zeng1,Fang Liu1,Ying Kang2
(1.Department of Breast and Thyroid Surgery,the First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Surgery,School of Medicine,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo evaluate the protective effect of estrogen on spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits and its mechanism.MethodsAccording to a random number table method,adult New Zealand rabbits were divided into A-E five groups with 9 in each group.In the rabbits of group A,infrarenal aorta was clamped for 20 min and then blood circulation was restored(reperfusion).The rabbits of group B

the same anesthesia and surgery as group A,but no ischemia-reperfusion injury.The rabbits of groups C,D and E had injection of estrogen 200,400 and 800 μg/kg respectively through ear veins when reperfusion started.The neurological function of the lower extremities was scored according to Tarlov law 48 h after reperfusion.Then hematoxylin-eosin staining was used for pathological analysis of spinal cord.ResultsThe neurological function scores of the groups C,D and E were significantly higher than those of the group A(<0.05).Histopathological study showed apoptosis and marked necrosis of the motor neurons in the anterior horn of the spinal cord.The number of anterior horn motor neurons in the group A was significantly smaller than that of the estrogen groups(<0.05).ConclusionsEstrogen can significantly improve the neurological function of the lower limbs of rabbits with spinal cord ischemia and reperfusion,increase the number of normal motor neurons in the anterior horn of the spinal cord,and reduce ischemia-reperfusion injury.

estrogen;spinal cord ischemia;reperfusion injury

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.006

1005-8982（2017）16-0030-05

R-332

A

2016-12-08