直噴離子化質(zhì)譜簡單快速鑒別關(guān)木通

張朝輝+谷陟欣+劉婧靖+陳應(yīng)莊+陳波+馬銘

摘 要 采用直噴離子化質(zhì)譜技術(shù)，通過對關(guān)木通的敞開式質(zhì)譜輪廓分析，對關(guān)木通和其它兩種木通（木通、川木通）進行了快速鑒別，建立了關(guān)木通中木蘭花堿的快速測定方法。結(jié)果表明，可以利用標志性成分木蘭花堿對馬兜鈴科關(guān)木通進行鑒別； 同時，在正離子模式下，以荷葉堿為內(nèi)標，木蘭花堿與內(nèi)標的信號強度比與木蘭花堿標準溶液的濃度，在0.50～20.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9989，檢出限為0.1 mg/L。 本方法簡單、快速、無需樣品前處理，可用于有毒藥材關(guān)木通的直接、原位、快速分析和鑒定。本研究結(jié)果對木通中藥材的質(zhì)量控制具有重要參考價值。

關(guān)鍵詞 直噴離子化質(zhì)譜； 關(guān)木通； 木蘭花堿； 馬兜鈴酸A

1 引 言

木通為常用中藥，可分為木通、川木通與關(guān)木通，歷史上三者被允許混用。雖然傳統(tǒng)上它們統(tǒng)稱為木通，但三者來源不同，木通屬于木通科，川木通屬于毛茛科，關(guān)木通屬于馬兜鈴科[1]。丁林生等[2，3]對關(guān)木通的化學成分進行研究，發(fā)現(xiàn)其含馬兜鈴酸和木蘭花堿等成分。關(guān)木通中含有的馬兜鈴酸A會引起人體腎臟損害，屬“有毒”類中藥，已于2003年被取消了用藥標準。但由于歷史遺留問題以及木通資源短缺等原因，關(guān)木通在市場上作為木通、川木通的替代品的現(xiàn)象屢禁不止。因此，建立一種快速、簡單的關(guān)木通、木通和川木通的鑒別方法至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的鑒別木通方法主要是根據(jù)3種藥材外觀性狀的異同，依靠經(jīng)驗進行區(qū)分，鑒別結(jié)果不夠準確。謝麗莎等[4]利用紫外光譜組法對3種木通進行了鑒別，但是它們的紫外吸收光譜很接近，需先求得吸光系數(shù)再根據(jù)吸光系數(shù)的差異進行鑒別； 李睿等[5]采用近紅外漫反射光譜法對3種木通進行了鑒別，但該方法需要經(jīng)二階導數(shù)處理后建立聚類分析模型； 孫萍等[6]利用LC-MS技術(shù)對3種木通進行了鑒定，但需要經(jīng)過繁瑣的樣品前處理過程，有機溶劑消耗大、操作繁瑣費時。

敞開式質(zhì)譜技術(shù)作為一種快速分析技術(shù)，具有無需或僅需簡單的樣品前處理、可實現(xiàn)樣品原位分析等優(yōu)點[7～9]。自2004年Cooks等[10]提出該技術(shù)以來，得到了迅速發(fā)展。直噴離子化技術(shù)是敞開式質(zhì)譜技術(shù)的一種，由于它具有簡單、易操作、溶劑消耗少等特點，近年來被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、藥品及公共安全等領(lǐng)域[11～13]。然而，利用直噴離子化技術(shù)直接鑒別3種木通的研究還未見文獻報道。

本研究采用直噴離子化質(zhì)譜技術(shù)，通過對關(guān)木通的敞開式質(zhì)譜輪廓進行分析，提出了將木蘭花堿作為關(guān)木通標志性成分進行鑒別的方法，并采用荷葉堿作為內(nèi)標，對關(guān)木通中的木蘭花堿含量進行了半定量測定。本方法簡單、快速、靈敏，對木通的真?zhèn)舞b別，尤其是有毒中藥材關(guān)木通的鑒別具有重要意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Thermo Finnigan-LCQ離子阱質(zhì)譜，配LCQ-tune工作站（英國菲尼根公司）； 高壓直流電源（天津東文高壓電源有限公司）； LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）； 高速萬能粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）； KQ3200E型超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）； 噴霧濾紙購買于沃特曼公司。

馬兜鈴酸A和荷葉堿對照品（中國藥品生物制品檢定所）； 木蘭花堿對照品（上海源葉生物科技有限公司）； 甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，購于國藥集團； 實驗用水為二次蒸餾水。木通科木通、毛茛科川木通、馬兜鈴科關(guān)木通等藥材均由九芝堂藥學專家提供并進行鑒定。

2.2 質(zhì)譜條件

實驗采用ESI離子源正離子模式，掃描范圍m/z 100～1000； 無需氣體； 噴霧電壓：+3.50 kV； 毛細管錐孔電壓：10 V； 源溫度：250℃。二級質(zhì)譜碰撞能量：30%。

2.3 實驗方法

直噴離子化技術(shù)主要在一個三角形濾紙（或其他小尖端物體）上進行：少量樣品被提前加在濾紙（或其它小尖端物品）上，再用少量溶劑濕潤樣品載體或樣品本身，施加高壓，此時樣品被離子化，進入質(zhì)譜儀。此技術(shù)分為樣品裝載、分離、離子化3個過程。直噴離子化示意圖如圖1。為了保證結(jié)果的重現(xiàn)性和準確性，濾紙或樣品尖端距質(zhì)譜入口的距離固定在5～10 mm左右。實驗中，液體樣品的進樣采用紙噴霧方式，固體樣品的進樣采用直接噴霧方式。

2.4 木蘭花堿紙噴霧半定量分析

標準曲線的繪制：采用荷葉堿作為內(nèi)標，以木蘭花堿與荷葉堿的信號強度比作為縱坐標，木蘭花堿標準溶液的濃度作為橫坐標建立標準曲線。木蘭花堿的系列標準溶液濃度分別為0.50、1.00、5.00、10.00和20.00 mg/L，內(nèi)標荷葉堿的含量均為4 mg/L。用沃特曼濾紙做載體，取15 μL混合標準溶液進行噴霧分析。

樣品溶液的處理：稱取關(guān)木通藥材粉末0.4 g， 加入20.00 mL無水乙醇（含冰乙酸0.50 mL），浸泡0.5 h，超聲提取0.5 h，2000 r/min離心15 min，取上清液，加入計算量的內(nèi)標溶液，最后用甲醇稀釋至20 mL（內(nèi)標荷葉堿的含量為4 mg/L）。

3 結(jié)果與討論

3.1 木通、川木通與關(guān)木通藥材直接噴霧分析

在2.2節(jié)質(zhì)譜條件下，對3種木通藥材進行了直接噴霧和一級全掃描質(zhì)譜分析（圖2）。由圖2可知，在關(guān)木通的質(zhì)譜中可以明顯觀測到m/z 342.08強峰，而木通、川木通在上述特征峰位置均無相應(yīng)的峰出現(xiàn)。

3.2 關(guān)木通的特征峰分析

3.2.1 標準溶液紙噴霧分析 根據(jù)關(guān)木通中特征峰m/z 342.08的信息，推測此特征峰可能為馬兜鈴酸A （C17H11NO7，分子量341.27 ）或木蘭花堿（C20H24NO+4，分子量342.41）。為此，在同樣質(zhì)譜條件下，對兩種物質(zhì)的標準溶液進行了紙噴霧質(zhì)譜分析。由圖3B可知，馬兜鈴酸A一級質(zhì)譜主要質(zhì)譜峰為[M+NH4]+（m/z 358.95）離子、[2M+NH4]+（m/z 699.76）離子和[2M+Na]+（m/z 704.83）離子，其中[2M+Na]+離子為基峰，在m/z 342處沒有相應(yīng)的分子離子峰，此結(jié)果與文獻報道吻合[14] 。而木蘭花堿的一級質(zhì)譜在m/z 342處有很強的峰 （圖3A）。

3.2.2 m/z 342紙噴霧二級質(zhì)譜分析 為了進一步驗證關(guān)木通中的m/z 342峰的歸屬，對關(guān)木通提取液和木蘭花堿標準溶液中m/z 342峰進行了紙噴霧二級質(zhì)譜分析。由圖4可知，兩者的碎片幾乎完全一樣，各碎片離子的相對豐度也基本一致，且都以m/z 297.07為基峰，由此可以證明，關(guān)木通藥材中的m/z 342.08峰確為木蘭花堿。

3.2.3 關(guān)木通中馬兜鈴酸A和木蘭花堿成分的液相色譜分析 為了驗證關(guān)木通中的馬兜鈴酸A和木蘭花堿成分，同時利用液相色譜進行了結(jié)果驗證，結(jié)果見圖5。比較標準溶液和提取液的液相色譜分析結(jié)果及各峰相應(yīng)的紫外圖譜可知，關(guān)木通中確實存在馬兜鈴酸A和木蘭花堿成分。

然而，關(guān)木通的敞開式質(zhì)譜直噴測定結(jié)果中，并沒有發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸A的特征離子，究其原因，馬兜鈴酸A加合離子多，敞開式質(zhì)譜響應(yīng)靈敏度較低。另一方面，從木蘭花堿（5 mg/L）和馬兜鈴酸A（10 mg/L）混合標準溶液的一級質(zhì)譜圖（圖6）可見，木蘭花堿的存在干擾了馬兜鈴酸A的響應(yīng)。

由于木蘭花堿的質(zhì)譜響應(yīng)好，壓低了馬兜鈴酸A的信號，從譜圖上只能見到木蘭花堿的峰，而見不到馬兜鈴酸A的峰。由此可見，利用馬兜鈴酸A難以進行關(guān)木通的鑒定，相反，采用響應(yīng)信號好的木蘭花堿進行鑒別，可以獲得更可靠的關(guān)木通鑒定結(jié)果。

3.3 關(guān)木通中木蘭花堿的半定量分析

因馬兜鈴酸A和木蘭花堿分子量相近，紫外響應(yīng)也很接近，相互干擾測定。采用敞開式質(zhì)譜分析方法，可以去除關(guān)木通中馬兜鈴酸A的干擾，對其中的木蘭花堿進行半定量測定。以荷葉堿為內(nèi)標，以木蘭花堿與內(nèi)標的信號強度比為縱坐標，木蘭花堿標準溶液的濃度為橫坐標建立線性關(guān)系，在 0.50～20.00 mg/L范圍內(nèi)測得兩者線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達到0.9989，檢出限為0.1 mg/L，對1.00、5.00和10.00 mg/L 3個濃度水平的木蘭花堿平行測定，測得木蘭花堿濃度的RSD<5%。

按照2.4節(jié)進行樣品處理，平行6次，測得關(guān)木通提取液中木蘭花堿的平均含量為984.3 μg/g，RSD為4.7%。說明本方法可用作關(guān)木通中木蘭花堿半定量分析的依據(jù)。本方法在無需樣品預(yù)處理的情況下，能夠根據(jù)木蘭花堿快速鑒別關(guān)木通，并且檢測結(jié)果穩(wěn)定，具有較好的重復(fù)性。

4 結(jié) 論

采用直噴離子化質(zhì)譜檢測技術(shù)，在無需樣品預(yù)處理的前提下，通過對關(guān)木通藥材進行直噴分析，分析了其中馬兜鈴酸A和木蘭花堿的敞開式質(zhì)譜，獲得了其正離子模式下的指紋圖譜，找出了其中的標志性成分木蘭花堿，建立了快速檢測關(guān)木通中木蘭花堿的半定量分析方法，可成功應(yīng)用于有毒藥材關(guān)木通與木通、川木通的鑒別。本方法簡單、快速、準確，為中藥材的質(zhì)量控制提供了參考。

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