L—谷氨酰胺對麻瘋樹再生不定芽生根效果的影響

劉穎 唐家年 黃川騰 劉國選 林詩婉 高美芳 吳東霖 陳建平

摘要 [目的]建立促進麻瘋樹再生不定芽生根的組培體系。[方法] 通過在誘導麻瘋樹再生不定芽分化生根的培養(yǎng)基（MS+0.3 mg/L IBA）中添加一定濃度的L-谷氨酰胺（Gln）來達到促進芽條生根的效果。[結果] 在誘導麻瘋樹再生不定芽分化生根的培養(yǎng)基中添加20 mg/L Gln，可以顯著提高芽條的生根率，生根率可達40%～50%。同時，可以在短時間內(nèi)就獲得較高的生根率，顯著縮短了獲得完整植株的周期。此外，還減少了生根過程中常見的再生植株葉片發(fā)黃、容易脫落現(xiàn)象的發(fā)生，顯著提高了所獲得的再生完整植株的質量。[結論] 麻瘋樹生根培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為添加0.3 mg/L IBA和20 mg/L Gln的MS培養(yǎng)基，應用該研究建立的組培體系可顯著改善麻瘋樹再生不定芽的生根效果。

關鍵詞 麻瘋樹；L-谷氨酰胺；再生不定芽；生根

中圖分類號 S184；Q949.9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0125-05

Effect of L-Glutamine on the Rooting of Regenerated Shoot Buds of Jatropha curcas

LIU Ying1，TANG Jia-nian1，HUANG Chuan-teng2，CHEN Jian-ping3* et al （1.Faculty of Agricultural Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088；2.Hainan Provincial Forestry Institute，Haikou，Hainan 571100；3.Faculty of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective] To establish a tissue culture system for promoting rooting of regenerated buds of Jatropha curcas.[Method] L-glutamine （Gln） was added into rooting medium （MS+0.3 mg/L IBA） for improving the rooting efficiency of regenerated buds of J.curcas.[Result]When 20 mg/L Gln was supplemented into rooting medium，the rooting efficiency of regenerated shoot buds could be significantly increased （raised up 40%-50%）.In addition，satisfactory rooting rate was obtained in a short time （10～20 days），and the cycle of gaining a complete plant was shortened significantly.Moreover，reducing the chances of this happening that the leaves were easy to be yellowing and fall down from regenerated plants in the process of rooting，and then the quality of regenerated whole plants was obviously improved.[Conclusion] The optimal combination of rooting medium was MS medium supplemented with 0.3 mg/L IBA and 20 mg/L Gln.The rooting effect of regenerated buds of J.curcas could be significantly enhanced via application of the tissue culture system established in this study.

Key words Jatropha curcas；L-glutamine；Regenerated shoot buds；Rooting

麻瘋樹（Jatropha curcas L.）又名小桐子、黃腫樹，為大戟科（Euphorhiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）多年生的落葉灌木或小喬木[1]。麻瘋樹原產(chǎn)于中美洲，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]，在我國主要生長在四川、云南、貴州、廣東、廣西、海南和臺灣等省（區(qū)）。麻瘋樹組織提取物中的毒蛋白、麻瘋酮等活性成分可以被開發(fā)為藥物，常用于消腫散淤、清熱解毒等，近年來還發(fā)現(xiàn)這些物質具有顯著的抗癌活性[3-4]，還可用于生物病蟲害防治[5]。麻瘋樹種子含油量高達40%～60%，提取的種子油可用于生產(chǎn)優(yōu)質的“生物柴油”[6-8]，有利于緩解當前全球石油能源短缺的問題。麻瘋樹被認為是一種重要的可再生能源，受到世界各國科學家的廣泛關注[7-8]。然而，麻瘋樹生長區(qū)域有限以及種子產(chǎn)量低限制了麻瘋樹生物柴油產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。通過遺傳改良可以提高麻瘋樹種子含油量以及改變油脂的組分，增強麻瘋樹的抗病害能力和對環(huán)境的適應能力，擴大其種植面積[9]。

目前，植物遺傳改良主要是采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化，但是進行此類遺傳轉化，需要一個良好的植株組織培養(yǎng)再生體系。植物組織培養(yǎng)技術在麻瘋樹的遺傳改良和良種繁育方面得到了廣泛應用?，F(xiàn)已建立起來的誘導麻瘋樹再生不定芽生根的方法仍然存在芽條生根效率低、再生不定根的質量較差、所獲得再生植株生長狀態(tài)不佳、整個培養(yǎng)周期較長等缺點，難以滿足實際應用的需要。

L-谷氨酰胺（Gln）是一種在植物生命活動中起著重要作用的氨基酸。它是構成蛋白質的基礎氨基酸，又是合成含氮生物物質的氮源，與組織生長和發(fā)育有著密切的關系。在不同植物組織中Gln具有不同的代謝作用，起著非常重要的生理作用。Gln常常被當作有機氮源應用于植物組織培養(yǎng)[10]。許多研究結果表明，培養(yǎng)基中添加適宜濃度的Gln可以改善外植體的再生效果[11-13]。還有研究報道，培養(yǎng)基中添加一定濃度的Gln可能會對一些植物再生不定芽的生根產(chǎn)生積極作用[14-16]。截至目前，關于Gln對麻瘋樹再生不定芽分化生根影響的研究鮮見報道。該研究通過添加一定濃度的Gln來考察其誘導麻瘋樹再生不定芽生根效率的影響，為解決麻瘋樹再生不定芽生根困難提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料

研究采用的麻瘋樹種子（M-19）均采自海南省海口市東山林場[17]。將這些種子剝殼后進行表面滅菌，在培養(yǎng)基上進行12 d萌發(fā)培養(yǎng)后，從實生苗上獲得子葉葉柄外植體[18-21]。

1.2 試驗方法

1.2.1 Gln母液的配制。準確稱取一定量的Gln粉末，用去離子水充分溶解后，再用去離子水定容，配制成2 mg/mL的Gln母液。使用前用0.22 μm的水系濾膜對已配制好的Gln母液進行過濾滅菌。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

該研究所有試驗都是在相同培養(yǎng)環(huán)境下進行。培養(yǎng)基均使用1 mol/L NaOH溶液調整pH至5.8～6.0，然后在121 ℃，0.1 MPa的條件下高壓滅菌20 min。組織培養(yǎng)室培養(yǎng)條件為光照強度2 000 lx、光照時間12 h/d和培養(yǎng)溫度（25±1）℃。在無特殊說明情況下，所用培養(yǎng)基均添加了100 mg/L肌醇、3%蔗糖和0.6%瓊脂。

1.2.3 麻瘋樹再生不定芽的獲取。采用實驗室已報道的方法[18-21]，利用高濃度TDZ溶液誘導麻瘋樹子葉葉柄外植體再生不定芽，從而獲得大量優(yōu)質的麻瘋樹再生不定芽，然后將帶有再生不定芽的外植體接種至添加了0.5 mg/L BA（芐氨基腺嘌呤）、0.2 mg/L KT（激動素）、0.4 mg/L GA3（赤霉素）和0.2 mg/L IAA（吲哚乙酸）的MS培養(yǎng)基上進行15 d不定芽伸長培養(yǎng)，之后從培養(yǎng)瓶中取出高度大于1 cm且至少有2個伸展葉片的不定芽外植體，用滅過菌的手術刀對伸長的再生不定芽進行橫向切割，切去其他部分，只保留長度約為1 cm的不定芽芽條。注意切割的方向與伸長的再生不定芽的中軸相垂直，切口平齊。

1.2.4 麻瘋樹再生不定芽生根培養(yǎng)。

1.2.4.1 采用傳統(tǒng)方法誘導麻瘋樹再生不定芽生根。將獲取芽條以豎插方式（使芽條的中軸與培養(yǎng)基表面相垂直，芽條的形態(tài)學下端插入培養(yǎng)基中的深度為0.2～0.4 cm）接種至6種傳統(tǒng)生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)10、20、30、40 d后分別統(tǒng)計再生不定芽的生根情況[22]。

6種生根培養(yǎng)基分別為無激素MS培養(yǎng)基[23]，無激素1/2MS培養(yǎng)基[24]，添加了3.0 mg/L IBA（吲哚丁酸）、1.0 mg/L IAA和1.0 mg/L NAA（萘乙酸）的1/2MS培養(yǎng)基[25]，添加了0.1 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基[24]，添加了1.0 mg/L NAA的1/2MS培養(yǎng)基[23]，添加了0.5 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基[26]。

1.2.4.2 采用在培養(yǎng)基中添加Gln的方法誘導麻瘋樹再生不定芽生根。將獲取芽條以豎插方式（使芽條的中軸與培養(yǎng)基表面垂直，芽條的形態(tài)學下端插入培養(yǎng)基中的深度為0.2～0.4 cm）分別接種至添加了0、5、10、20、40、80、160 mg/L Gln和0.3 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)10、20、30、40 d后分別統(tǒng)計再生不定芽的生根情況。

1.2.5 麻瘋樹再生植株的馴化移栽。

從培養(yǎng)瓶中小心取出麻瘋樹再生小植株，在自來水下洗去植株根部所帶有的培養(yǎng)基后，將其種植在已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基質（土∶沙礫=1∶1）中，保鮮膜覆蓋保濕培養(yǎng)14～21 d后，將植株移栽至盛有土壤的培養(yǎng)盆中繼續(xù)生長。

1.2.6 試驗結果記錄與數(shù)據(jù)處理。該研究所有試驗處理均重復3次，每個重復包括30個外植體，試驗數(shù)據(jù)均用3次重復的平均值±標準差（SD）表示。數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和鄧肯多重比較。

2 結果與分析

2.1 采用傳統(tǒng)方法誘導麻瘋樹再生不定芽生根的效果

將獲取芽條以豎插方式接種至6種傳統(tǒng)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)10、20、30和40 d后進行生根效果統(tǒng)計。由表1可知，在6種誘導芽條生根培養(yǎng)基中，誘導芽條生根效果最好的是添加了0.5 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基，芽條在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，生根率為18.07%，平均每個芽條上的根數(shù)為2.61條，平均根長為2.27 cm，都為最大值；而培養(yǎng)30 d后，其生根率為16.15%，平均每個芽條上的根數(shù)為2.56條，平均根長為2.14 cm（圖1Ⅵ），所獲得的結果與40 d時都沒有差異顯著性。因此為了縮短培養(yǎng)時間，更快地獲得再生植株，采用30 d的培養(yǎng)時間為宜。芽條在無激素培養(yǎng)基（MS和1/2MS）中都不能產(chǎn)生不定根（圖1Ⅰ和Ⅱ），而在添加較高濃度生長素的培養(yǎng)基（1/2MS+3.0 mg/L IBA+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA、1/2MS+1.0 mg/L NAA和1/2MS+0.1 mg/L IAA）上生根率較低（圖1Ⅲ～Ⅴ），這說明添加過高濃度的生長素會對芽條生根產(chǎn)生一定的抑制作用。此外，在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，采用常見生根培養(yǎng)基來誘導麻瘋樹再生不定芽生根，培養(yǎng)后所獲得完整植株上的葉片容易發(fā)黃甚至脫落。

綜上所述，采用傳統(tǒng)方法誘導麻瘋樹再生不定芽生根的效果不佳，存在生根率較低、培養(yǎng)周期較長、生根質量較差、難以獲得生長狀態(tài)良好的再生植株等問題。

2.2 Gln對麻瘋樹再生不定芽生根效果的影響

將獲取芽條以豎插方式接種至添加了0.3 mg/L IBA和0、5、10、20、40、80、160 mg/L Gln的MS培養(yǎng)基以及2組對照培養(yǎng)基CK1（無激素MS培養(yǎng)基）和CK2（僅添加20 mg/L Gln的MS培養(yǎng)基）上培養(yǎng)，培養(yǎng)10、20、30、40 d后分別統(tǒng)計再生不定芽的生根情況。由表2可知，在未添加Gln的生根培養(yǎng)基中，誘導芽條生根的效果較差，生根率最高為21.52%；而在添加Gln的生根培養(yǎng)基中，隨著添加Gln的濃度提高，芽條生根率先增加，到20 mg/L時，芽條的生根效果最佳，生根率最高為49.32%，平均每個芽條上的根數(shù)最多為6.52條，平均根長最長為5.15 cm，繼續(xù)提高Gln的濃度，芽條的生根效果變差，生根率降低，到160 mg/L時，生根率最高僅為13.62%，平均每個芽條上的根數(shù)最多為2.02條，平均根長最長為2.18 cm。由此可見，在培養(yǎng)基中添加Gln的濃度太低或者太高都不利于芽條不定根再生，Gln的最適添加濃度為20 mg/L。

培養(yǎng)時間為10 d時，芽條在添加10～40 mg/L Gln的生根培養(yǎng)基中，生根率為23.36%～29.31%，特別是在添加了20 mg/L Gln的生根培養(yǎng)基中芽條的生根效果最佳，生根率最大為29.31%，平均每個芽條上的根數(shù)為2.26條，平均根長為1.32 cm（圖1Ⅶ）；而此時芽條在未添加Gln的生根培養(yǎng)基中的生根效果不佳，生根率僅為8.53%，平均每個芽條上的根數(shù)為1.32條，平均根長為0.65 cm。隨著培養(yǎng)時間的延長，芽條的生根率也逐漸增加，然而當培養(yǎng)時間達30 d后，繼續(xù)增加培養(yǎng)時間，芽條的生根率并沒有顯著增加（圖1Ⅷ）。

此外，芽條在無激素MS培養(yǎng)基上不能再生出不定根，并且芽條的生長狀態(tài)不佳，葉片易發(fā)黃；而在只添加了20 mg/L Gln的MS培養(yǎng)基上生根效果也非常差，生根率最高僅為12.32%，平均每個芽條上的根數(shù)為1.67條，平均根長為1.79 cm，此時芽條的生長狀態(tài)也不好，葉片難以繼續(xù)伸展（表1、2）。

綜上所述，麻瘋樹再生不定芽在添加20 mg/L Gln的培養(yǎng)基中的生根效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法，且在較短時間內(nèi)（10 d）就可以達到較好的生根效果，生根率最高為29.31%，最后還可以獲得生長狀態(tài)良好的再生植株（圖1Ⅸ）。

3 結論與討論

麻瘋樹再生不定芽條存在生根難的問題，嚴重阻礙了其組培再生和遺傳轉化的研究進展。生長素是誘導芽條生根的強效激素[27-28]。IBA是一種常見的生長素，常被用于誘導再生不定芽生根。在對麻瘋樹葉柄外植體再生不定芽進行生根誘導時，IBA也是一種常見的生長素，常被用于誘導芽條不定根再生[29-30]。該研究結果表明，雖然麻瘋樹再生不定芽在添加0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基中可以形成不定根，但是生根效果較差，生根率最高僅為22.76%。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，伸長芽條上的葉片容易發(fā)黃甚至脫落，并且這種現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生在將麻瘋樹再生芽轉移至生根培養(yǎng)基中進行生根誘導培養(yǎng)時[31-32]。

Gln作為一種參與植物新陳代謝的重要內(nèi)源性氨基酸組分，是合成生物體內(nèi)極其重要的抗氧化劑還原型谷胱甘肽的前體物質，是構成蛋白質中氨基酸和合成含氨生物物質的氮源，與組織生長和修復有密切的關系，在生命活動中起重要作用[33]，并且常常被當作一種有機氮源添加到植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中[10]。有很多研究表明，在培養(yǎng)基中添加Gln可以提高外植體的再生效率和外植體的生物量[34-36]。氮的濃度和銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的相對含量可能對植物細胞的生長和形態(tài)建成起著至關重要的作用[37-38]。雖然使用添加了氨基酸或者水解蛋白的培養(yǎng)基來促進外植體增殖的報道比較常見，但是氨基酸是如何影響離體器官發(fā)生的機理還不清楚。還有些研究結果表明，在培養(yǎng)基中添加Gln可以影響多種植物再生不定芽的生長效果，如Kaur等[39]在誘導兒茶[Acacia catechu（Linn.f.） Willd]再生不定芽生根時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加150 mg/L Gln，可以明顯緩解芽條上葉片易發(fā)黃和脫落的現(xiàn)象，但是并沒有探究Gln對芽條生根效率的影響。

該研究結果表明，麻瘋樹再生不定芽在未添加IBA的MS培養(yǎng)基上沒有不定根再生發(fā)生，而在添加了IBA的培養(yǎng)基上有不定根發(fā)生，說明IBA對于芽條再生不定根發(fā)生可能是必須的，然而芽條在只添加了0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基上雖然可以生根，但是生根效果較差，葉片容易發(fā)黃甚至脫落；如果在添加了0.3 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基中再添加一定濃度的Gln，芽條的生根效率會有顯著提高并且葉片可以保持鮮綠，但是芽條在僅添加20 mg/L Gln而沒有添加IBA的MS培養(yǎng)基上的生根效果非常差，由此可以說明Gln對芽條生根具有促進作用并且芽條上葉片生長的改善作用可能是由于Gln與IBA的協(xié)同作用所產(chǎn)生的效果。

此外，該研究還發(fā)現(xiàn)采用傳統(tǒng)方法對麻瘋樹再生不定芽進行不定根誘導時，對芽條的質量要求較高，一般是要求芽條的長度至少達2 cm，帶有3～4個葉片[40-41]，這在一定程度上減少了可以用于進行生根培養(yǎng)的芽條數(shù)量，因而會減少獲得完整再生植株的數(shù)量；而采用在生根培養(yǎng)基中添加適宜濃度Gln的方法可以促使質量較差、長度約為1 cm且只帶有2～3個葉片的芽條生根，這在一定程度上提高了可以用于生根培養(yǎng)的再生不定芽的利用效率，最終可以增加獲得完整再生植株的數(shù)量。如果將此方法應用于麻瘋樹的遺傳轉化，可能會提高獲得完整轉化苗的效率。在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，添加了適宜濃度Gln的試驗組中的芽條培養(yǎng)30 d后，不僅生根效果良好，所獲得再生植株的生長狀態(tài)也良好，葉片鮮綠。另外，對于那些沒有生根的芽條還可以將其接種至添加了20 mg/L Gln的生根培養(yǎng)基上進行再次生根培養(yǎng)，這樣可以提高芽條的利用效率，增加完整再生植株的數(shù)量。

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