中藥降糖復(fù)方水提取物對KKAy糖尿病小鼠糖基化終末端產(chǎn)物及氧化應(yīng)激的影響

洪金妮　黎巍威　富宏　王學美

[摘要]研究中藥降糖復(fù)方水提取物對KKAy小鼠AGEs和RAGE的影響。將自發(fā)性2型糖尿病模型KKAy小鼠隨機分成5組：模型組、二甲雙胍組、中藥降糖復(fù)方低、中、高劑量組。另外，C57BL/6J小鼠作為正常對照組。其中二甲雙胍組灌胃鹽酸二甲雙胍250 mg·kg-1；中藥降糖復(fù)方低、中、高劑量組分別灌胃水提取物2，4，8 g·kg-1；正常對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，共12周。實驗過程中分別對小鼠血清中及（或）尿液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酐（creatinine，Cr）、血清尿素氮（urea nitrogen，BUN）、糖基化終末端產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）及糖基化終末端產(chǎn)物受體（receptor of glycation end products，RAGE）等進行檢測。于灌胃12周后處死小鼠，取小鼠腎臟做病理切片及免疫組化，同時取腎組織做蛋白印記法Western blot、熒光實時定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA檢測AGEs，RAGE，過氧化氫酶（Catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等氧化應(yīng)激指標。該研究證實中藥降糖復(fù)方水提取物能在一定程度上改善KKAy小鼠腎功能（P<005），緩解糖尿病腎病，猜測其機制可能與降低體內(nèi)AGEs和RAGE，抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]2型糖尿?。?糖基化終末端產(chǎn)物； 糖基化終末端產(chǎn)物受體； 氧化應(yīng)激

[Abstract]To elucidate the efficacy of Jiangtang decoction（JTD） on AGEsRAGE and oxidative stress in type 2 diabetic model KKAy mice Fifty KKAy mice were randomly divided into 5 groups as follows： model group， metformin group， lowdose， mediumdose and highdose of JTD group， with 10 C57BL/6J as normal group All groups are orally administrated with equal distilled water， 250 mg·kg-1metformin hydrochloride， 2， 4，8 g·kg-1JTD， equal distilled water respectively， once per day for 12 weeks Alanine aminotransferase（ALT）， creatinine（CREA）， urea nitrogen（BUN），advanced glycation end products（AGEs） and receptor of glycation end products（RAGE） in blood or urine were measured during the experiments Furthermore， on the day of the sacrifice， kidney was collected， and electronic microscopy and immunohistochemistry were performed to evaluate the protective renal effect of JTD In addition， the levels of AGEs， RAGE， Catalase（CAT） and superoxide dismutase（SOD） were assessed by Western blot， Realtime PCR or ELISA to analyze the efficacy of JTD This study demonstrated that JTD might protect kidney of KKAy by downregulating the expression of AGEs， RAGE and oxidative stress

[Key words]type 2 diabetes； AGEs； RAGE； oxidative stress

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是繼心血管疾病和腫瘤之后第三大非傳染性疾病，其并發(fā)癥遍及全身各個器官。糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，在我國發(fā)生率高達25%～40%[1]，但其治療手段仍十分有限。中藥降糖復(fù)方是北大醫(yī)院王學美教授臨床上治療T2DM的常用方，由地錦草、黃連、黃芪、丹參、知母等配伍組成，清熱活血、益氣養(yǎng)陰。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方可有效降低患者空腹及餐后血糖，降低患者尿蛋白，減少西藥服用量，服用安全。但中藥降糖復(fù)方是否能夠改善腎功能，及其中的機制有待進一步研究。本文通過研究中藥降糖復(fù)方水提取物對KKAy小鼠血尿液生化，AGEs，RAGE，氧化應(yīng)激指標及腎臟病理等的影響，探討其對2型糖尿病引起的糖尿病腎病的療效及作用機制，為中藥降糖復(fù)方的研發(fā)提供思路。

1材料

11動物健康C57BL/6J小鼠10只，雄性，9周齡，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）20120001；自發(fā)2型糖尿病模型KKAy小鼠50只，雄性，9周齡，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）20140004。C57BL/6J小鼠普通飼料飼養(yǎng)；KKAy小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）20140008。所有動物均自由飲水，在室溫（22±1） ℃，12 h光照周期，SPF環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。尾尖取血測小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥70 mmol·L-1或隨機血糖≥111 mmol·L-1或即視為糖尿病模型。

12藥物地錦草Euphorbiae Humifusae Herba，丹參Salvia miltiorrhiza，生黃芪Astragali Radix，知母Anemarrhena asphodeloides Bge，黃連Coptidis Rhizoma生藥均購自北京大學第一醫(yī)院中藥房。藥物比例為3∶4∶2∶2∶1，取處方量藥材，加7倍量水，浸泡1 h，加熱回流提取2次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮，干燥，得到水提取物。用雙蒸水配置成生藥濃度為生藥02，04，08 g·mL-1備用。取鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）1 g溶于40 mL雙蒸水中，制成25 g·L-1的陽性給藥液，灌胃體積均為001 mL·g-1體重。

13試劑及儀器糖基化終末端產(chǎn)物AGEs酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（abbexa，abx054078，批號L201610A346）；糖基化終末端產(chǎn)物受體RAGE酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D，MRG00，批號P103593）；AGEs抗體（abcam，ab23722，批號GR2867061）；RAGE抗體（abcam，ab3611，批號GR2887402）；GAPDH（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TA08，批號16AF0411）；兔抗山羊二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，L3032，批號8715）；鼠抗山羊二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，L3012，批號8715）；Trizol （ambion，15596018，批號144303） ；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，4368814，批號00463285）；第一鏈cDNA合成試劑盒（ Thermo scientific，4472908，批號1610048）；7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）；Infinite M200酶標儀（瑞士TECAN公司）；VELOCITY18R型離心機（澳大利亞 Dynamica公司）；MB1002A型微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；ES1100（長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；OLYMPUS DP70纖維數(shù)碼相機（日本PLYMPUS公司）；日立7180生化全自動分析儀；日立7600生化全自動分析儀。

2方法

21分組及給藥將KKAy小鼠隨機分成5組，分別為模型組、二甲雙胍組、中藥降糖復(fù)方低、中、高劑量組，每組10只，以C57BL/6J小鼠為正常對照組。其中二甲雙胍組灌胃鹽酸二甲雙胍（250 mg·kg-1體重），中藥低、中、高劑量組分別按2，4，8 g·kg-1體重灌胃中藥降糖復(fù)方水提取物。正常對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，共12周。

22血樣收集及檢測給藥12周后，小鼠內(nèi)眥取血，用ELISA法檢測血清中AGEs和RAGE的含量，按照相關(guān)說明書操作；血清送到北京大學第一醫(yī)院檢驗科，采用日立7180全自動生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量。

23尿樣收集及檢測收集小鼠24 h尿液，4 500 r·min-1離心10 min，送到北京大學第一醫(yī)院檢驗科，采用日立7180全自動生化分析儀和日立7600全自動生化分析儀檢測尿肌酐、尿素氮、尿微球蛋白。

24腎臟病理檢查（電鏡和免疫組化）灌胃12周后，動物處死，取小鼠一側(cè)腎皮質(zhì)放置于3%戊二醛固定，送到北京大學第一醫(yī)院電鏡室做病理切片；取另一部分腎臟，4 ℃生理鹽水沖洗，10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片，梯度脫蠟至水，隨后做AGEs和RAGE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Olympus DY07顯微鏡觀察腎臟形態(tài)學變化。

25Western blot檢測腎臟組織中AGEs和RAGE蛋白表達取100 mg腎臟加入1 mL蛋白裂解液，于冰上充分研磨混勻，進行蛋白定量，并配平。取蛋白樣品15 μL，在電泳槽中進行聚丙烯酰胺電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%PBS封閉1 h，加入相對應(yīng)的一抗，其中AGEs和RAGE均是1∶1 000稀釋，GAPDH 1∶1 500稀釋，于4 ℃搖床中過夜，TBST洗膜10 min/次×3次，二抗室溫搖床孵育2 h，TBST再次洗膜10 min/次×3次，化學發(fā)光法成像。蛋白含量用Image J軟件進行定量分析，以AGEs/GAPDH和RAGE/GAPDH表示蛋白相對表達量。

26實時熒光定量PCR檢測腎臟組織中RAGE，SOD和CAT mRNA的表達用Trizol提取腎臟組織中的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA，用7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行實時定量，反應(yīng)體系如下：SYBR Green mix 10 μL，雙蒸水8 μL，上下游引物各05 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10 μL。擴增反應(yīng)程序設(shè)置如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，重復(fù)5次。將待測基因與內(nèi)參GAPDH的比值的均數(shù)作為待測基因mRNA的相對表達量，結(jié)果采用2ΔΔCt計算。引物序列見表1。

27統(tǒng)計學方法采用SPSS 200軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用±s表示，計量資料采用單因素方差分析并做多重比較，P<005為具有統(tǒng)計學差異。

3結(jié)果

31通過電鏡觀察中藥降糖復(fù)方對腎臟的影響通過電鏡（×1萬）可以觀察到，正常對照組的基底膜（白色箭頭）較完整，足突細胞（黑色箭頭）排列較整齊，足突細胞融合面積較??；模型組中可見基底膜結(jié)構(gòu)不完整，足突細胞排列非常不整齊，同時出現(xiàn)大面積融合；而陽性藥組及各給藥組可見，與模型組相比，基底膜相對完整，足突細胞排列相對整齊，足突融合面積較小，見圖1。給藥12周后，復(fù)方能在一定程度上緩解基底膜增厚，且成一定的濃度依賴性。說明中藥降糖復(fù)方在一定程度上能改善腎組織形態(tài)學，見表2。

32對KKAy小鼠肝腎功能的影響所有入選KKAy小鼠均已成模，模型組的KKAy的血糖在造模成功后一直處于高血糖狀態(tài)。與對照組相比，給藥組對小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的影響沒有顯著性差異，說明藥物無明顯的肝功能損害，見圖2A。與對照組相比，給藥12周后，二甲雙胍及各中藥組均能在一定程度上降低尿液中的尿素氮，其中中藥低濃度的效果最好（P<001），見圖2B；與對照組相比，給藥12周后，中藥給藥組能降低尿中的肌酐值，且低濃度和高濃度中藥組的效果優(yōu)于二甲雙胍組（P<005），見圖2C；與對照組相比，給藥12周后，二甲雙胍及各給藥組均能降低小鼠尿液中的微球蛋白/肌酐比值，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0001），見圖2D。綜上，說明中藥降糖復(fù)方水提取物無明顯的肝功能損害，能在一定程度上改善KKAy糖尿病小鼠的腎功能。

33通過免疫組化觀察中藥降糖復(fù)方對腎臟中AGEs和RAGE沉積的影響通過AGEs染色，可觀察到模型組中腎小球可見大量AGEs沉積，在腎小管也可見部分沉積，而正常對照組和給藥組中，AGEs沉積情況相對緩解，見圖3A；通過計算發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，中藥降糖復(fù)方各組AGEs陽性率較低，具有統(tǒng)計學差異（P<0001），見圖3B。通過RAGE染色，可觀察到模型組中RAGE在腎小管大量沉積，在腎小球也可見部分沉積，而正常對照組和給藥組中RAGE沉積情況相對緩解，見圖3A；通過Imageproplus軟件計算光密度平均值發(fā)現(xiàn)，給藥后中藥降糖復(fù)方各組RAGE陽性率較模型組有所降低（P<0001），且成一定劑量依賴性，見圖3C。說明中藥降糖復(fù)方水提取物能在一定程度上減少糖尿病腎病小鼠腎臟中AGEs及RAGE沉積。

34中藥降糖復(fù)方對KKAy小鼠血清及腎組織中AGEs和RAGE的影響通過ELISA可見，與對照組相比，在給藥12周后，二甲雙胍及各給藥組均能降低血清中的AGEs含量，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0001，P<001），見圖4A；給藥12周后，二甲雙胍及各給藥組均能降低腎組織中的AGEs含量，且降低效果成一定濃度梯度（P<001，P<005），見圖4C。與對照組相比，在給藥12周后，二甲雙胍及各給藥組均能降低血清及腎組織中的RAGE含量，見圖4B，D，其中中藥中劑量、高劑量對血清中RAGE的影響的差異具有統(tǒng)計學意義（P<005）。綜上可見中藥降糖復(fù)方能在一定程度上降低KKAy小鼠血清及腎組織中AGEs和RAGE。

進一步，通過Western blot和熒光實時定量PCR發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在給藥12周后，二甲雙胍及各給藥組均能明顯降低腎臟組織中AGEs/GAPDH，差異成一定濃度梯度，且具有統(tǒng)計學意義（P<0001），見圖5B；二甲雙胍及各給藥組也能降低腎臟組織中RAGE/GAPDH，低劑量組具有統(tǒng)計學差異（P<005），見圖5C；進一步通過實時定量PCR檢測證實，二甲雙胍及各給藥組也能降低腎臟組織中RAGE/GAPDH mRNA（P<0001），見圖5D。綜上可見，中藥降糖復(fù)方給藥12周能有效降低KKAy糖尿病小鼠血清及腎組織中的AGEs及RAGE含量。

35中藥降糖復(fù)方對KKAy小鼠SOD和CAT等氧化應(yīng)激指標的影響通過熒光實時定量PCR檢測小鼠腎臟組織的SOD和CAT等抗氧化指標發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組SOD和CAT mRNA明顯

下降。與模型組相比，給藥12周后，二甲雙胍及各給藥組能在一定程度上上調(diào)小鼠的SOD和CAT mRNA水平，且成一定的劑量依賴性，見圖6。

4討論

DN是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制復(fù)雜，AGEs途徑是糖尿病的經(jīng)典學說之一。已知葡萄糖可與各種蛋白質(zhì)通過非酶促糖基化反應(yīng)生成AGEs。近年來研究認為腎臟局部堆積的AGEs可通過多種途徑，直接和間接參與DN的發(fā)生發(fā)展。一方面AGEs與其受體RAGE結(jié)合可以改變蛋白結(jié)構(gòu)功能，降低酶活性，引起基質(zhì)蛋白交叉連接，導(dǎo)致腎臟細胞功能異常、組織結(jié)構(gòu)異常，另一方面AGEs與受體RAGE結(jié)合后可通過激活NFκB信號通路引起炎癥因子如IL6，TNFα等的釋放，損傷腎臟組織。在糖尿病患者的腎臟中AGEs的大量聚集，刺激系膜細胞表面的AGEs 受體，使層黏連蛋白及其他腎小球系膜結(jié)構(gòu)蛋白明顯增加，最終致系膜區(qū)擴張，腎小球基膜增厚，加速腎小球硬化。

可見AGEs和RAGE在糖尿病腎病病理發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[2]。目前研究認為氧化應(yīng)激反應(yīng)和活性氧簇增多在DN的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。2003年韓國漢城舉行的“活性氧和糖尿病腎病 DN”專題論壇中提出糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學說[3]，認為經(jīng)典的糖尿病并發(fā)癥的多元醇途徑、AGEs途徑、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）途徑和氨基己糖途徑均是高糖環(huán)境下線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多的結(jié)果，即氧化應(yīng)激是高糖損傷的共同基礎(chǔ)。

DN治療手段十分有限，主要通過控制飲食、控制血糖血脂血壓、使用血管緊張素酶抑制劑/血管緊張素受體阻滯劑等，延緩疾病進展效果有限，DN是導(dǎo)致終末期腎衰竭的首要原因之一[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學證實，炎癥因子及促炎因子與DN的發(fā)病過程密切相關(guān)，并認為DN是一種炎癥性疾病[5]。清熱解毒中藥可能通過抑制炎癥因子，AGEs，RAGE，改善脂代謝紊亂，進而降低血糖、改善DN癥狀、保護腎功能，改善微循環(huán)[67]。近年來，隨著2型糖尿病炎癥機制研究的不斷深入，其“熱毒”病機與清熱解毒治法在臨床中的應(yīng)用得到重視，以劉完素、施今墨為代表的等大家均重視應(yīng)用清熱解毒法治療糖尿病[89]。中藥降糖復(fù)方以“熱毒”立論，由地錦草、丹參、黃芪、黃連、知母等中藥組方，清熱活血、益氣養(yǎng)陰，其中地錦草性平，味辛微苦澀，清熱解毒，利濕降濁，活血涼血，與黃連共為君藥；丹參為臣，活血散瘀，清心除煩，輔君降濁化瘀；知母清熱養(yǎng)陰，黃芪補脾益氣，共為佐使。

本研究通過動物實驗，觀察中藥降糖復(fù)方水提取物對自發(fā)2型糖尿病KKAy小鼠腎功能，腎臟形態(tài)學，AGEs，RAGE，CAT，SOD等氧化應(yīng)激指標的影響。實驗結(jié)果顯示，中藥降糖復(fù)方水提取物無明顯的肝功能損害，能在一定程度上改善KKAy小鼠血清和尿液中肌酐、尿素氮、微球蛋白/肌酐比值等腎臟相關(guān)指標，同時通過電鏡發(fā)現(xiàn)中藥降糖復(fù)方能在一定程度上緩解足細胞壞死、結(jié)構(gòu)紊亂，改善基底膜增厚，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)復(fù)方能減少腎臟組織中AGEs和RAGE的沉積，同時上調(diào)組織中CAT，SOD等抗氧化應(yīng)激指標mRNA的表達，提示中藥降糖復(fù)方水提取物可改善KKAy小鼠糖尿病腎病的機制可能與降低體內(nèi)AGEs和RAGE，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

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[責任編輯張寧寧]