淺談全自動免疫組化儀的制片質(zhì)量與細(xì)節(jié)

黃凌艷 福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院病理科 （福建 龍巖 364000）

淺談全自動免疫組化儀的制片質(zhì)量與細(xì)節(jié)

黃凌艷 福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院病理科 （福建 龍巖 364000）

隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的進(jìn)步，全自動免疫組化儀在臨床中的應(yīng)用也日益廣泛，全自動免疫組化儀能夠有效提高免疫組化染色結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，但由于受各種因素影響，全自動免疫組化儀在自動染色過程中也可能出現(xiàn)一些假象，降低染色結(jié)果準(zhǔn)確性。因此，本文就全自動免疫組化儀的制片質(zhì)量以及相關(guān)細(xì)節(jié)等進(jìn)行了分析探討，從而提高全自動免疫組化儀的制片質(zhì)量。

全自動 制片質(zhì)量 免疫組化儀 相關(guān)細(xì)節(jié)

全自動免疫組化儀在應(yīng)用過程中不可避免會出現(xiàn)一些假象，影響結(jié)果可靠性，因而本文以羅氏benchmark XT全自動免疫組化儀為例，總結(jié)了其應(yīng)用過程中的經(jīng)驗教訓(xùn)和應(yīng)注意的細(xì)節(jié)，從而提高全自動免疫組化儀的制片質(zhì)量，具體如下。

1.標(biāo)本處理與蠟塊選擇相關(guān)細(xì)節(jié)

操作過程中，保障抗原的完整性和不彌散極為重要，抗原完整是試驗成功的重要前提，所以高度注重該細(xì)節(jié)。對于已經(jīng)細(xì)胞壞死或丟失抗原的材料，無論怎么操作都無法取得好的染色效果。另外，在實施組織處理時，應(yīng)充分固定組織，以免因為組織固定不符合要求而影響組織的染色特性。除了標(biāo)本處理外，組織蠟塊處理也極為重要，在良好組織固定的基礎(chǔ)上，應(yīng)給予規(guī)范的組織脫水、浸透等處理，以免因處理不當(dāng)導(dǎo)致組織蠟塊出現(xiàn)染色假象。所以，對于全自動免疫組化儀來說，理想的免疫組化蠟塊，在具有檢測腫瘤成分的同時，還應(yīng)具備內(nèi)對照的正常組織成分。

2.組織切片處理相關(guān)細(xì)節(jié)

在對組織切片進(jìn)行處理的過程中，褶皺、刀痕、折疊以及氣泡等都有可能導(dǎo)致切片的厚度不均勻，出現(xiàn)非特異性染色現(xiàn)象，所以在處理組織切片時，切片的厚度以3～4μm為宜，63～65?C烤片2h左右，合理控制溫度，若溫度過高也會影響抗原保存[1]。另外，應(yīng)徹底清除石蠟，若對石蠟清除不徹底也會干擾或抑制抗原與抗體的結(jié)合。如下圖1所示，脫蠟不徹底或有油泡殘留在載玻片上都會影響抗體的均勻分布，進(jìn)而對抗原和抗體的結(jié)合造成影響，從而出現(xiàn)不顯色或染色不均等情況。因此，為防止出現(xiàn)載玻片親油情況，除選擇帶正電荷防脫載玻片外，在組織切片和烤片結(jié)束前，應(yīng)將切片在5%～10%的牛奶溶液中浸泡15～20min，然后將其放入洗潔精稀溶液中蕩去殘留奶液，并用清水洗凈。為保障浸泡效果，應(yīng)及時更換新鮮牛奶，合理控制牛奶濃度。

圖1. 石蠟清除不徹底或殘留油污的影響

3.染色前相應(yīng)準(zhǔn)備細(xì)節(jié)

在開展染色工作前，應(yīng)打印清晰的檢測項目條碼標(biāo)簽，將其張貼在玻片上，將標(biāo)簽表面水分擦干，檢查儀器運(yùn)行情況，確保儀器能夠正常運(yùn)行。在實施染色前，應(yīng)對玻片進(jìn)行檢查，對試劑管口的半月形液面進(jìn)行檢查，正確安裝AFM，及時將液面中的氣泡除去，檢查接口環(huán)有沒有扣緊，對各種散裝試劑進(jìn)行檢查，如緩沖液、脫蠟試劑、修復(fù)液以及封蓋油膜等，及時檢查廢液桶清空和各管道通暢情況，在檢查確認(rèn)儀器各環(huán)節(jié)無誤后，再運(yùn)行染色程序。

4.染色程序運(yùn)行細(xì)節(jié)

在運(yùn)行染色程序時，由于受各種因素影響，通常會有報警現(xiàn)象發(fā)生，對于各種報警應(yīng)及時給予有效處理。經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)是機(jī)器自身原因，應(yīng)首先查看是否為加熱板問題，及時安排專業(yè)工程師對其進(jìn)行維修。在同一次染色過程中，全自動免疫組化儀無法同時運(yùn)行兩種一抗滴定方式，只能運(yùn)行手工滴定和或自動滴定中的一種，所以如果選擇一抗手工滴定程序應(yīng)及時根據(jù)提示進(jìn)行滴加。在實施滴加操作前應(yīng)對組織切片進(jìn)行檢查，觀察其是否存在油污和油泡等情況，及時發(fā)現(xiàn)前期處理不當(dāng)玻片并給予補(bǔ)救[2]。盡量提高抗體工作液低溫儲存的時間，改善抗體工作液的穩(wěn)定性。與手工染色高溫修復(fù)溫度相比，全自動免疫組化儀的修復(fù)溫度相對較高，可達(dá)99.5?C，因此應(yīng)盡可能選擇對溫度要求不高且具有較高特異性的單克隆號抗體為一抗。

5.抗體檢測程序細(xì)節(jié)

在應(yīng)用全自動免疫組化儀檢測的過程中，“Protocol”的制定極為重要，Ultraview通用DAB檢測試劑盒，主要通過莧紫媒染劑和萘酚實現(xiàn)染色。因此，在使用這種方法對各種抗體進(jìn)行檢測時，必須實施多次預(yù)實驗，嚴(yán)格按照各步驟要求控制孵育的溫度，明確孵育過程中存在的干擾因素，從而選擇出適合每種抗體的理想“Protocol”，通常情況下，標(biāo)記目標(biāo)抗體強(qiáng)表達(dá)，同時背景表達(dá)低表達(dá)是最理想的結(jié)合[3]。檢測過程中，由于修復(fù)過度或不正確修復(fù)都會導(dǎo)致非特異染色，從而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。另外，還應(yīng)注意熱處理的對檢測結(jié)果的影響，雖然熱處理可以在一定程度上加速化學(xué)反應(yīng)，但同時也會導(dǎo)致染色強(qiáng)度降低，從而使得檢測結(jié)果發(fā)生假陰性的機(jī)率升高[4]。全自動免疫組化儀應(yīng)用過程中，還應(yīng)嚴(yán)格按照要求設(shè)置對照，通過觀察陰陽組織切片情況，對組織切片檢測結(jié)果進(jìn)行分析。在確保染色質(zhì)量和檢測結(jié)果真實性的條件下，可對染色程序進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)和調(diào)整。孵育時間或修復(fù)時間延長，并不一定可以提高抗體的陽性率，應(yīng)盡量避免選用高溫42?C孵育或超長修復(fù)，37?C孵育時間盡量控制在1h內(nèi)，常溫孵育時間應(yīng)在1h以上。

6.儀器維護(hù)相關(guān)細(xì)節(jié)

為保障檢測的效果，還應(yīng)注重對儀器的清洗和維護(hù)，熟悉儀器的性能，在日常工作結(jié)束后，及時按照清洗程序?qū)ζ溥M(jìn)行清洗，對各AFM試劑瓶的清潔情況進(jìn)行檢查，及時對其進(jìn)行消毒處理并風(fēng)干。將500mL稀釋消毒滅菌液倒入AFM試劑瓶內(nèi)，將其充分搖勻，使其附著于容器表面并靜置幾分鐘后，適用蒸餾水將其徹底洗凈。切片托盤的清洗應(yīng)使用消毒滅菌溶液擦洗，讓滅菌液在電熱板表面停留約10min后洗凈[5]。將一定量的濃縮消毒滅菌放入空桶中，對廢液桶進(jìn)行清洗，使用200mL濃縮液，并將其與“花王”牌消毒液和蒸餾水混合，共增加至3000L，能夠?qū)x器設(shè)備起到較好的消毒滅菌效果。對于儀器設(shè)備，應(yīng)每隔3個月進(jìn)行一次全面的消毒滅菌，每半年應(yīng)進(jìn)行一次全面維護(hù)[6]。在使用或維護(hù)儀器時，應(yīng)嚴(yán)格按照要求操作，輕柔裝卸試劑桶。

7.總結(jié)

總而言之，全自動免疫組化儀能夠極大地增強(qiáng)染色結(jié)果的可靠性，在應(yīng)用過程中，應(yīng)做好各細(xì)節(jié)準(zhǔn)備工作，加強(qiáng)質(zhì)量管理，從而有效提高全自動免疫組化儀的制片質(zhì)量，充分發(fā)揮其應(yīng)用價值。

[1] 周建云, 何松, 劉玉山, 等. 全自動免疫組化染色儀染色失敗的常見原因及改進(jìn)措施[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2013,29(3):345-346.

[2] 張富琴, 張玉蘭, 南海燕, 等. 全自動免疫組化染色儀的應(yīng)用體會[J]. 診斷病理學(xué)雜志, 2013,20(12):799.

[3] 彭大云, 賴?yán)m(xù)文, 張偉, 等. 全自動免疫組化儀在標(biāo)準(zhǔn)化染色質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J]. 中國醫(yī)學(xué)裝備, 2017,14(3):36-39.

[4] 張宏桃. 免疫組化切片質(zhì)量控制的幾點(diǎn)體會[J]. 中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè)), 2012,14(7):271.

[5] 劉爽. 全自動免疫組化儀的應(yīng)用體會[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2014,19(3):34-35.

[6] 牛曉東, 俞志剛, 馬占東, 等. 使用全自動免疫組化機(jī)的體會[J]. 醫(yī)學(xué)信息, 2015,29(31):357.

Discussion on the Quality and Detail of Automatic Immunohistochemistry

HUANG Ling-yan Department of Pathology，Longyan First Hospital affliated to Fujian Medical University (Fujian Longyan 364000)

1006-6586(2017)11-0048-02

R446.8

A

2016-04-20