新疆某規(guī)?；?chǎng)牛病毒性腹瀉/黏膜病的診斷

阮東，剡根強(qiáng)

（石子河大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003）

新疆某規(guī)?；?chǎng)牛病毒性腹瀉/黏膜病的診斷

阮東，剡根強(qiáng)

（石子河大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003）

本試驗(yàn)采用現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢查、病理剖檢、病料細(xì)菌學(xué)檢測(cè)及PCR檢測(cè)對(duì)新疆石河子市某規(guī)?；?chǎng)成年牛與犢牛的死亡病因進(jìn)行了診斷。結(jié)果表明，該場(chǎng)2016年3～5月份共有67頭牛發(fā)病，死亡14頭，其中成年懷孕牛41頭，死亡8頭，病死率為19.51%；2～8周齡犢牛發(fā)病26頭，死亡6頭，病死率為23.07%。成年牛與犢牛均表現(xiàn)出體溫升高、口腔潰瘍、腹瀉，部分成年牛表現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、跛行等；剖檢可見(jiàn)病死牛腸黏膜潰瘍、脫落、出血等；無(wú)菌采集病死牛心血及肝組織接種于LB肉湯培養(yǎng)，但未檢測(cè)到相關(guān)病原菌；采用BVDV特異性引物對(duì)氣管拭子和腸內(nèi)容物拭子進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，得到預(yù)期286bp目的條帶，與Genbank登錄的部分BVDV參考株的同源性為90.6%～92.6%。最終確診，該規(guī)?；?chǎng)成年牛與犢牛的死亡病因主要是BVDV感染。

牛BVDV；診斷；RT-PCR；序列分析

牛病毒性腹瀉/黏膜病（BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）經(jīng)多種途徑感染引起的一種急性高度接觸性傳染病[1]。臨床上以體溫升高、口腔及胃腸潰瘍、黏性腹瀉及蹄葉炎為特征[2]。BVDV不僅導(dǎo)致懷孕母牛流產(chǎn)、死胎及初生犢牛急性死亡、育成牛發(fā)病死亡外，還可造成牛群的持續(xù)性感染及感染牛的免疫抑制，給牛群的健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅[3]，被OIE定為B類及進(jìn)出口檢疫的疾病[4]。近年來(lái)，新疆地區(qū)牛養(yǎng)殖數(shù)量不斷增加，BVD出現(xiàn)了新的流行趨勢(shì)，已從牛場(chǎng)隱性感染和散發(fā)性臨床病例轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫粤餍泻捅┌l(fā)。2016年3～5月，石河子某規(guī)模化牛場(chǎng)陸續(xù)發(fā)生懷孕母牛流產(chǎn)、死胎、死亡和初生犢牛急性死亡病例，本試驗(yàn)采用現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢查、病理剖檢、病料細(xì)菌學(xué)檢測(cè)及PCR檢測(cè)對(duì)發(fā)病原因進(jìn)行了診斷分析，最終確診為BVDV感染。

1 材料與方法

1.1 病料采集

用滅菌棉拭子采集1頭病死成年母牛及2頭死亡犢牛的食道黏液、腸內(nèi)容物及6頭體溫升高、口腔潰瘍并表現(xiàn)腹瀉的發(fā)病犢牛的直腸內(nèi)容物，放入收集管，于-80℃保存?zhèn)溆?；無(wú)菌采集死亡成年牛和犢牛的肝臟、心血、腸系膜淋巴結(jié)，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑Trizol：美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：寶生物（Takara）工程大連公司；引物合成：北京華大基因科技有限公司；2×PCR.MIX、DNA. Marker：廣州東盛生物科技有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒：諾維森（北京）生物科技有限公司；pMD19-T克隆載體：寶生物工程大連公司（Takara）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞：北京全式金生物科技有限公司。TC-512.PCR擴(kuò)增儀：英國(guó)Bibby科技有限公司；凝膠圖像處理系統(tǒng)：美國(guó)伯樂(lè)（BIO-RAD）科技有限公司；DYY-6B電泳儀：杭州雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1.流行病學(xué)調(diào)查

現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查了解該牛場(chǎng)的發(fā)病情況，包括發(fā)病時(shí)間、發(fā)病數(shù)、發(fā)病日齡、主要臨床表現(xiàn)及病理解剖變化等。

1.3.2.細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

無(wú)菌取病死牛心血、肝臟及腸系膜淋巴結(jié)涂片，瑞氏染色鏡檢并接種于LB培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24h，涂片革蘭氏染色鏡檢；將培養(yǎng)液再接種于血平板，置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h后，革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3.PCR檢測(cè)

1.3.3.1.食道黏液及腸內(nèi)容物樣品處理

將病樣棉簽置于5mL凍存管中并加入2mL的生理鹽水，充分振蕩搖勻，吸取1.2mL懸液于1.5mL的離心管中，8.000r/min.4℃離心15min，吸取上清置于滅菌的1.5mL離心管，加入50μL的雙抗(青、鏈霉素)，-80℃保存。

1.3.3.2.總RNA的提取

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品總RNA。

1.3.3.3.引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)5′-UTR基因的引物：上游引物F2:5′-ATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3.′，下游引物R2:5′-CAACTCCA.TGTGCCATGTACAGCAG-3′。

1.3.3.4.RT-PCR

采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；PCR體系：PCR.MIX10μL，上下游引物各0.75μL，DNA模板2μL，超純水6.5μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)（94℃變性45s，58℃退火50s，72℃延伸30s），最后72℃延伸10min，4℃保存；PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠后用凝膠回收試劑盒回收并純化。

1.3.3.5.克隆與鑒定

將純化的目的DNA片段與PMD19-T載體4℃連接過(guò)夜，按常規(guī)方法[5]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH.5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h。選擇單個(gè)菌落進(jìn)行重組質(zhì)粒的菌液PCR驗(yàn)證，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定，大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。

1.3.3.6.序列測(cè)定與分析

將提取的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。使用DNAMAN、DNAStar軟件進(jìn)行序列分析，將測(cè)序結(jié)果與Genbank中登錄的BVDV參考株進(jìn)行序列比對(duì)和同源性比較。牛病毒性腹瀉/黏膜病毒參考株5′-UTR基因序列見(jiàn)表1。

表1 5′-UTR基因序列參考株

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查及臨床檢查結(jié)果

2016年3～5月，該牛場(chǎng)48頭牛體溫升高至40.5～41℃，其中成年母牛33頭，均為懷孕牛，犢牛15頭，2～8周齡；23頭牛出現(xiàn)口腔潰瘍，其中成年牛14頭，犢牛9頭；54頭牛出現(xiàn)腹瀉，其中成年牛33頭，犢牛21頭?？傆?jì)共有67頭牛發(fā)病，14頭牛死亡，其中成年牛8頭，病死率為19.51%（8/41），犢牛6頭，病死率為23.07%（6/26）；流產(chǎn)母牛16頭，產(chǎn)死胎母牛3頭；4頭成年牛表現(xiàn)跛行。

剖檢2頭死亡成年牛，均可見(jiàn)牙齦黏膜紅腫且有多處潰瘍，食道、真胃及腸黏膜脫落并有條狀出血，其中1頭成年牛的整個(gè)小腸嚴(yán)重出血，引發(fā)腸梗阻，肝臟、肺臟、心臟正常。

剖檢2頭死亡犢牛，死前體溫為40.7℃，黏液性腹瀉，口腔及牙齦出現(xiàn)潰瘍。剖檢可見(jiàn)腸壁變薄，腸黏膜出現(xiàn)壞死脫落。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

無(wú)菌取死亡牛心血、肝、腸系膜淋巴結(jié)涂片，瑞氏染色后鏡檢未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌；病料接種LB培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)48h，未見(jiàn)可疑細(xì)菌生長(zhǎng)，革蘭氏染色后鏡檢也未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌；培養(yǎng)物接種血平板未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)。

2.3 RT-PCR結(jié)果

樣品經(jīng)RT-PCR，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增基因片段大小為286bp（圖1）。.

圖1 樣品RT-PCR電泳圖

2.4 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定

將PCR的陽(yáng)性產(chǎn)物切膠回收后，將來(lái)自成年牛2205與犢牛YN的樣品連接載體，轉(zhuǎn)化后隨機(jī)挑選單克隆菌落，經(jīng)培養(yǎng)后，菌液PCR結(jié)果驗(yàn)證篩選的單克隆菌落為陽(yáng)性克隆。

2.5 序列分析與同源性比較

使用DNAStar.MegAlign軟件，將此次克隆的2株牛病毒性腹瀉/黏膜病毒的5′-UTR基因序列與部分BVDV參考株進(jìn)行核苷酸序列對(duì)比（圖2），此次克隆的2株牛病毒性腹瀉/黏膜病毒株同源性為90.1%，成年牛2205株與參考株NADL的同源性最高，為92.0%，屬BVDV-1a型；犢牛YN標(biāo)與參考株g-1703的同源性最高，為92.6%，屬BVDV-1f型。

圖2 YN、2205株與BVDV參考株的5′-UTR基因同源性比較

3 討論

自1946年Olafson首先在美國(guó)紐約州發(fā)現(xiàn)BVD以來(lái)，該病已在世界各地廣泛流行和傳播。20世紀(jì)80～90年代，美國(guó)、加拿大、法國(guó)、德國(guó)、瑞典、芬蘭、波蘭、澳大利亞、新西蘭、日本等養(yǎng)牛發(fā)達(dá)國(guó)家牛群BVDV感染率為50%～89%[6～8]。在我國(guó)，李佑民等[9]首次從國(guó)外引進(jìn)牛的流產(chǎn)胎兒脾臟中分離并鑒定出BVDV。此后，劉世杰等[10]、高雙娣等[11]、周繼章等[12]、張光輝等[13]、馮諾飛等[14]、魏偉[15]、劉亞剛[16]等分別報(bào)道了四川、西南五省、安徽、江蘇、河南、陜西、黑龍江、新疆等地區(qū)牦牛、肉牛、奶牛的BVDV感染情況，表明在我國(guó)多數(shù)地區(qū)牛群感染BVDV已十分普遍并呈上升趨勢(shì)，成為影響牛群健康的重要疫病之一。

James等[17]研究表明，隨著B(niǎo)VDV與宿主之間的相互作用，BVDV對(duì)宿主的易感性、流行趨勢(shì)、發(fā)病日齡及臨床特征呈現(xiàn)一定的變化特點(diǎn)。美國(guó)70年代BVD發(fā)病特征表現(xiàn)為臨床癥狀的牛以6月齡牛為主，而胎兒感染率不到5%，但到2000年，BVDV感染情況發(fā)生了很大的變化，胎兒感染率達(dá)25%，只有35%6月齡感染牛出現(xiàn)臨床癥狀。在本次調(diào)查中，所有牛場(chǎng)均以懷孕母牛及2～8周齡犢牛發(fā)病為主，且表現(xiàn)典型臨床癥狀，同場(chǎng)內(nèi)3月齡以上犢牛未見(jiàn)發(fā)病，這也初步表明BVDV的感染及發(fā)病、易感日齡及臨床特征呈現(xiàn)新的變化趨勢(shì)。

關(guān)于該病的防控，目前尚無(wú)行之有效的方法和措施。歐洲一些國(guó)家普遍實(shí)施牛群檢測(cè)、陽(yáng)性者淘汰、衛(wèi)生保障及健康認(rèn)證為主的BVDV凈化措施與根除計(jì)劃，雖然付出了較長(zhǎng)時(shí)間及巨大成本，但也獲得了良好的防控效果[18]。我國(guó)多數(shù)牛場(chǎng)普遍采用豬瘟疫苗進(jìn)行防治，雖也取得了一些成效，但BVDV常以持續(xù)感染的形式存在于牛群中，豬瘟弱毒疫苗免疫所產(chǎn)生的抗體水平仍不足以抵抗BVDV的感染，一些豬瘟疫苗免疫牛群也發(fā)生BVD，反而因豬瘟弱毒疫苗的使用而給該病的檢測(cè)帶來(lái)一定難度。同時(shí)，因產(chǎn)前注射豬瘟弱毒疫苗造成胎兒的速發(fā)型超敏反應(yīng)而引起子宮破裂的病例也時(shí)有發(fā)生。因此，建議規(guī)模化牛場(chǎng)采用以檢測(cè)為前提，淘汰陽(yáng)性低產(chǎn)奶牛及持續(xù)感染牛只，逐步減少帶毒牛只數(shù)量，健康牛只實(shí)施牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活疫苗免疫，以降低牛群BVD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，再結(jié)合隔離飼養(yǎng)、消毒及衛(wèi)生措施，以實(shí)現(xiàn)有效控制。

4 小結(jié)

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)牛群BVDV感染的調(diào)查報(bào)道較多，但有關(guān)臨床發(fā)病的確診，尤其是同一牛場(chǎng)中懷孕母牛與犢牛同時(shí)發(fā)生BVD的報(bào)道并不多見(jiàn)。此次通過(guò)對(duì)石河子某牛場(chǎng)發(fā)病?，F(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、臨床檢查、病理解剖表明該牛場(chǎng)懷孕母牛及犢牛的死亡原因?yàn)锽VDV感染，但不排除可能存在其他病毒的混合感染。該診斷結(jié)果為該規(guī)?；?chǎng)BVDV的免疫預(yù)防提供了依據(jù)。

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Diagnosis of Bovine Viral Diarrhea(BVD) in a Large-scale Cattle Farm in Xinjiang

RUAN Dong, SHAN Gen-qiang
(College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezhi 832003)

To determine the cause of death of adult cows and calves in a large-scale dairy farm in Shihezi Xinjiang. Field epidemiological investigation, clinical examination, pathologic examination, bacteriological examination and PCR detection were carried out. Sequence analysis of PCR products was carried out. After field investigation and laboratory diagnosis, 67 cows were killed and 14 cows were killed in March to May, of which 41 cows were pregnant and 8 died. The fatality rate was 19.51%, 26 calves of 2 ～ 8 weeks were killed and 6 calves died. The fatality rate was 23.07%. Adult cows and calves are showing elevated body temperature, mouth ulcers, diarrhea, some adult cattle performance miscarriage, stillbirth, limp, etc. Necropsy can be seen dead intestinal ulcer, shedding, bleeding, etc. The results of RT-PCR showed that the expected band of 286bp was obtained by tracheal swab and intestine swabs, which were different from those of the BVDV reference strains registered in Genbank.There were no detectable bacteria in the liver tissue after inoculation of LB broth. The homology was 90.6%～92.6%. It is indicated that the death of adult cows and calves was caused by BVDV in the scale cattle farm.

Bovine BVDV; Diagnosis; RT - PCR; Sequence analysis

S858.23

A

1004-4264（2017）06-0034-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.008

2017-01-13

阮東（1992-），男，漢族，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)技術(shù)服務(wù)。

剡根強(qiáng)（1958-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治工作。