電針后血清對大鼠成骨細(xì)胞增殖活性的影響

吳追樂，邱美榕

電針后血清對大鼠成骨細(xì)胞增殖活性的影響

吳追樂1，邱美榕2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的觀察電針后血清對大鼠成骨細(xì)胞增殖活性的影響。方法取30只SD雌性大鼠按抽簽法隨機分為空白組、雌二醇組、電針組，每組各10只?？瞻捉M不做任何處理；雌二醇組以戊酸雌二醇后肢肌肉注射，每周1次，連續(xù)90 d；電針組取穴大杼（BL11）、命門（DU4）、足三里（ST36），電針干預(yù)15 min，每日1次，10次為1個療程，療程間休息5 d，共干預(yù)6個療程，持續(xù)90 d。90 d后，每組腹主動脈采血制備血清。另外，將新生24 h SD乳鼠麻醉斷頭處死，取下顱蓋骨，建立成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)至第3代時同步化后進(jìn)行干預(yù)，采用MTT法分別確定電針后血清的有效干預(yù)時間及干預(yù)濃度?？瞻捉M、雌二醇組、電針組分別在有效濃度作用下干預(yù)成骨細(xì)胞，在有效干預(yù)時間點采用MTT法觀察成骨細(xì)胞的增殖。結(jié)果與24、48、96 h比較，干預(yù)72 h成骨細(xì)胞OD值高于其它3個時間點，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；10%電針后血清濃度組明顯高于5%、20%血清濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在10%血清濃度的作用下干預(yù)72 h，電針組第3代成骨細(xì)胞OD值高于雌二醇組（P＜0.05）。結(jié)論電針后血清能加速成骨細(xì)胞增殖，維持成骨細(xì)胞活性。

骨質(zhì)疏松癥；電針；血清；成骨細(xì)胞；細(xì)胞活性

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）屬中醫(yī)“骨痿”范疇，按照中醫(yī)“腎主骨生髓”的理論，腎虛是OP發(fā)病的首要病因［1］。目前醫(yī)學(xué)研究證實，中醫(yī)學(xué)的腎虛證與下丘腦-垂體-性腺軸功能降低密切相關(guān)，針灸可針對此軸的功能進(jìn)行良性調(diào)節(jié)，穩(wěn)定體內(nèi)雌激素的水平，從而抑制骨吸收，增強骨形成，達(dá)到治療OP的作用［2］。前期研究證實，針刺能減少骨丟失，改善骨強度和超微結(jié)構(gòu)，對OP有防治作用［3-7］。本研究以“腎主骨”“骨會大杼”“腎為先天之本，脾為后天之本”理論為指導(dǎo)，以補腎健脾、溫陽通脈、強筋壯骨為治療原則，精選大杼（BL11）、命門（DU4）、足三里穴（ST36）治療。大杼（BL11）為八會穴之一，骨會大杼（BL11），強筋壯骨；命門（DU4）可培元補腎，強健腰膝（補先天）；足三里（ST36）有溫陽益氣，健脾益胃（補后天）之功效。將電針后血清引入成骨細(xì)胞增殖的研究中，觀察電針后血清影響成骨細(xì)胞增殖活性的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物選用3月齡SD雌性大鼠30只，用于制備電針后血清；新生24 h的SD乳鼠10只，用于成骨細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代。動物均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［許可證號：SCKK（滬）2012-0002］。福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供清潔級實驗動物環(huán)境及相關(guān)設(shè)施［許可證號：SYXK（閩）2014－ 0005］。所有實驗動物均嚴(yán)格按照國家機構(gòu)關(guān)于實驗動物衛(wèi)生指導(dǎo)使用及符合國際倫理準(zhǔn)則，實驗獲得福建中醫(yī)藥大學(xué)動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器Ⅰ型膠原酶（Invitrogen公司）；小牛血清-FBS、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司）；MTT﹑DMSO（Sigma公司）；戊酸雌二醇（廣州先靈藥業(yè)有限公司；批號：230B）。GBB16二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力新實業(yè)有限公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國BIO-Tek公司）；IX 70倒置式系統(tǒng)顯微鏡（日本太陽交易株式會社）；0.30 mm×13 mm毫針、電針儀（華佗SDZ-V；蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 電針后血清的制備3月齡SD雌性大鼠30只，按抽簽法隨機分為3組，即：空白組、雌二醇組、電針組，每組各10只?？瞻捉M不做任何處理；雌二醇組以戊酸雌二醇后肢肌肉注射，按人鼠劑量換算，每只鼠每次肌注0.1 mg／kg，每周1次，連續(xù)90 d；電針組取穴大杼（BL11）、命門（DU4）、足三里（ST36），穴位常規(guī)消毒，毫針進(jìn)針，采用提插捻轉(zhuǎn)行針手法，使用電針儀（脈沖強度10V，脈沖頻率8 Hz，連續(xù)波）進(jìn)行電針干預(yù)15 min［8］，每日1次，10次為1個療程，療程間休息5 d，共干預(yù)6個療程，持續(xù)90 d。各組SD大鼠采血前禁食12 h，均于第90 d末次針刺1 h后在水合氯醛麻醉狀態(tài)下進(jìn)行腹主動脈采血4～5 mL，分別單獨裝瓶。在離心機下以3000 r／min離心15 min，分離血清，恒溫水浴鍋56℃水浴，滅活30 min，經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾除菌，分裝，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)將新生24 h的SD乳鼠麻醉后斷頭處死，無菌操作，切開皮膚及皮下組織，切下顱蓋骨，浸泡于DMEM培養(yǎng)液中，去除周圍軟組織、血管及骨膜，0.01 mol／L磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗2次，剪成1 mm×1 mm大小置于25 mL培養(yǎng)瓶中，于37℃下，用2.5 g／L胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶混合液（1∶1）預(yù)消化20 min，棄消化液。再用Ⅰ型膠原酶消化，每20 min輕搖培養(yǎng)瓶1 min，消化2 h后用400目不銹鋼濾網(wǎng)收集消化液，去除骨片，用等體積的15%FBS DMEM培養(yǎng)液稀釋，余渣再加入Ⅰ型膠原酶消化1次，步驟同上，將2次收集的消化液1000 r／min離心5 min，棄上清，用15%FBS DMEM培養(yǎng)液重懸成骨細(xì)胞沉淀，按一定密度置于37℃、5%CO2飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)接種培養(yǎng)，并根據(jù)細(xì)胞的接種密度進(jìn)行消化傳代。本實驗采用經(jīng)2次傳代、純化的第3代細(xì)胞，并根據(jù)不同步驟的需要將細(xì)胞調(diào)整成適當(dāng)?shù)拿芏取?/p>

2.3 建立干預(yù)成骨細(xì)胞活性時效關(guān)系及量效關(guān)系

2.3.1 電針后血清干預(yù)成骨細(xì)胞活性時效關(guān)系第3代成骨細(xì)胞以2×103／孔接種于96孔板中，含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h。用不含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h同步化成骨細(xì)胞，分別加入含10%空白組、電針組的血清DMEM培養(yǎng)，每組成骨細(xì)胞設(shè)定6孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。棄培養(yǎng)液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃溫育4 h，棄MTT溶液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振蕩10 min，酶標(biāo)儀λ570 nm檢測每孔OD值。

2.3.2 電針后血清干預(yù)成骨細(xì)胞活性量效關(guān)系第3代成骨細(xì)胞以2×103／孔接種于96孔板中，含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h。用不含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h同步化成骨細(xì)胞，分別加入含5%、10%、15%、20%的空白組、電針組的血清DMEM培養(yǎng)，每組成骨細(xì)胞設(shè)定6孔，培養(yǎng)72 h。棄培養(yǎng)液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃溫育4 h，棄MTT溶液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振蕩10 min，酶標(biāo)儀λ570 nm檢測每孔OD值。

2.4 電針后血清對成骨細(xì)胞增殖的影響第3代成骨細(xì)胞以2×103／孔接種于96孔板中，含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h。用不含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h同步化成骨細(xì)胞，分別加入含10%空白組、雌二醇組、電針組的血清DMEM培養(yǎng)，每組成骨細(xì)胞設(shè)定6孔，培養(yǎng)72 h。棄培養(yǎng)液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃溫育4 h，棄MTT溶液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振蕩10 min，酶標(biāo)儀λ570 nm檢測每孔OD值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計量資料采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察原代細(xì)胞培養(yǎng)第1 d可見大部分在培養(yǎng)液中懸浮，胞體圓形，核大，見圖1A；2 d時細(xì)胞完全貼壁，胞體呈三角形、多角形等，核呈卵圓形，見圖1B；5 d時細(xì)胞分裂明顯增加，突起緊密連接，呈集落生長，似魚鱗狀，見圖1C；7 d時可見細(xì)胞形態(tài)多樣，重疊生長，胞漿豐富，呈鋪石狀，符合成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，見圖1D。當(dāng)達(dá)到80%匯合時消化傳代，消化后棄去組織塊，傳代后2 h倒置顯微鏡觀察，部分細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞呈多邊形、紡錘形、梭形，胞核較大，呈圓形且清晰。24 h后細(xì)胞大部分貼壁生長，排列緊密，多呈梭形和多邊形。隨時間推移，細(xì)胞重疊生長，數(shù)量增加，經(jīng)反復(fù)消化、傳代后得到純化的成骨細(xì)胞。

3.2 時效及量效關(guān)系的建立

3.2.1 建立時效關(guān)系第3代成骨細(xì)胞，空白組OD值，干預(yù)72、96 h明顯高于干預(yù)前（P＜0.05）；電針組OD值干預(yù)72 h明顯高于其它3個時間點（P＜0.05）。因此確定72 h作為后續(xù)成骨細(xì)胞實驗的最佳檢測時間點，見表1。

3.2.2 建立量效關(guān)系第3代成骨細(xì)胞，干預(yù)后，2組OD值，10%、15%、20%均明顯高于5%（P＜0.01）；電針組，10%與15%比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但隨著血清濃度的進(jìn)一步增加，成骨細(xì)胞OD值明顯降低。因此確定10%血清濃度作為最佳干預(yù)濃度，見表2。

3.3 成骨細(xì)胞增殖的影響見表3。

4 討論

4.1 電針后血清建立的理論依據(jù)近年來，中醫(yī)藥在治療OP方面進(jìn)展很大，具有療效穩(wěn)定、作用廣泛、使用安全、毒副作用小的特點，發(fā)展前景良好。針灸屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的特色療法，是一種“自然療法”“整體療法”，療效確切，無不良反應(yīng)，能充分調(diào)動機體的自我調(diào)節(jié)能力。研究證實，針灸對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，可明顯提高雌二醇［9-11］。另外，電針具有消腫止痛、舒筋活絡(luò)、補腎壯骨益髓的作用，多層面、多靶點、多途徑作用于經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)，經(jīng)過中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整合及信號通路的調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而進(jìn)一步改善患者的臨床癥狀和體征［12］。

圖1 成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

表1 電針后血清干預(yù)成骨細(xì)胞活性的時效關(guān)系（OD值，x±s）

表2 電針后血清干預(yù)成骨細(xì)胞活性的量效關(guān)系（OD值，x±s）

表3 電針后血清對成骨細(xì)胞增殖影響（x±s）

針灸調(diào)整內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的研究一直是中醫(yī)針灸科研領(lǐng)域的重點課題，從神經(jīng)體液角度入手的研究較多，主要探討針灸作用的神經(jīng)機制，欠缺體液機制的探討，直接證據(jù)獲得較少。而針灸調(diào)整內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)研究的數(shù)據(jù)，大多數(shù)來源于在體實驗的研究。在體實驗研究中，針灸可對血清中某些相關(guān)活性成分的水平進(jìn)行不同程度的調(diào)節(jié)，所獲得的數(shù)據(jù)大部分是通過間接觀察得到的結(jié)果。因此，針灸專家陳漢平教授提出“針灸血清”的方法，很大程度上提高了針灸科研的觀察水平。其要領(lǐng)是把針灸治療后獲取的血清直接加入到體外反應(yīng)體系中進(jìn)行干預(yù)，通過對離體靶器官、組織、細(xì)胞等形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動的觀察，分析針灸血清所產(chǎn)生的具體效應(yīng)［13-15］。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OP的主要病理變化是在骨代謝過程中骨形成和骨吸收的偶聯(lián)產(chǎn)生缺陷，致使人體內(nèi)鈣磷代謝失衡，進(jìn)而骨量逐步減少而引發(fā)相關(guān)臨床癥狀。人體的骨代謝，一方面是成骨細(xì)胞的骨形成，另一方面是破骨細(xì)胞的骨吸收，兩者之間協(xié)調(diào)平衡，從而使體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)換處于正常水平狀態(tài)。因此任何影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞功能和（或）數(shù)量的因素，使骨吸收過多或骨形成不足，均可出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。成骨細(xì)胞是骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，骨代謝正常與否與成骨細(xì)胞的分化成熟、功能活性密切相關(guān)。盡管目前骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制仍不清楚，但研究表明，骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中，成骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨形成不足，與成骨細(xì)胞增殖分化水平下降及成骨能力功能障礙有著密切的關(guān)系［16-17］。

因此，本研究根據(jù)人體與動物藥物等效劑量換算，制備了電針后血清。采用電針后血清作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，模擬電針的經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)過程，為后續(xù)開展成骨細(xì)胞增殖、維持成骨細(xì)胞活性提供有效的實驗平臺。

4.2 成骨細(xì)胞增殖方法及意義本研究首先采用梯度時間法、梯度濃度法建立電針后血清干預(yù)成骨細(xì)胞活性的時效及量效關(guān)系，結(jié)果表明，成骨細(xì)胞干預(yù)72 h為最佳干預(yù)時間點，10%血清濃度為最佳干預(yù)濃度。成骨細(xì)胞在電針后10%血清濃度的作用下干預(yù)72 h，檢測成骨細(xì)胞增殖情況的結(jié)果表明，電針組比雌二醇組更能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

電針后血清能加速成骨細(xì)胞增殖，維持成骨細(xì)胞活性，但隨著干預(yù)時間的延長，其維持成骨細(xì)胞活性的能力具有自限性，96 h后效果欠佳，這可能是由于96 h后軟骨細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，代謝產(chǎn)物堆積，細(xì)胞進(jìn)入平臺期并開始衰退。眾所周知，骨形成是一個極其復(fù)雜的過程，成骨細(xì)胞是骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，電針是如何促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖？是否電針后導(dǎo)致雌激素水平上升從而加速成骨細(xì)胞的增殖？通過何種途徑激活細(xì)胞增殖相應(yīng)的信號通路？信號通路之間又是如何相互影響的？這些問題有待于今后進(jìn)一步研究和探討。

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R245

B

1000-338X（2017）03-0040-04

2016-04-03

福建省自然科學(xué)基金資助項目（2015J05161）；福建省衛(wèi)生計生委青年科研課題（2015-1-78）；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題（X2012021）

吳追樂（1982—），男，醫(yī)學(xué)博士，主要從事針灸治療骨質(zhì)疏松的研究。