2—甲氧基雌二醇聯(lián)用抗壞血酸誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化研究

張?zhí)K偉??曾嫦??林祥偉

[摘要] 目的 研究2-ME聯(lián)合抗壞血酸在誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡中的作用以及細(xì)胞周期的變化機(jī)制。 方法 收集2016年1～12月期間汕頭市中心醫(yī)院血液科已確診的bcr/abl（+）慢性粒細(xì)胞白血病患者57例骨髓，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選出CML細(xì)胞并培養(yǎng)傳代并隨機(jī)分為四組。使用抗腫瘤化合物2-甲氧基雌二醇（2-ME）與抗壞血酸（AA）組合來處理慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）細(xì)胞，根據(jù)藥物濃度分為：（1）未加藥組；（2）2-ME組（2?mol/L）；（3）AA組（62.5?mol/L）；（4）2-ME聯(lián)用AA組（2-ME：2?mol/L+AA：62.5?mol/L）四組。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析藥物處理后的CML細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞周期的變化情況。結(jié)果用（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用F檢驗(yàn)。結(jié)果 2μmol/L 2-ME +62.5μmol/ LAA組可誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡。 2-ME+AA以劑量依賴性方式誘導(dǎo)凋亡，在濃度2～8μmol/ L時凋亡呈時間-劑量依賴。2-ME+AA可誘導(dǎo)處于G0/G1期的細(xì)胞明顯增多，處于S期的細(xì)胞減少。 結(jié)論 2-ME聯(lián)合抗壞血酸可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞以時間-劑量依賴式凋亡，且與細(xì)胞周期抑制有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 白血病細(xì)胞；2-ME；抗壞血酸；流式細(xì)胞術(shù)；凋亡；周期變化

[中圖分類號] R733.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）11-18-04

Study on apoptosis and cell cycle changes of CML cells induced by 2-Methoxy estradiol combined with ascorbic acid

ZHANG Suwei ZENG Chang LIN Xiangwei

Department of Laboratory， Shantou Central Hospital， Shantou 515031， China

[Abstract] Objective To study the role of 2-ME combined with ascorbic acid in the induction of CML cell apoptosis and the mechanism of cell cycle. Methods 57 Bone marrow of patients who diagnosed bcr/abl（+） chronic myeloid leukemia in Department of Hematology， Shantou Central Hospital between January 2016 and December 2016， was collected.And CML cells were sorted out by flow cytometry.CML cells were randomly divided into four groups.2-methoxy estradiol（2-ME） combined with ascorbic acid （AA） was used to treat chronic myeloid leukemia（CML） cells. According to the drug concentration is divided into four groups：（1）control；（2）2-MEgroup（2?mol/L）；（3）AA group （62.5?mol/L）；（4）2-ME combined with AA group（2-ME：2?mol/L+AA：62.5?mol/L）. Flow cytometry was used to analyze the apoptosis and cell cycle of CML cells. Results CML cell apoptosis was induced by 2μmol/L 2-ME+62.5μmol/L AA group. 2-ME+AA induced apoptosis in a dose-dependent manner， and apoptosis was time-dose-dependent at the concentration（2-8μmol/L）. 2-ME+AA can induce cells in G0/G1 phase increased significantly， in the S phase of the cells decreased. Conclusion 2-ME combined with ascorbic acid can induce leukemia cells in time-dose-dependent apoptosis， and is related to cell cycle inhibition.

[Key words] Leukemia cells； 2-ME； Ascorbic acid； Flow cytometry； Apoptosis； Cycle change

慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）占血液惡性腫瘤的15%～20%，發(fā)生率為1～2/10萬。大多數(shù)慢粒患者都有染色體易位，因有Ph染色體和bcr/abl融合基因存在，導(dǎo)致白血病細(xì)胞細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抗藥性[1]。因此尋找抗CML新藥已成為研究熱點(diǎn)。

在本研究中，我們收集2016年1～12月期間汕頭市中心醫(yī)院血液科已確診的bcr/abl（+）慢性粒細(xì)胞白血病患者57例骨髓，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分

選出CML細(xì)胞并培養(yǎng)傳代并隨機(jī)分為四組。使用抗腫瘤化合物2-ME與抗壞血酸AA組合來研究其對bcr/abl（+）CML細(xì)胞凋亡的影響，并探索白血病細(xì)胞周期的變化情況，為日后臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，期望針對CML組合治療開辟了新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和細(xì)胞培養(yǎng)

2-ME和AA均購自sigma公司，2-ME批號：705829，AA批號：1043003。收集已確診的bcr/abl（+）慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選出CML細(xì)胞，CML細(xì)胞在含有10%胎牛血清（FBS），100U/mL青霉素，100μg/ mL鏈霉素和2mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。每2～3天傳代1次。

1.2 細(xì)胞分組及加藥

所有CML細(xì)胞隨機(jī)分為四組，且按處理藥物濃度分為：（1）未加藥組；（2）2-ME組（2?mol/L）；（3）AA組（62.5?mol/L）；（4）2-ME聯(lián)用AA組（2-ME：2?mol/L+AA：62.5?mol/L）。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測

收集處理的各組細(xì)胞并以1500rpm離心5min。 棄去上清液，并將細(xì)胞用PBS重懸浮并計(jì)數(shù)。 取1×106重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。 加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫20～25℃暗處孵育10min。以1500rpm離心5min，棄去上清液，加入190μL Annexin V-FITC結(jié)合溶液以輕輕地重懸細(xì)胞。 加入10μL碘化丙啶染色溶液，輕輕混勻，冰浴置于適當(dāng)位置，流式細(xì)胞術(shù)檢測[12]。

1.4 細(xì)胞周期檢測

CML細(xì)胞周期的測定應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)來分析：在姬松茸多糖作用48h后的CML細(xì)胞以1×105個以體積分?jǐn)?shù)為0.7的乙醇固定以后，用PBS洗2次，加入RNA酶30μL，在37℃下水浴30min，最后冰浴終止反應(yīng)；用PBS洗1次，加入PI染液0.5mL，避光孵育30min后，上機(jī)檢測，并分析細(xì)胞的周期變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)包來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用F檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2-ME+AA聯(lián)用誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡情況分析

CML細(xì)胞經(jīng)2μmol/L的2-ME聯(lián)含應(yīng)用62.5?mol/L AA作用24后，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率。2-ME聯(lián)合AA可誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示：2-ME和抗壞血酸單獨(dú)使用并不引起白血病細(xì)胞凋亡，然而2-ME與AA聯(lián)用可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。

2.2 2-ME+AA聯(lián)合用藥（不同劑量、不同時間）對細(xì)胞凋亡的影響情況分析

CML細(xì)胞分別用2、4、8μmol/L 2-ME +62.5μmol/L +AA處理24、36和48h。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率。凋亡率結(jié)果顯示2-ME聯(lián)用抗壞血酸可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，且濃度依賴式凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示，2-ME+AA在本實(shí)驗(yàn)處理濃度范圍時間-劑量依賴性方式。見表2。

2.3 2-ME+AA聯(lián)合用藥對CML細(xì)胞周期的影響

結(jié)果顯示，處于G0/G1期的細(xì)胞明顯增多，處于S期的細(xì)胞減少，而G2/M期的細(xì)胞則無明顯變化。說明藥物作用CML后，可以把CML細(xì)胞周期阻滯與G0/G1期，減少細(xì)胞進(jìn)入S期，從而起到抑制細(xì)胞的增殖的作用。

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）占血液惡性腫瘤的15%～20%。大多數(shù)患有慢?；颊叨加腥旧w易位，因有Ph染色體和bcr/abl融合基因存在，導(dǎo)致白血病細(xì)胞細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抗藥性[2]。凋亡是生物機(jī)體維持平衡的機(jī)制之一，此機(jī)制的作用就是幫助機(jī)體監(jiān)測機(jī)體細(xì)胞的生老病死[3]。如果機(jī)體的凋亡機(jī)制紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞逃脫體內(nèi)的程序性死亡調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致大量增殖的腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生[4]。

2-甲氧基雌二醇（2-ME）是人體中雌二醇代謝的正常產(chǎn)物。近年來，2-ME抗腫瘤活性研究日益深入，大量的研究數(shù)據(jù)表明2-ME具有廣泛的抗腫瘤活性[5]。2-ME抗腫瘤作用是通過增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)氧化損傷，抑制血管生成，抑制細(xì)胞增殖等，主要機(jī)制是引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平升高[6]。2-ME通過內(nèi)源性雌激素的羥基化和甲基化形成，2-ME單用或結(jié)合其他藥物用于治療乳腺癌，前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤，有研究發(fā)現(xiàn)2-ME具有抗白血病效果[7]。2-ME可通過死亡受體途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。最近的研究表明，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤增殖，實(shí)體瘤等非常重要的手段，血癌也不例外[9]。在血液系統(tǒng)腫瘤中，CML的特征在于凋亡受到抑制。其可能與BCR/ABL融合基因相關(guān)[10]。

抗壞血酸既具有氧化作用，又具有抗氧化作用，可以防止氧化損傷引起的ROS水平過高，而且產(chǎn)生過氧化氫又可以產(chǎn)生氧化損傷[11]。研究表明，過量的抗壞血酸對人體是有害的。然而，小劑量的抗壞血酸，通常<100μmol/L，可以作為抗氧化劑拮抗各種氧化損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[12]。抗壞血酸作為一種抗氧化劑，最近表明，其在降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度方面是有效的，特別是當(dāng)存在增加體內(nèi)活性氧活性的物質(zhì)時[13]?？箟难峒染哂醒趸饔?，又具有抗氧化作用，可以防止氧化損傷引起的ROS水平過高，而且產(chǎn)生過氧化氫產(chǎn)生氧化損傷，有研究表明，過量的抗壞血酸對人體有害[14]。然而，低劑量的抗壞血酸，通常<100μmol/L，可以拮抗由氧化劑的氧化損傷引起的多種細(xì)胞凋亡[15]。因此，我們使用抗壞血酸來降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度，增加細(xì)胞中活性氧的濃度，并進(jìn)一步增加腫瘤細(xì)胞對2-甲氧基雌二醇的敏感性并促進(jìn)凋亡的作用。

流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的結(jié)果顯示：2-ME聯(lián)用AA可誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡，且分別與未加藥組、單獨(dú)2-ME組、單獨(dú)AA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示：在正常的2-ME、AA劑量下（單獨(dú)用藥不會引起凋亡），2-ME聯(lián)用AA可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明2-ME+AA聯(lián)合用藥（不同劑量、不同時間）對細(xì)胞凋亡的影響也是不同的。CML細(xì)胞經(jīng)2、4、8μmol/L的2-ME+62.5?mol/L +AA分別作用24、36、48h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示：在一定的濃度范圍內(nèi)（2～8μmol/L）2-ME+62.5?mol/L AA誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡的作用隨著2-ME濃度的增加而增強(qiáng)，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果提示：一定濃度范圍內(nèi)（2～8μmol/L）2-ME+ AA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用呈時間-劑量依賴關(guān)系。

慢性粒細(xì)胞性白血病是一種遺傳性疾病，其發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞周期有關(guān)。細(xì)胞周期是細(xì)胞存活的基本過程，每個細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞周期分化成熟衰老死亡這一循環(huán)[16]。在本研究中，用2-ME聯(lián)合AA處理CML細(xì)胞，觀察到G0/G1期的細(xì)胞顯著增加，而在S期，G2/M期細(xì)胞無明顯變化。這提示2-ME聯(lián)用AA 處理CML細(xì)胞可以在G0/G1期阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展，使得進(jìn)入到S期的細(xì)胞減少，最終抑制細(xì)胞增殖。

作為一種新的白血病治療方案，2-ME聯(lián)合AA不僅可以促進(jìn)CML細(xì)胞凋亡，且對正常細(xì)胞的副作用無明顯，還可以通過細(xì)胞周期抑制白血病細(xì)胞CML的增殖。2-ME聯(lián)合AA治療白血病為白血病的治療提供新的思路和方法。

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（收稿日期：2017-04-05）