Aurora A激酶抑制劑MLN8237對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

張月，孫光源，姜偉華，孫健，范敬靜，信國峰，宋文麗，武雪亮，張志生(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

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Aurora A激酶抑制劑MLN8237對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

張月，孫光源，姜偉華，孫健，范敬靜，信國峰，宋文麗，武雪亮，張志生
(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

目的 觀察Aurora A激酶抑制劑MLN8237對體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 取乳腺癌MCF7細(xì)胞分為兩組，觀察組分別加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237，對照組不加MLN8237。用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，Western blotting法檢測磷酸化Aurora A(p-Aurora A)激酶和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin B1的表達(dá)，Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 觀察組隨MLN8237濃度和培養(yǎng)時間增加，細(xì)胞增殖抑制率增加，10 μmol/L MLN8237作用48 h的細(xì)胞增殖抑制率最高,0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用24、48 h的細(xì)胞增殖抑制率均高于對照組(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組隨MLN8237濃度增加，G0/G1期、S期細(xì)胞比例降低，G2/M期細(xì)胞比例升高。觀察組各濃度與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組隨MLN8237濃度增加，p-Aurora A激酶、Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高。與對照組比較，觀察組隨MLN8237濃度增加，細(xì)胞凋亡率增加，10 μmol/L MLN8237作用24 h的細(xì)胞凋亡率最高(P均<0.05)。結(jié)論 MLN8237能夠抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

乳腺癌；MLN8237；Aurora激酶抑制劑；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤治療進(jìn)入了全新的分子靶向治療時代。與全身、廣泛性的放化療相比，靶向治療能夠高效、有選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，減少對正常組織的損傷，不良反應(yīng)較小。Aurora激酶家族是由Aurora A激酶、Aurora B激酶、Aurora C激酶組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其功能是進(jìn)行各種有絲分裂活動和維持基因組的完整性，在細(xì)胞有絲分裂過程中起重要作用。目前已報道的Aurora激酶抑制劑大部分屬于非選擇性Aurora激酶抑制劑，存在較大的不良反應(yīng)，尋找高效、低毒的選擇性Aurora激酶抑制劑是靶向藥物研究的趨勢。MLN8237是一種新型特異性抑制Aurora A激酶的小分子抑制劑，對實體瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖的作用[1]，但其對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的作用研究不多。2016年3～12月，我們通過觀察MLN8237對體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其分子機(jī)制，為乳腺癌的靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞由河北北方學(xué)院中心實驗室提供。MLN8237購自美國Selleck公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；BCA蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司；p-Aurora A激酶、Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1一抗購于美國Cell Signaling Technology公司；FITC-Annexin Ⅴ凋亡試劑盒購于美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 將MCF-7細(xì)胞加入含10%胎牛血清、人青霉素和鏈霉素各100 μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞分為觀察組和對照組，觀察組分別加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L的MLN8237，對照組不加MLN8237。

1.3 細(xì)胞增殖觀察 采用MTT法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成1×104/mL的細(xì)胞懸液，以0.1 mL/孔接種于96孔板。培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入二甲基亞砜，充分震蕩溶解顯色，使用酶標(biāo)儀于波長570 nm處檢測各孔吸光度值(A值)，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(對照組A值-觀察組A值)/對照組A值×100%。

1.4 細(xì)胞周期觀察 取對數(shù)生長期細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL。加入預(yù)冷的95%乙醇固定，離心，棄乙醇，加入PI(50 μg/mL)與RNase(1 μg/mL)混合物500 μL作用15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測1×104個細(xì)胞，用Multicycle軟件分析細(xì)胞周期。

1.5 細(xì)胞凋亡觀察 取對數(shù)生長期細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL。用冷PBS洗滌，加入Binding緩沖液100 μL、FITC Annexin-Ⅴ 5 μL、PI 50 μg/mL 10 μL，室溫避光孵育15 min。加入Binding緩沖液400 μL到細(xì)胞懸液中，繼續(xù)孵育20～30 min。上流式細(xì)胞儀FACScan測定凋亡細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax及Cyclin B1表達(dá)檢測 采用Western blotting法檢測細(xì)胞中p-Aurora A激酶和凋亡蛋白Bcl-2、Bax及細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1表達(dá)。取細(xì)胞蛋白樣品30 μg，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，37 mA恒流1 h將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛奶TBST封閉纖維素膜0.5 h，加入一抗(抗體稀釋比例為1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗體稀釋比例為1:10 000)，室溫孵育1 h后TBST洗滌3次，ECL顯影，曝光。以目的條帶與內(nèi)參條帶的光密度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較 觀察組MLN8237濃度較高組的細(xì)胞增殖抑制率較濃度較低組升高，作用48 h時的細(xì)胞增殖抑制率較24 h時升高。0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用24、48 h的細(xì)胞增殖抑制率均高于對照組(P均<0.05)，10 μmol/L MLN8237作用48 h的細(xì)胞增殖抑制率最高。見表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞周期比較與對照組比較 觀察組MLN8237濃度較高組的G0/G1期、S期細(xì)胞比例較濃度較低組下降，G2/M期細(xì)胞比例升高。觀察組各濃度與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組細(xì)胞周期比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞凋亡率比較 觀察組加入MLN8237 0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為2.67%±0.22%、5.26%±0.34%、8.41%±0.11%、11.04%±0.21%、29.59%±1.76%，對照組為2.51%±0.17%。與對照組比較，觀察組0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用下細(xì)胞凋亡率均升高(P均<0.05)。觀察組MLN8237濃度較高組的細(xì)胞凋亡率較濃度較低組增加，10 μmol/L MLN8237作用24 h的細(xì)胞凋亡率最高(P均<0.05)。

2.4 兩組細(xì)胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1蛋白相對表達(dá)量比較 與對照組比較，觀察組0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用下細(xì)胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Cyclin B1蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。觀察組MLN8237濃度較高組的p-Aurora A激酶、Cyclin B1、Bcl-2蛋白表達(dá)較濃度較低組下降，Bax蛋白表達(dá)逐漸升高(P<0.05或<0.01)。見表3。

表3 兩組細(xì)胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

Aurora激酶是中心體相關(guān)激酶，存在于真核細(xì)胞內(nèi)，在中心體復(fù)制、兩極紡錘體形成、染色體重排和染色體檢查點檢測等重要的有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用[2]。Aurora激酶的異常表達(dá)很可能干擾有絲分裂中檢查點的功能，導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定和誘發(fā)腫瘤增長[3]。Aurora激酶與惡性腫瘤的關(guān)系，使其作為靶點治療癌癥成為可能。選擇性Aurora激酶抑制劑的研究主要是針對Aurora B激酶，針對Aurora A激酶的選擇性抑制劑很少[4]。但相對于Aurora B激酶而言，Aurora A激酶在卵巢癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中均呈過表達(dá)，對乳腺癌的治療具有指導(dǎo)意義[5]。Aurora A激酶的功能與中心體的分離和成熟以及紡錘體裝配有關(guān)，通過激活紡錘體的檢查點，從而導(dǎo)致有絲分裂終止，形成異倍體[6]。Aurora A激酶高表達(dá)打亂了中心體和微管的動態(tài)平衡，基因組穩(wěn)定性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[7]。Aurora A激酶的mRNA、蛋白表達(dá)在G1期和S期均處于相當(dāng)?shù)偷乃剑贕2期和M期升高至峰值，當(dāng)一個細(xì)胞周期結(jié)束進(jìn)入下一個周期的G1期時，Aurora A激酶的表達(dá)迅速下降[8]。

作為第2代Aurora A激酶特異性抑制劑MLN8237，對實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤表現(xiàn)出了良好的療效[9]。Aurora A激酶通過與其底物結(jié)合，發(fā)生自身磷酸化從而被激活，激活A(yù)urora A激酶的底物和Aurora A激酶抑制劑之間的平衡對正常的有絲分裂是非常重要的[10]。本研究觀察了MLN8237對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，與對照組比較，10 μmol/L MLN8237作用于MCF-7細(xì)胞24、48 h的細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到64.88%±0.01%、82.21%±0.01%，與對照組比較，隨著MLN8237濃度增加，細(xì)胞凋亡率升高，凋亡細(xì)胞明顯增加。

MLN8237是潛在的選擇性Aurora激酶抑制劑，在腫瘤細(xì)胞中對Aurora A激酶的選擇性大于Aurora B激酶，可抑制磷酸化Aurora A激酶的表達(dá)。Cyclin B1是細(xì)胞周期中的一種重要的蛋白，使細(xì)胞通過G2/M期的檢查點，促進(jìn)細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換，它在有絲分裂中后期被降解，促進(jìn)有絲分裂完成，促使細(xì)胞周期的運行[11，12]。通過MLN8237藥物干擾使細(xì)胞Cyclin B1表達(dá)降低，G2/M期進(jìn)展延遲[13]，抑制有絲分裂細(xì)胞的聚集，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax的表達(dá)呈相反趨勢，即Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞進(jìn)入凋亡。本研究顯示，加入MLN8237后，細(xì)胞周期出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，G0/G1期、S期細(xì)胞比例降低，G2/M期細(xì)胞比例升高。同時，流式細(xì)胞術(shù)Annexin-Ⅴ/PI雙染顯示隨著MLN8237濃度的增加，細(xì)胞凋亡率升高，凋亡細(xì)胞增加。

Aurora A激酶轉(zhuǎn)化為p-Aurora A激酶發(fā)揮活性。MLN8237干擾后，p-Aurora A激酶表達(dá)減少，Cyclin B1被激活，從而延遲G2/M期的進(jìn)展，抑制有絲分裂細(xì)胞的聚集，使細(xì)胞發(fā)生增殖抑制。本研究顯示，MCF-7細(xì)胞p-Aurora A激酶表達(dá)隨MLN8237濃度增加而降低。隨藥物濃度增加，Cyclin B1表達(dá)降低，細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制及細(xì)胞周期阻滯，說明細(xì)胞的增殖抑制最終可能與下調(diào)Cyclin B1表達(dá)、不能有效調(diào)節(jié)G2/M期細(xì)胞周期進(jìn)展有關(guān)。

綜上所述，MLN8237能夠抑制乳腺癌細(xì)胞中Aurora A激酶磷酸化，下調(diào)Cyclin B1表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，形成異倍體細(xì)胞，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程；Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)增加，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可為乳腺癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

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醫(yī)藥學(xué)名詞常見錯誤及正確寫法

藥品名稱：錯誤(正確)

二磷酸腺苷(腺苷二磷酸)，消炎痛(吲哚美辛)，阿斯匹林(阿司匹林)，維甲酸(維A酸)，雙磷酸鹽(雙膦酸鹽)，甲氨喋呤(甲氨蝶呤)，博萊霉素(博來霉素)，開浦蘭(左乙拉西坦)，雷公多苷(雷公藤多苷)，非那根(異丙嗪)，四乙銨(四乙胺)，洗必泰(氯已定)，美息律(美西律)，大環(huán)內(nèi)脂類(大環(huán)內(nèi)酯類)，川穹(川芎)，酒精(乙醇)，頭胞哌酮(頭孢哌酮)。

疾病及其相關(guān)名稱：錯誤(正確)

甲狀腺機(jī)能(甲狀腺功能)，血沉(紅細(xì)胞沉降率)，X光片(X線片)，帕金森癥(帕金森病)，食道(食管)，適應(yīng)征、適應(yīng)癥(適應(yīng)證)，禁忌征、禁忌癥(禁忌證)，酒精肝(酒精性肝病)，心肌梗塞(心肌梗死)，腦梗塞(腦梗死)，毒副反應(yīng)(不良反應(yīng))，肌肉注射(肌內(nèi)注射)，心率失常(心律失常)，中風(fēng)(卒中)，生理機(jī)能(生理功能)，返流(反流)，血液動力學(xué)(血流動力學(xué))，機(jī)能(功能)，人流(人工流產(chǎn))，藥動學(xué)(藥代動力學(xué))，綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)，機(jī)理(機(jī)制)，圍產(chǎn)期(圍生期)，氧和指數(shù)(氧合指數(shù))，慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺疾病)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)，血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶抑制劑(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑)，咳血(咯血)，心房纖顫(心房顫動)，腦溢血(腦出血)，穩(wěn)定性心絞痛(穩(wěn)定型心絞痛)，法樂四聯(lián)癥(法洛四聯(lián)癥)，非何杰金淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)，剖腹產(chǎn)術(shù)(剖宮產(chǎn)術(shù))。

其他：錯誤(正確)

粘附(黏附)，粘痰(黏痰)，粘液(黏液)，粘滯(黏滯)，粘膜(黏膜)，粘多糖(黏多糖)，多粘菌素(多黏菌素)，粘質(zhì)沙雷菌(黏質(zhì)沙雷菌)，層黏聯(lián)蛋白(層黏連蛋白)，機(jī)率、幾率(概率)，脫臘(脫蠟)，側(cè)枝循環(huán)(側(cè)支循環(huán))，縱膈(縱隔)，紅血球(紅細(xì)胞)，白血球(白細(xì)胞)。

Effects of Aurora kinase inhibitor on proliferation and apoptosis of breast cancer cells

ZHANGYue,SUNGuangyuan,JIANGWeihua,SUNJian,FANJingjing,XINGuofeng,SONGWenli,WUXueliang,ZHANGZhisheng

(FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China)

Objective To investigate the effects of Aurora kinase inhibitor MLN8237 on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells cultured in vitro. Methods MCF7 cells were divided into two groups, including the control group (without MLN8237) and the observation group (added with 0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 μmol/LMLN8237). The cell proliferation inhibitory rate was examined by MTT assay. Cell cycle of MCF7 cells was determined by flow cytometry. The expression levels of phosphorate-Aurora A (p-Aurora A), apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax, and cell cycle-related Cyclin B1 protein were detected by Western blotting. The apoptotic rate was tested by Annexin V-FITC and PI staining. Results MLN8237 (0.01, 0.1, 1, 10 μmol/L ) significantly inhibited the proliferation of MCF7 cells after 24-hour or 48-hour treatment in a dose-dependent and time-dependent manner in the observation group as compared with that of the control group, and the highest inhibition was found at 10 μmol/L MLN8237 after 48-hour treatment (allP<0.05). With the increasing concentrations of MLN8237, the percentage of cells in G2/M phase increased, the percentage of cells in G0/G1and S decreased in the observation group as compared with that of the control group, and there was statistically significant difference between these two groups (allP<0.05). Compared with the control group, with the increasing concentrations of MLN8237, the expression of p-Aurora A kinase and Bcl-2 decreased, the expression of Bax increased, the apoptosis rate increased and the highest apoptotic inhibition rate was found at 10 μmol/L MLN8237 after 24-hour treatment in the observation group (allP<0.05). Conclusion MLN8237 inhibits the proliferation and induces the apoptosis of MCF7 cells.

breast carcinoma; MLN8237; Aurora kinase inhibitor; cell proliferation; apoptosis

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(ZD20140243)。

張月(1984-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為乳腺疾病的診治與基礎(chǔ)研究。E-mail: zhangyue906@163.com

張志生(1970-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為乳腺疾病的基礎(chǔ)與臨床診治。E-mail: yfyzzs@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.004

R737.9

A

1002-266X(2017)26-0013-04

2017-03-18)