紫果西番蓮炭疽病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究

謝美華，楊金奎，李雪玲，楊海艷*，陳莉莉，吳 帆

(1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000；2.省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091；3.云南省高校應(yīng)用生物學(xué)重點實驗室，云南 楚雄 675000)

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紫果西番蓮炭疽病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究

謝美華1,2,3，楊金奎2，李雪玲1,3，楊海艷1,3*，陳莉莉1，吳 帆1

(1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000；2.省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091；3.云南省高校應(yīng)用生物學(xué)重點實驗室，云南 楚雄 675000)

【目的】對紫果西番蓮葉片炭疽病病原X-03進行分離鑒定，并對其生物學(xué)特性和殺菌劑對X-03的抑制作用進行研究?！痉椒ā坎捎眯螒B(tài)觀察與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法?！窘Y(jié)果】X-03為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)真菌，它的最適生長溫度為15～20 ℃，最適生長pH為 pH 8～9，當(dāng)溫度高于50 ℃時X-03菌株的孢子不能萌發(fā)。X-03生長最適培養(yǎng)基為PDA，最適碳源和氮源分別為葡萄糖和NaNO3。供試的殺菌劑中以福美雙對X-03的抑制效果最好。【結(jié)論】研究可為紫果西番蓮炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

紫果西番蓮；炭疽病；病原；生物學(xué)性狀

【研究意義】紫果西番蓮(PassifloraedulisSims.)是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(Passiflora)多年生藤本攀緣植物[1-2]。西番蓮具有豐富的營養(yǎng)，被稱為“果汁之王”，果汁含量可達果重的30 %～40 %，具有濃郁的香味，且含有較高的有機酸和多達17種以上的氨基酸[3-5]。不僅如此，紫果西番蓮根、莖、葉均可入藥，性溫，無毒，歸肺經(jīng)，有祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛、活血、散癖、強體、健心等功效[6]。紫果西番蓮具有很大的經(jīng)濟應(yīng)用潛力，在云南多個地方已有廣泛栽培[7]?！厩叭搜芯窟M展】植物炭疽病目前已對紫果西番蓮等多種植物造成極大危害[8]，如草莓[9]、黃瓜[10]、切花紅掌[11]、油茶[12]和枸杞炭疽病[13]等[14]。目前對紫果西番蓮炭疽病病原菌的鑒定和生物學(xué)特性方面的研究還未見報道?！颈狙芯康那腥朦c】采取形態(tài)學(xué)并結(jié)合多基因聯(lián)合分析，對紫果西番蓮炭疽病病原菌進行鑒定及生物學(xué)特性研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】旨在對紫果西番蓮炭疽病的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集自云南省楚雄師范學(xué)院校園內(nèi)患有炭疽病的紫果西番蓮葉片，采用組織法對病原菌進行分離，經(jīng)科赫氏法鑒定其中一株為紫果西番蓮炭疽病的病原菌，菌株編號標(biāo)記為X-03。

1.2 方法

1.2.1 X-03培養(yǎng)特征和菌株顯微結(jié)構(gòu)觀察 觀察X-03在PAD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、分生孢子、分生孢子梗的形態(tài)特征。

1.2.2 rDNA-ITS，rDNA-GDPH序列擴增和分析 用改良CTAB法提取病原菌X-03的基因組DNA[14]。對病原菌的靶基因ITS(Internal Transcribed Spacer)和GPDH(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase)進行擴增，分別以ITS4/ITS5和CDF1/GDR1為引物，PCR擴增X-03菌株的ITS和GPDH序列。擴增產(chǎn)物送上海華大基因生物有限公司測序，所得序列在NCBI上比對，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列。以鐮刀菌(Fusariumlateritium)作為外群，利用Clustal x將供試菌株與近源菌株的ITS和GPDH序列分別進行比對，用MEGA5構(gòu)建各基因系統(tǒng)發(fā)育樹，并用bootstrap對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢驗，1000次重復(fù)。

1.2.3 X-03菌株生物學(xué)特性研究[10-12]

(1)不同培養(yǎng)基對X-03菌株生長的影響。PDA、紫果西番蓮葉煮汁(20 g葉片/L水)PDA (以下簡稱汁PDA)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基，只加蒸餾水和瓊脂粉的培養(yǎng)基作對照。

(2)不同溫度對X-03菌絲生長的影響。將X-03菌塊分別接種在PDA上并置于5、10、15、20、25、30、35 ℃溫度下培養(yǎng)5 d并測量菌落直徑。

(3)不同 pH條件對X-03生長和孢子萌發(fā)的影響。將X-03菌塊分別接種到pH值為3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9、9～10、10～11的PDA上培養(yǎng)6 d并稱其干重。用X-03孢子分別制成1 mL pH為3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9、9～10、10～11的孢子懸浮液，28 ℃培養(yǎng)24 h后檢測萌發(fā)率，每次檢測100個孢子。

(4)不同碳源對X-03菌絲生長的影響。用查氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相同含碳量的丙三醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖和葡萄糖為唯一碳源，配制成不同的碳源培養(yǎng)基。

(5)不同氮源對X-03生長的影響。以PDA為基本培養(yǎng)基，硝酸鈉為氮源，分別用相同含氮量的蛋白胨、氯化銨、硝酸銨和甘氨酸代替硝酸鈉，配制成不同氮源培養(yǎng)基。

(6)溫度對X-03孢子萌發(fā)的影響實驗。用X-03孢子制成1 mL孢子懸浮液，分別置于35、40、45、50、55、60 ℃溫度下培養(yǎng)， 24 h后鏡檢孢子的萌發(fā)情況。

1.2.4 不同殺菌劑對X-03菌株的抑制作用 用百菌清、甲霜·噁霉靈、福美雙和撲海因制成含有相同藥效成分帶藥PDA平板，無菌水作對照。接種相同大小的X-03菌塊，28 ℃培養(yǎng)。

以上生物學(xué)特性試驗中除1.2.3(2)除外，其余均在28 ℃培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑，每個處理設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫果西番蓮炭疽病病原菌的分離、純化和致病性檢測

從患炭疽病的紫果西番蓮葉片中分離出到3株真菌，分別編號為X-01、X-02、X-03。分別接種離體葉片結(jié)果表明只有X-03號菌株接種的紫果西番蓮葉片發(fā)病，X-01、X-02菌株和對照組均不發(fā)病(表1)。X-03菌株針刺接種和無針刺接種的葉片均在6 d后出現(xiàn)可見病斑，接種部位呈黃褐色至黑褐色，周圍出現(xiàn)黑褐色小斑點，第10天病斑逐漸擴大，連成一片(圖1)。在葉片發(fā)病部位用組織分離法分離所得到的菌株菌落表型特征和X-03一致，表明X-03號菌株為引起紫果西番蓮炭疽病的病原菌。

2.2 X-03的形態(tài)特征

X-03菌株在PDA平板生長旺盛，菌落正面初始為粉白色、圓形、邊緣整齊，菌絲表面呈絨毛狀、較疏松，菌落背面為淺黃色菌落。后期菌落逐漸呈粉紅色，正面呈現(xiàn)中心圓環(huán)形隆起，向外輻射生長，第10 d后在菌絲表面形成大量橘黃色孢子堆；菌落背面以接種菌餅為中心，菌絲向外輻射環(huán)形生長。該菌分生孢子直，棒形，單孢、無色，內(nèi)含原生質(zhì)顆粒，頂端鈍圓一端漸尖，大小為10.33～20.03 μm×2.89～5.84 μm，平均大小為15.54 μm×4.89 μm，長寬比2.31～4.54。該病原菌和刺盤孢屬(Colletotrichum)的典型形態(tài)特征相符[15](圖2)。

圖1 離體葉片接種X-03第10天結(jié)果Fig.1 Symptoms of the leaves inoculated with X-03 after 10 days

菌株Strains針刺部位Acupuncturesite處理時間(d)Time1～5678910X-01菌株正面針刺------反面針刺------正面非針刺------反面非針刺------X-02菌株正面針刺------反面針刺------正面非針刺------反面非針刺------X-03菌株正面針刺-+++++++++++反面針刺-+++++++++++正面非針刺-+++++++++++反面非針刺-+++++++++++對照4種處理------

注：-表示葉片生長健康；+表示葉片現(xiàn)可見病斑；++表示可見病斑擴大；+++表示病斑變黑，葉片腐爛。 Note: -means leaf grow healthily; + means visible diseased spots; ++ means visible bigger diseased spots; +++ means visible black diseased spots and the leaves start decay.

2.3 X-03的ITS和GPDH基因測序和系統(tǒng)聚類分析

X-03的ITS和GDPH的擴增序列分別為573和225 bp。利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建了ITS和GDPH構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)。X-03與C.brevisporum、G.magna聚為一支，節(jié)點支持率為99 %，說明三者親緣關(guān)系較近；X-03與C.cliviae也有一個節(jié)點，節(jié)點支持率為100 %，說明二者的親緣關(guān)系也較近。系統(tǒng)進化分析表明X-03與刺盤孢屬(Colletotrichum)真菌的親緣關(guān)系最近，綜合形態(tài)學(xué)特征分析，X-03菌株被鑒定為刺盤孢屬 (Colletotrichumsp. X-03)。

2.4 病原菌X-03的生物學(xué)特性研究

2.4.1 不同碳源和氮源對X-03菌株生長的影響 X-03菌株對供試的5種氮源均能利用，菌落在不同氮源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異，該菌生長的最適氮源是NaNO3，其與蛋白胨、甘氨酸、NH4Cl和NH4NO3達到極顯著差異。供試的5種碳源均能利用，菌落在不同碳源培養(yǎng)基上的生長速度差異不明顯，該菌生長的最適碳源是葡萄糖，其與乳糖、淀粉達到極顯著差異(表2)。

2.4.2 不同溫度對X-03菌落生長的影響 接種在PDA上的X-03在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長，其最適的生長溫度為15～20 ℃，在35 ℃時生長緩慢(圖 4)。

A：菌株X-03的菌落形態(tài)特征；B：40倍鏡下觀察到的分生孢子，標(biāo)尺為10 μmA: Colony of X-03; B: conidia of X-03 are observed under the microscope, and the bar is 10 μm圖2 菌株X-03的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of X-03

圖3 X-03基于ITS和GPDH序列構(gòu)建的NJ樹 Fig.3 The phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method based on ITS and GPDH sequences

2.4.3 不同培養(yǎng)基對X-03菌落生長的影響 X-03菌株在PDA、汁PDA、玉米粉、燕麥培養(yǎng)基以及對照上均能生長；菌株在PDA、汁PDA和燕麥培養(yǎng)基上生長較快，3者之間差異不顯著(P>0.05)，但它們與玉米粉培養(yǎng)基和對照的差異極顯著(P<0.01)(圖5)。2.4.4 不同pH對X-03生長和孢子萌發(fā)的影響 在PDA培養(yǎng)基中，X-03菌絲和分生孢子萌發(fā)適宜的pH值范圍較廣，在pH 3～11均能生長和萌發(fā)。pH 8～9時該菌的菌落直徑最大，同時孢子的萌發(fā)率也最高(表3)。

表2 不同氮源和碳源對X-03菌株生長的影響

注：表中不同大寫字母表示在P<1 %水平差異極顯著，不同小寫字母表示在P<5 %水平差異顯著。下同。 Note: Different capital letters mean significant difference at the 1 % level, different lowercase letters mean significant difference at the 5 % level. The same as below.

表3 不同pH對X-03菌株生長和孢子萌發(fā)的影響

表4 溫度對X-03孢子萌發(fā)的影響

注：+表示孢子可萌發(fā)；-表示孢子不萌發(fā)。

Note： + means that spores can germinate; -means that spores cannot germinate.

圖4 不同培養(yǎng)溫度對菌絲生長的影響Fig.4 Effect of different temperature on mycelial growth

圖5 不同培養(yǎng)基對X-03菌絲生長的影響Fig.5 Effect of different media on mycelial growth

2.4.5 溫度對X-03孢子萌發(fā)的影響 接種在PDA上的X-03菌株孢子在35～45 ℃均能萌發(fā)，50 ℃以上孢子不能萌發(fā)(表4)。

2.5 不同殺菌劑對X-03菌落生長的影響

與對照相比，4種殺菌劑對該菌的生長均有抑制作用。福美雙對該菌株的抑制效果最好，其次是百菌清和甲霜靈，抑制效果最差的是撲海因(圖6)。

3 討 論

3.1 紫果西番蓮病原菌的分離鑒定

對紫果西番蓮炭疽病葉片病菌進行分離與純化得到3個菌株，其中X-03為引起紫果西番蓮炭疽病發(fā)病的病原菌。X-03接種離體葉片結(jié)果表明葉片有無傷口均能發(fā)病，說明該菌通過直接侵染或機械傷口均能侵染紫果西番蓮，因此在種植時要注意病蟲害的及時防治和考慮合理種植密度，避免害蟲造成的傷口和種植密度太大葉片發(fā)生摩擦使葉片受到機械損傷產(chǎn)生傷口，從而通過傷口侵入加速該病害的傳染和擴散。依據(jù)X-03菌株的分生孢子和菌落形態(tài)等表型特征，并結(jié)合ITS和GPDH基因的系統(tǒng)進化分析結(jié)果把X-03菌株鑒定為刺盤孢屬(Colletotrichumsp. X-03)真菌。

圖6 不同殺菌劑對菌絲生長的影響Fig.6 Effect of different germicides on mycelial growth

3.2 病原菌生物學(xué)特性研究

X-03菌株對營養(yǎng)要求不高，能利用的碳源和氮源較廣。最適的生長培養(yǎng)基為PDA，對供試的5種碳源均能利用，最適碳源為葡萄糖和蔗糖，說明該菌能很好利用單糖、雙糖類中的碳源，這與多數(shù)真菌對碳源的利用能力相同[16-19]；對供試的5種氮源均能利用，最適氮源為NaNO3，說明X-03可能是嗜硝態(tài)氮類真菌；pH 8～9時分生孢子的萌發(fā)率最高，菌絲的生長也最好；X-03在15～20 ℃生長速度最快。本研究結(jié)果與該病害易在初春季節(jié)侵染葉片，引發(fā)葉斑病的發(fā)病規(guī)律相吻合。

3.3 殺菌劑對病原菌X-03生長的影響

供試的4種殺菌劑對X-03菌株的生長均有抑制作用。福美雙對該菌株的抑制效果最好，其次是百菌清和甲霜靈，撲海因效果最差。供試殺菌劑對該病在大田的防治效果需進一步試驗驗證。

4 結(jié) 論

引起紫果西番蓮葉片炭疽病的病原菌為刺盤孢屬(Colletotrichumsp. X-03)真菌，該病害易于初春傳播蔓延，福美雙對該病害的防治效果較好。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Study on Identification and Biological Characteristics of Anthracnose Pathogen ofPassifloraedulis

XIE Mei-hua1,2,3, YANG Jin-kui2, LI Xue-ling1,3, YANG Hai-yan1,3*, CHEN Li-li1, WU Fan1

(1.Department of Chemistry and Life Science, Chuxiong Normal University, Yunnan Chuxiong 675000, China; 2.Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources, Key Laboratory of Microbial Diversity in Southwest China, Ministry of Education, Yunnan University, Yunnan Kunming 650091, China; 3.Yunnan Province Applied Biology Key Laboratory of University, Yunnan Chuxiong 675000, China)

【Objective】The pathogen (X-03) of plant anthracnosis was identified fromPassifloraedulis, and it’s biological characteristics and inhibition effect of four fungicides on X-03 were investigated. 【Method】Morphologic observation combined with molecular biological techniques were employed in the paper. 【Result】The results showed that X-03 belonged to genusColletotrichum, and the optimal growth condition for this fungus was 15-20 ℃ and pH 8-9, while the spores could not germinate when the temperature over 50 ℃. The most suitable medium was PDA for X-03, and the optimal C and N sources were glucose and NaNO3, respectively. The inhibitory effect of Thiram on X-03 was more obvious than other tested germicides. 【Conclusion】This study could provide a theoretical basis for the prevention and control of anthracnose ofPassifloraedulis.

Passifloraedulis; Anthracnosis; Pathogen; Biological characteristics

1001-4829(2017)6-1358-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.021

2016-11-15

楚雄師范學(xué)院后備人才資助項目(XJRC1502)；云南省重點建設(shè)學(xué)科，楚雄師范學(xué)院重點建設(shè)學(xué)科基金項目(05YJJSXK03)；云南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃項目(IRTSTYN)；云南省教育廳項目(2014Y443)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項目(2017ZZX016)

謝美華(1981-)，女，云南楚雄人，實驗師，碩士研究生，主要研究方向為微生物分子生物學(xué)，E-mail: xiemeihua@cxtc.edu.cn，Tel:0878-3100784, *為通訊作者：楊海艷，E-mail:haiyanyang@cxtc.edu.cn。

S667.9

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