廣西野生蕉種質(zhì)資源調(diào)查與鑒定

龍 興，秦獻泉，方 仁，鄧 彪，安振宇，黃偉雄，堯金燕

(廣西農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，廣西 南寧 530007)

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廣西野生蕉種質(zhì)資源調(diào)查與鑒定

龍 興，秦獻泉，方 仁，鄧 彪，安振宇，黃偉雄，堯金燕*

(廣西農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，廣西 南寧 530007)

【目的】較全面地收集并鑒定廣西野生蕉種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和分類地位，為廣西野生蕉資源的保護和利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎萌旧w制片壓片法、形態(tài)學分類法和熒光AFLP標記分別對廣西境內(nèi)的14份野生蕉種質(zhì)進行染色體倍性、形態(tài)學分類和親緣關(guān)系的鑒定與研究?！窘Y(jié)果】形態(tài)學分類鑒定表明，供試的14份野生蕉種質(zhì)資源染色體倍性均為二倍體，2n=22(x=11)。其中2份鑒定為M.acuminatasubsp.malaccensis種，其余12份鑒定為M.itinerans種，種間形態(tài)學性狀差異較大?；贏FLP標記的鑒定結(jié)果表明廣西野生蕉資源具有豐富的遺傳多樣性，與形態(tài)學鑒定結(jié)果基本一致?！窘Y(jié)論】供試的14份野生蕉均屬于芭蕉屬真蕉組(Eumusa)，其中2份歸屬為小果野蕉亞種，12份歸屬為阿寬蕉，該種在廣西分布較普遍。AFLP鑒定結(jié)果顯示廣西野生蕉種質(zhì)資源間遺傳差異較大，與栽培蕉親緣關(guān)系也較遠。

野生蕉；種質(zhì)資源；分類鑒定；形態(tài)學標記；AFLP；廣西

【研究意義】野生蕉是芭蕉屬野生近緣種植物的統(tǒng)稱，我國地處全球主要香蕉野生種質(zhì)資源分布區(qū)域的北緣，云南、海南、福建、廣東及廣西等省(區(qū))均擁有豐富的野生蕉資源[1-3]。廣西地處低緯，氣候環(huán)境非常適宜野生蕉種質(zhì)資源繁衍，在許多市縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)均發(fā)現(xiàn)了野生蕉的分布，資源十分豐富，然而缺乏系統(tǒng)深入的鑒定及遺傳關(guān)系研究，致使在優(yōu)異基因資源挖掘與利用上受到很大限制。因此開展廣西野生蕉種質(zhì)的調(diào)查和鑒定研究對于資源的保護和利用具有重要意義。【前人研究進展】李錫文[3]、劉愛忠[4]和Hakkinen[5]等學者對分布于我國云南等地區(qū)的香蕉野生種質(zhì)資源均有系統(tǒng)研究和報道。關(guān)于廣西野生蕉類資源的研究目前僅有少量報道[6-7]，有待鑒定與發(fā)掘利用。 在香蕉種質(zhì)鑒定的諸多方法中，形態(tài)學標記一直被視為蕉類種質(zhì)資源分類的主體方法。自從1947年Cheesman[8]依據(jù)染色體數(shù)目和形態(tài)學性狀等將芭蕉屬植物劃分為四個組蕉類形態(tài)學標記分類系統(tǒng)經(jīng)過多位學者[9-10]的補充完善，已具有較好的規(guī)范性和合理性。與形態(tài)學標記相比DNA分子標記在種質(zhì)資源鑒定應(yīng)用中具有更穩(wěn)定高效的優(yōu)越性。目前RFLP、RAPD、SSR、ISSR及AFLP等分子標記技術(shù)在果樹親緣關(guān)系與品種鑒定研究中大量應(yīng)用，其中AFLP標記技術(shù)因具有穩(wěn)定性高、重復性好、多態(tài)性檢測效率高的特點，在國內(nèi)外香蕉品種鑒定和遺傳多樣性的研究上廣泛成功應(yīng)用[11-15]，有助于解決形態(tài)學分類方法的不足?！颈狙芯壳腥朦c】由于目前許多形態(tài)標記遺傳表達易受環(huán)境和發(fā)育期的影響[1]，且對于組間雜交種或特異種質(zhì)的鑒定適應(yīng)性不強[15]，因此結(jié)合分子標記技術(shù)鑒定能更利于種質(zhì)資源鑒定和遺傳關(guān)系研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】長期著力于對廣西境內(nèi)野生蕉資源的收集，并利用形態(tài)學分類和AFLP標記技術(shù)對其進行鑒定，旨在探討廣西野生蕉的遺傳背景，為其在香蕉遺傳改良上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 野生蕉的調(diào)查和收集

從2013年4月至2016年8月，在廣西境內(nèi)14個地縣開展野生蕉類種質(zhì)資源分布情況的調(diào)查與收集工作，觀察記錄其在分布地的各種性狀，并采集野生種質(zhì)的吸芽。

1.2 野生香蕉種質(zhì)資源的鑒定

1.2.1 染色體倍性鑒定 ①材料準備:廣西農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所香蕉資源圃內(nèi)挖取野生種質(zhì)的第二代吸芽吸芽(種質(zhì)名稱和來源見表1)，取高40～70 cm的劍葉芽假植于沙床中，25～30 ℃條件下進行培養(yǎng)生根，待新根長出后(3～5 d)取長約1 cm、粗約0.2 cm的新鮮不定根用于染色體制片和分析。② 染色體制片:參照李懋學[16]壓片法，結(jié)合去壁低滲法，略作修改。步驟為：預處理、前低滲、固定、酸解、后低滲、染色壓片。取材時間為早上7:00-8:00， 預處理用0.02 M 8-羥基喹啉+0.2 %秋水仙素混合液處理4 h。用0.075 M KCl溶液前低滲30 min，酸解用1 mol/L的鹽酸60 ℃水浴中解離10 min，再轉(zhuǎn)入0.075M KCl溶液后低滲10 min。用蒸餾水沖洗3次，最后染色，壓片。③染色體計數(shù)和倍性的確定。用Olympus顯微鏡在10倍目鏡，100/1.35油鏡下觀察。每個樣品觀察5個根尖，挑選至少30個完整、染色體清晰、分散好的細胞進行計數(shù)，以占優(yōu)勢細胞染色體數(shù)目作為該種的染色體數(shù)目。蕉類存在隨體與小染色體混在一起，二倍體(2x=22)蕉類多1～2條，三倍體(3x=33)多1～3條[17]。所以將染色體數(shù)目為23、24的細胞和34、35、36的細胞分別計算在二倍體和三倍體細胞范圍內(nèi)。

1.2.2 形態(tài)學鑒定 形態(tài)學描述參考INIBAP1995年修訂的《Descriptors for Banana(Musaspp.)》[10]，形態(tài)學分類采用Simmonds(1962)[9]分類法則。

1.2.3 AFLP分子標記鑒定 樣品選取與準備。為鑒別廣西野生蕉與栽培蕉之間的親緣關(guān)系，在AFLP標記鑒定中加入10個栽培種(包括AAA、ABB和AA3個基因型)和1個長梗蕉(BB基因型)，供試種質(zhì)如表2所示。選取健壯、無病蟲危害種質(zhì)的嫩葉置于保鮮薄膜袋，裝入冰壺中3 h內(nèi)攜回實驗室，以自來水和無菌水沖洗后立即提取DNA，或吸水紙吸干葉面水份后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

表1 野生蕉類材料及來源

表2 AFLP分析所用香蕉種質(zhì)材料

注：字母Z開頭的種質(zhì)資源為栽培蕉類型，字母Y開頭的表示野生蕉類型，字母后面數(shù)字為泳道編號。 *為了驗證分子標記的準確性，特設(shè)兩對相同的種質(zhì)(泳道1,2和泳道13,14)做標記。 Note: The germplasms of the letter Z forMusacultivation and the letter Y for wildMusa, the figures behind the letter for the lane number.*In order to verify the accuracy of molecular markers, ad hoc two pairs of the same germplasm(lane1,2 and lane 13,14)mark.

DNA提取、AFLP擴增及產(chǎn)物檢測。總DNA提取采用改進的CTAB法。AFLP分析試劑盒(EcoRI/MseI型)從北京鼎國生物技術(shù)有限公司購買。從試劑盒提供的64對引物中篩選8對多態(tài)性好的引物進行擴增。反應(yīng)程序及詳細步驟參照文獻[18]。利用GeneScan 3．1軟件將8對熒光引物產(chǎn)生的電泳膠圖轉(zhuǎn)換為(0，1)矩陣。用NTSYSpc-2.11F軟件進行數(shù)據(jù)分析。對原始矩陣用SimQual程序求DICE相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣。用 SHAN程序中的 UPGMA方法進行聚類分析，并通過 Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西野生蕉的分布與收集情況

廣西境內(nèi)野生蕉資源豐富且跨域大，北至資源縣，南至憑祥縣，西至天峨縣，東至博白縣都發(fā)現(xiàn)有野生蕉分布，其中在百色縣、博白縣、防城港市防城區(qū)仍保存著面積達130～450 hm2，分布密度較大的蕉群。廣西野生蕉種質(zhì)多數(shù)集中生長在海拔260～700 m土壤濕潤的原始林山谷中，少數(shù)生長在坡面，甚至海撥較高的山坡上，如大明山野蕉分布在海撥1000 m以上的高處，百色市右江區(qū)野生蕉分布則從山谷一直延伸至山頂。由于廣西境內(nèi)野生蕉分布區(qū)域氣候變化較大，分布在桂南地區(qū)海撥較低的部分野生蕉可全年開花，而分布在桂北或高海撥地區(qū)的野生蕉花期主要集中在7-9月，但植株能承受冬季零度左右的寒冷氣溫?？梢姀V西野生蕉分布地形復雜，生態(tài)環(huán)境差異較大，可能攜帶著不同的抗性基因，可用作香蕉遺傳改良的育種材料。本研究共收集到14種野生蕉種質(zhì)資源樣品。

2.2 廣西野生蕉的形態(tài)特征

從表3可以看出，廣西野生蕉多數(shù)具有明顯的匍行莖，部分在假莖高度、雄蕾形狀、苞片顏色及果指色澤等性狀上有明顯的差別，如不同野生蕉資源抽蕾時假莖高度最小的為112 cm，最大的達589 cm；雄蕾形狀有陀螺狀等4個類型；苞片背部顏色以紫紅色為主，多數(shù)帶彩紋或褪色線，以黃，綠或黃綠條紋為主。果指青果色澤有紫紅、黃、青色等3種。

2.3 廣西野生蕉的鑒定

2.3.1 染色體倍性的鑒定 從表4可知：供試的14份廣西野生蕉種質(zhì)染色體二倍體細胞百分比都在90.00 %以上，平果野蕉最高占98.61 %，因此可以確定供試的14份野生蕉染色體為二倍體，染色體數(shù)目2X=22，部分野生蕉細胞染色體圖像情況見圖1所示。

表3 廣西野生蕉種質(zhì)資源形態(tài)學描述部分性狀

表4 供試野生蕉染色體數(shù)目不同的細胞百分比例(%)

續(xù)表4 Continued table 4

種質(zhì)名稱Name細胞數(shù)Cell缺失非整倍體細胞Missingofaneuploidcells二倍體細胞(%)Diploidcells增多非整倍體細胞Increasedofaneuploidcells臨桂野蕉Lingui663.031.5286.364.554.55大明山野蕉Damingsha-n886.844.2773.505.987.691.71天峨野蕉Tian'e634.722.8378.305.666.600.94梧州野蕉Wuzhou934.302.1581.725.386.45平果野蕉Pingguo721.392.7881.948.335.56

圖1 染色體倍性為2n=22(x=11)的靈川野蕉(左)和憑祥野蕉(右)Fig.1 The Lingchuan (left) and Pingxiang (right) wild Musa chromosome ploidy are 2n=22(x=11)

2.3.2 廣西野生蕉形態(tài)學鑒定 供試的14種廣西野生蕉種質(zhì)染色體倍性均為2n=22(x=11)，根據(jù)Simmonds[9]分類法則中A-Y25個性狀對14份廣西野生蕉的性狀鑒定歸類到表5。形態(tài)性狀歸類結(jié)果表明本研究的14份廣西野生蕉種質(zhì)資源均屬于芭蕉屬(Musa)。

表5 供試野生蕉形態(tài)學性狀歸類

續(xù)表5 Continued table 5

材料名Name染色體數(shù)Chromosomenumbers各性狀歸類(A-Y根據(jù)表)Thetraitsclassified(A-Y)A/B/C/D/E/F/G/H/I/J/K/L/M/N/O/P/Q/R/S/T/U/V/W/X/Y所屬的種Speices大明山野蕉Damingshan223/2/2/1/1/1/2//3/2/2/2/2/2/2/1/1/2/2//2/1/2/1/3/1/2M.intinerans天峨野蕉Tian'e223/1/3/1/1/2/2//2/3/2/2/2/1/2/1/1/2/3//2/1/2/1/3/1/2M.intinerans梧州野蕉Wuzhou223/1/3/1/1/2/2//2/3/2/2/2/1/2/1/1/2/3//2/1/2/1/3/1/2M.intinerans平果野蕉Pingguo223/1/3/1/1/2/2//2/3/2/2/2/1/2/1/1/2/3//2/1/2/1/3/1/2M.intinerans

(1)芭蕉屬中組的分類。根據(jù)芭蕉屬中組的分類系統(tǒng)，除憑祥野蕉、靖西野蕉和大明山野蕉外，其余野生資源均與分類法則一致，可確定為真蕉組(Eumusa)，這3份野生蕉在分類檢索的假莖高度性狀處與形態(tài)學分類系統(tǒng)描述不一致，無法按法則進一步分類，其假莖高度均低于2 m(表3)，且根狀莖都小于1 m，但三者花序梗為水平或懸垂，基部花排列雙列，因此兼有Eumusa組和Rhodoclamys組的形態(tài)特性，在對它們25(A-Y)個形態(tài)性狀權(quán)重考量后，本研究認為與Eumusa更為相符，因此，將這3份野生蕉資源也歸屬為Eumusa組。

(2)野生蕉種的分類與鑒定。參照野生蕉真蕉組的分類標準，憑祥野蕉與靖西野蕉可歸屬為M.acuminatasubsp.malaccensis種；百色野蕉種的形態(tài)學分類鑒定中存在分類結(jié)果與客觀不符的情況，按分類檢索法則，百色野蕉因具有“果實成熟時開裂”的性狀，可劃歸為M.schizocarpai種，但M.schizocarpa種的顯著特征為具水綠色假莖以及雄蕾苞片綠色，與百色野蕉假莖黃綠色及雄蕾苞片紫褐色特征不一致。百色野蕉的25(A～Y)個形態(tài)學特征中除了果指開裂性狀外，其余與M.itinerans種的形態(tài)特征高度相符，鑒于此，本研究認為其應(yīng)歸屬為M.itinerans種更合理。大明山野蕉根狀莖小于1 m，在真蕉組分類檢索根狀莖處與分類法則不一致。因根狀莖大于1 m是真蕉組的主要特征，但在組的分類上，大明山野蕉是份比較特殊的種質(zhì)，其兼有真蕉組和觀賞蕉組的主要特征，綜合考量了其它性狀后將其歸屬于真蕉組，大明山野蕉根狀莖性狀在真蕉組中的分類權(quán)重應(yīng)當弱化，依據(jù)其它主要形態(tài)學性狀大明山野蕉在此也將其歸屬于M.itinerans種；其余野生蕉資源均與M.itinerans種分類性狀相符(圖2～3)。

圖2 廣西野生蕉形態(tài)標記分類圖Fig.2 The dendrogram of Guangxi wild banans based on morphological traits

A:憑祥野蕉；B:靖西野蕉；C：大明山野蕉；D：百色野蕉A:Wild Musa from Pingxiang; B: Wild Musa from Jinxi; C: Wild Musa from Damingshan;D: Wild Musa from Baise圖3 4份特殊廣西野生蕉種質(zhì)Fig.3 Four special wild banana germplasm in Guangxi

引物組合Primercombination總帶數(shù)No.oftotalband多態(tài)性帶數(shù)No.ofpolymorphicband多態(tài)性位點百分率(%)PercentageofpolymorphicbandAAC/CTA16115898.1AAC/CTG15415399.4AAC/CTT16616599.4ACT/CAA17316696ACT/CAC16416298.8ACT/CTG15114092.7ACT/CTT15715095.5ACG/CTG979496.9總計Total12231188平均Average152.9148.597.1

2.3.3 廣西野生蕉種質(zhì)AFLP分子標記鑒定 (1) AFLP多態(tài)性。本研究選取8對引物組合(表6)對25份蕉類種質(zhì)進行AFLP分析，各份種質(zhì)均獲得較好的擴增效果，產(chǎn)生的譜帶清晰，多態(tài)性高。引物組合AAC/CTG、AAC/CTT、AAC/CTA 和ACT/CAC擴增效果相對較好，其中引物對E-ACT/M-CAC的擴增結(jié)果見圖4(自左而右1～30代表泳道編號，編號所代表的種質(zhì)如表2所列)。8對引物平均多態(tài)性比率為97.1 %。特異條帶占23.2 %， 可見，本研究供試蕉類種質(zhì)的AFLP擴增譜帶多態(tài)性非常高，充分體現(xiàn)供試蕉類種質(zhì)間具有豐富的遺傳多樣性。

(2)供試香蕉種質(zhì)的聚類分析。根據(jù)所選用的8對引物組合擴增后得到的1188條多態(tài)性條帶進行親緣關(guān)系和UPGMA聚類分析，獲得25份供試香蕉材料的親緣關(guān)系樹狀圖(圖5)。25個樣品的成對相似系數(shù)在0.39～0.78。依閥值0.53的水平，可以將25份香蕉種質(zhì)劃分為4個類群。從樹狀圖可以看出供試蕉類各類群之間的親緣關(guān)系，相似系數(shù)越小表明其親緣關(guān)系越遠，供試廣西野生蕉相互間相似系數(shù)比較低，介于0.39～0.65，說明廣西野生蕉遺傳多樣性豐富外，種質(zhì)間遺傳差距較大。其中除了靖西野蕉、憑祥野蕉、靈川野蕉、博白野蕉和防城野蕉遺傳距離較遠外，其余廣西野生蕉資源相似系數(shù)為0.58～0.65，親緣關(guān)系相對較近。廣西野生蕉與栽培蕉各類群在閥值0.41處相聚，表明它們的遺傳距離非常明顯。栽培蕉在樹狀圖中被劃分為兩個類群，其中類群Ⅰ中包含1份AA基因型和5份AAA基因型的香牙蕉品種，相似系數(shù)為0.60～0.70，表明親緣關(guān)系較近。類群Ⅲ包括1份長梗蕉和4份ABB基因型的粉蕉，類群內(nèi)相似系數(shù)為0.62～0.78，遺傳關(guān)系較近。但兩個栽培蕉類群間在相似系數(shù)0.41處相聚，表明它們的遺傳差異十分明顯。依據(jù)不同閥值可將25份蕉類材料進一步細分，從樹狀聚類圖可知，利用AFLP標記對蕉類種群的劃分，跟前人的研究結(jié)論及本研究形態(tài)學標記分析結(jié)果基本一致，說明形態(tài)學標記分類系統(tǒng)具有一定的合理性。

圖4 由引物對E-ACT/M-CAC擴增產(chǎn)生的熒光AFLP指紋圖譜 Fig.4 The fluorescence AFLP fingerprint produced by primer combinations E-ACT/M-CAC

(3) 供試蕉類各種質(zhì)親緣關(guān)系分析。從聚類圖(圖5)可知，供試的14個廣西野生蕉材料相互之間相似系數(shù)為0.39～0.65，在分子水平上體現(xiàn)了豐富的物種多樣性。在相似系數(shù)0.53和0.54處分別劃分為類群Ⅱ和類群Ⅳ兩個類群，與其它栽培蕉類群區(qū)分明顯。在類群Ⅱ中，僅有憑祥野蕉和靖西野蕉2份種質(zhì)，其在閥值0.39處與其它廣西野生蕉類群相聚，達到種一級分類單位差異的水平，在供試材料中親緣關(guān)系最遠。這與形態(tài)鑒定此兩種野生蕉種質(zhì)為M.acuminatasubsp.malaccensis種鑒定結(jié)果一致。在類群Ⅳ中，各野生蕉資源表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，遺傳相似系數(shù)為0.53～0.65，聚類有趨向于來源地理相近分布位置的傾向。在閥值0.58處靈川野蕉、防城野蕉及博白野蕉分別獨立成組，這3種野蕉種質(zhì)在植物學形態(tài)特征上均有與其它野生蕉不同之處有關(guān)，如博白野蕉的幼果為青色，隨著果實的發(fā)育，逐漸轉(zhuǎn)為紫紅色，成熟時整個果指都轉(zhuǎn)為紫紅色，成熟后顏色變化不大。靈川野蕉和防城野蕉葉柄基部對稱且有稀疏的斑塊，果序梗上毛少，苞片外表面紅紫色，有黃色線，游離瓣片頂部有皺折，與其它野生蕉明顯不同，表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異性。在栽培蕉類群Ⅰ中，除了海貢蕉(Musa.AA)為AA基因組類型，其余均為AAA基因組型的香牙蕉品種, 它們都含有A基因組。在栽培蕉類群Ⅲ中，含有B基因組的長梗蕉(BB.M.balbisiana)和基因型為ABB類型的粉蕉的聚為一類，親緣關(guān)系上與B基因組靠近。供試的14種廣西野生蕉種質(zhì)均有大量種子，它們與長梗蕉在相似系數(shù)0.42處相聚，分類差異明顯，表明它們之間的親緣關(guān)系較遠。本試驗電泳圖譜中，泳道1，泳道2都是海貢蕉，泳道13，泳道14都是靈川野蕉，他們的AFLP指紋圖譜完全一致(圖4)，充分說明本試驗的AFLP分子標記結(jié)果重復性好，其所體現(xiàn)的聚類結(jié)果是可靠的。

圖5 根據(jù)AFLP分子標記聚類分析產(chǎn)生的樹狀分支Fig.5 A dendrogram based on AFLP markers generated by UPGMA

3 討 論

3.1 關(guān)于幾份特殊種質(zhì)的分類地位探討

依芭蕉屬分組特征，與靖西野蕉、憑祥野蕉和大明山野蕉染色體倍性相符的有Rhodochlamys組與Eumusa組。從形態(tài)學上看，它們假莖高度都在2 m以下、根狀莖短的形態(tài)學性狀與Rhodoclamys組相符；而花序梗呈懸掛，果指垂直于果穗，每個苞片間花多個、排成兩列，苞片外表面無光澤、紫褐色等形態(tài)性狀又與Eumusa相符。由于它們的形態(tài)性狀與分類系統(tǒng)描述不一致，依照形態(tài)學分類方法顯然無法將它們進行鑒別分組。鑒于這3種野生蕉的形態(tài)特性，或存在它們是兩組間自然回交或漸進滲透的可能，也存在受生長環(huán)境影響而發(fā)生變異的可能。大明山野蕉長期生長在海撥1000 m以上的山上，存在為適應(yīng)高海撥和低溫影響而在假莖高度及根狀莖上發(fā)生變異的可能。對于這些較為特殊的野生蕉種質(zhì)，目前形態(tài)學分類并無標準的分類法則可依。根據(jù)Simmonds[9]對野生蕉的分類檢索標準，假莖高度和花序梗著生位置處于同一權(quán)重水平，但蕉類假莖高度性狀易受生長環(huán)境和生長年限的因素影響，而花序梗著生位置與果指排列是穩(wěn)定遺傳性狀。本研究認為，在這3份野生蕉種質(zhì)的分組形態(tài)學鑒定中應(yīng)側(cè)重考慮花序梗著生位置和果指排列的權(quán)重，并綜合考量其它25(A-Y)個形態(tài)學性狀。因此，本研究在態(tài)學分類上將這3份野生蕉歸屬為真蕉組(Eumusa)。

在AFLP親緣關(guān)系分析中，靖西野蕉和憑祥野蕉在閥值0.55處聚為一類群，與其它阿寬蕉在閥值0.39處相聚，說明它們親緣關(guān)系非常遠。大明山野蕉與其它阿寬蕉在閥值0.62處相聚，在親緣關(guān)系上與阿寬蕉較為接近，鑒定結(jié)果與形態(tài)學分類相符。這三種形態(tài)學特征介于真蕉組與美蕉組的野生蕉在AFLP標記中的分析結(jié)果支持了本研究的形態(tài)學鑒定結(jié)論。

關(guān)于百色野蕉的形態(tài)學鑒定，在本研究的前期研究中[19]因其具有“沒有或很少蠟粉、果實成熟時開裂”的形態(tài)性狀而依據(jù)形態(tài)學分類法則鑒定為M.schizocarpai種。M.schizocarpai種的顯著形態(tài)特征是具水綠色假莖以及雄蕾苞片綠色，目前只在巴布亞新幾內(nèi)亞發(fā)現(xiàn)被報道過，與百色野蕉的顯著形態(tài)學特征差異明顯。在形態(tài)學性狀分類中存在給哪個性狀優(yōu)先權(quán)的問題，對于形態(tài)學性狀與形態(tài)學分類系統(tǒng)描述不一致的特殊種質(zhì)，應(yīng)當綜合權(quán)衡其分類性狀的優(yōu)先權(quán)才能得出最接近客觀的鑒定結(jié)果。如果僅因“沒有或很少蠟粉、果實成熟時開裂”的形態(tài)性狀將百色野蕉鑒定為M.schizocarpai種顯然依據(jù)不夠科學。在綜合考量其它形態(tài)學性狀后，本研究將其鑒定為M.itinerans種，該鑒定結(jié)論在AFLP分析聚類圖(圖5)中也得到了印證。

3.2 本研究中形態(tài)學標記分類與AFLP標記分析結(jié)果的比較

本研究中形態(tài)學標記鑒定結(jié)果表明形態(tài)學分類系統(tǒng)基本能將供試蕉類種質(zhì)資源鑒定到種、個別亞種或組群的水平。但對于一些形態(tài)學性狀與分類系統(tǒng)描述不一致的特異種質(zhì)很難按形態(tài)學分類法則進行鑒定。野生蕉類由于生長環(huán)境等方面的影響，形態(tài)特征與遺傳物質(zhì)間并無嚴格的對應(yīng)關(guān)系，且在形態(tài)學性狀分類檢索中存在給哪個性狀優(yōu)先權(quán)與權(quán)重衡量的問題。此時需要全面考量并對主要形態(tài)性狀的優(yōu)先權(quán)進行衡量取舍才能得出合理的鑒定結(jié)果。如依照分類法則對百色野蕉的鑒定結(jié)論顯然與客觀事實不符。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)形態(tài)學標記鑒定均為M.Itinerans種的野生蕉種質(zhì)資源，在形態(tài)學特征上推測本應(yīng)遺傳關(guān)系較為相近，但在AFLP聚類圖上顯示它們的相似系數(shù)為0.53～0.65，可能原因是表型特征不能完全反映DNA水平差異，此現(xiàn)象與姜燕[20]相關(guān)研究觀點一致。可見，形態(tài)學標記分類方法不足以完全明確蕉類種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，且對一些特異的種質(zhì)鑒別存在一定的不足。因此，形態(tài)學分類如能結(jié)合分子標記等分類手段確定形態(tài)學性狀的權(quán)重，相互印證鑒定結(jié)果將更為準確。

AFLP分子標記在國內(nèi)外蕉類種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和分類鑒定中已取得廣泛的成功應(yīng)用。易干軍等[11-12]應(yīng)用AFLP技術(shù)對粉蕉、大蕉、龍牙蕉品種進行遺傳多樣性分析表明僅參照形態(tài)學分類方法簡單歸為AAB或ABB等類型不能反映品種之間的親緣關(guān)系。WONG C etc[13]應(yīng)用AFLP技術(shù)對芭蕉屬下屬的5個組間親緣關(guān)系進行了分析，揭示了具有不同染色體數(shù)目的分類組間的多態(tài)性和親緣關(guān)系。G Ude etc[14]對39份香蕉種質(zhì)進行了AFLP遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，研究結(jié)果表明AFLP不僅可以有效鑒定芭蕉屬不同組間親緣關(guān)系，也可以進一步將組內(nèi)不同類群差異加以區(qū)分。本研究的AFLP分子標記在閥值0.53處將供試蕉類劃分為4個類群，與香(大)蕉傳統(tǒng)的形態(tài)、農(nóng)藝形狀分類基本一致，并能夠反映基因組的相似性及雜交種之間的滲入程度。在廣西野生蕉的親緣關(guān)系分析上，用AFLP技術(shù)可以區(qū)分所有種質(zhì)，并能揭示近緣品種的差異以及特殊種質(zhì)的系統(tǒng)位置。如對百色野蕉、憑祥野蕉、靖西野蕉及其余阿寬蕉的親緣關(guān)系和種內(nèi)各份種質(zhì)的差異是形態(tài)學鑒定無法達到的。因此，本研究認為AFLP分子標記技術(shù)應(yīng)用于蕉類分類，相比于Simmonds分類系統(tǒng)，更能反映出種質(zhì)間基因型的差異。蕉類形態(tài)學標記分類法借助于分子標記等分類手段互相印證才能更可靠的反映蕉類的親緣關(guān)系與進化途徑。

3.3 廣西地區(qū)野生蕉類資源的遺傳多樣性和資源保護

廣西壯族自治區(qū)屬亞熱帶季風氣候區(qū)，具有適合野生蕉類生長的光、溫、水等自然條件。經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)，廣西野生蕉類資源十分豐富。北到與湖南交界的資源縣、灌陽縣等地，南到防城、憑祥等地，西北部的天峨縣及東部的賀州等地均發(fā)現(xiàn)了野生的蕉類資源。這些蕉類資源主要分布在含水量較為豐富的山麓及溝谷邊, 地理條件比較惡劣，在進化過程中積累了較多的遺傳變異,形態(tài)表現(xiàn)豐富，果皮色、葉柄溝槽、苞片形狀和苞片皮外顏色等差異均較大，按果實和花蕾顏色可分為4個基本類型：青果紅蕾、青果黃蕾、紅果紅蕾、黃果紅蕾。本研究對14份廣西野生蕉種質(zhì)的AFLP標記結(jié)果表明廣西野生蕉類具有非常高的遺傳多樣性，或含有抗寒、抗病蟲等優(yōu)異基因。但是，針對廣西豐富的蕉類資源來說，目前的收集和研究還十分有限，仍需要進一步加強實地考察，收集更多的野生蕉資源，以建立完善的廣西野生蕉種質(zhì)資源圃，為廣西野生蕉的親緣關(guān)系與種質(zhì)資源分類鑒定提供更多材料和利用依據(jù)。同時，隨著野生蕉分布區(qū)的開墾和不合理開發(fā)利用，造成廣西野生蕉面積不斷縮減和種質(zhì)流失，有的甚至成為瀕危物種，因此，開展相關(guān)的收集保存和創(chuàng)新利用研究具有重要意義，應(yīng)當引起必要的重視。

4 結(jié) 論

形態(tài)學分類研究結(jié)果表明供試的廣西野生蕉均屬于芭蕉屬真蕉組(Eumusa)，其中憑祥野蕉、靖西野蕉和大明山野蕉與形態(tài)學分類系統(tǒng)描述不完全一致，無法按法則進一步進行分類。本研究在綜合考量這3種野生蕉的形態(tài)學性狀及權(quán)重后，將憑祥野蕉和靖西野蕉歸屬為M.acuminatasubsp.malaccensis種，大明山野蕉歸屬為M.itinerans種，其余11種野生蕉可依分類法則鑒定為M.itinerans種，其在廣西分布較普遍。AFLP鑒定結(jié)果表明廣西野生蕉種質(zhì)間遺傳差異較大，具有豐富的遺傳多樣性，且與栽培蕉親緣關(guān)系較遠。

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(責任編輯 汪羽寧)

Investigation and Identification of Wild Musa Germplasm Resources in Guangxi Province

LONG Xing, QIN Xian-quan, FANG Ren, DENG Biao, AN Zhen-yu, HUANG Wei-xiong, YAO Jin-yan*

(Horticultural Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007,China)

【Objective】The wildMusagermplasms resources were roundly collected in Guangxi province and their genetic relationship and classification status were clarified to provide a theoretical basis for protection and utilization of the wildMusagermplasm.【Method】Based on chromosome tabletting, morphological taxonomy and AFLP labeled with fluorescence methods, genetic relationship of 14 wildMusagermplasms from different regions in Guangxi Province were investigated and studied.【Result】The morphological identification showed that the chromosome ploidy of the 14 wildMusagermplasms were diploid, 2n=22(x=11).2 of them were identified asM.acuminatasubspmalaccensis, and other 12 were identified asM.itinerans, The interspecific morphological traits exhibited relatively difference. The results of AFLP markers revealed a rich genetic diversity among the wildMusagermplasm in Guangxi province, which were consistent with morphological classification.【Conclusion】According to the morphological classification, all the 14 wildMusagermplasms belonged toEumusa. 2 of them were classified intoM.acuminatasubspmalaccensis, the other 12 were classified intoM.itineranswith wide distribution in Guangxi. The results of AFLP showed that significant difference existed among the genetic relationship of the wildMusagermplasms in Guangxi. And they had a distant relationship with culturalMusa.

WildMusagermplasm; Germplasm resource; Classification identification; Morphological marker; AFLP;Guangxi

1001-4829(2017)6-1284-10

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.008

2017-03-01

廣西自然科學基金項目(2014GXNSFBA118099)；廣西農(nóng)業(yè)科學院青年科技專項項目(桂農(nóng)科2014YQ29)；廣西農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務(wù)專項團隊項目(2015YT48)

龍 興(1980-)，男，廣東電白人，碩士，助理研究員，研究方向為果樹育種與栽培，*為通訊作者：堯金燕，E-mail:jinyan.yao@gxaas.net。

S668.1

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