miRNA-195在小鼠早發(fā)精神分裂癥發(fā)病機(jī)制中的作用

王 昉 梅 蕊 彭 樊 呂 路 王 婧

(武漢市精神衛(wèi)生中心司法鑒定科，湖北 武漢 430022)

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miRNA-195在小鼠早發(fā)精神分裂癥發(fā)病機(jī)制中的作用

王 昉 梅 蕊1彭 樊2呂 路1王 婧3

(武漢市精神衛(wèi)生中心司法鑒定科，湖北 武漢 430022)

目的 探究miRNA-195在小鼠早發(fā)精神分裂癥發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 通過LNA-miR195 抑制內(nèi)源性miR-195，Morris水迷宮觀測小鼠行為學(xué)的變化。給小鼠注射10、20和40 mg/kg氯胺酮，檢測miRNA-195的蛋白表達(dá)變化以及行為變化。結(jié)果 LNA-miR195能夠高效抑制內(nèi)源性miR-195的表達(dá)，miR-195的表達(dá)被抑制后小鼠在Morris水迷宮中的潛伏期延長，記憶檢測時(shí)穿越平臺位置的次數(shù)明顯減少，72 h時(shí)從電跳臺平臺上跳下的時(shí)間顯著降低(P<0.05)。不同濃度氯胺酮處理的小鼠miR-195蛋白表達(dá)上調(diào)，顯著影響小鼠體重的增加，雄性和雌性小鼠在Morris水迷宮的空間探索實(shí)驗(yàn)期沒有明顯的差異，在電跳臺階段40 mg/kg處理的雄性小鼠和20 mg/kg和40 mg/kg處理組的雌性大鼠與鹽水對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 miRNA-195在早發(fā)精神分裂癥發(fā)病中具有重要的作用。

miRNA-195；精神分裂癥；行為學(xué)變化

精神分裂癥主要表現(xiàn)為情感、行為、思維之間的不協(xié)調(diào)，是一種多基因參與的疾病。microRNA是一種長度在18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈的RNA，能夠與特定的mRNA靶點(diǎn)結(jié)合，通過降低mRNA的穩(wěn)定性和抑制mRNA的翻譯來控制基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯過程，進(jìn)而對生物的一些性狀造成影響〔1～6〕，前人已經(jīng)對miRNA-195在癌癥、腫瘤的發(fā)生的作用進(jìn)行了大量的研究，但關(guān)于miRNA-195對精神分裂癥的影響研究很少。孫欣羊〔7〕通過對大量的文獻(xiàn)以及數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果證實(shí)miRNA-195可能與精神分裂癥有關(guān)，但miRNA-195如何影響精神分裂癥的發(fā)生，還需要進(jìn)一步的證實(shí)。本研究擬分析miRNA-195對精神分裂癥發(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 主要試劑：SYBR Premix Ex TaqⅡ和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海生物工程有限公司，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氯化鈉、氟化鈉(NaF)、EDTA、礬酸鈉(Na3VO4)購自Sigma公司。主要儀器：超凈工作臺購自北京長城空氣凈化工程公司，超聲波破碎儀購自美國Branson公司，Morris 水迷宮、電跳臺以及記錄儀購自中國，腦立體定位儀購自中國瑞沃德，溫度控制儀購自TC-324B。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF小鼠由本研究室提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度是18℃～24℃，日光燈照明，每12 h明暗交替，自由采食、飲水。動物處理按照1995年神經(jīng)科學(xué)協(xié)會的《動物使用政策》和華中科技大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.3 LNA-miR195 對內(nèi)源性miR-195 的影響 采用立體定位技術(shù)在小鼠大腦海馬齒狀回注射miR-195的抑制劑LNA-miR195，同時(shí)設(shè)置LNA-Scramble為無關(guān)對照及生理鹽水為陰性對照。

1.4 抑制內(nèi)源性miR-195后小鼠行為的變化 采用Norris水迷宮對小鼠行為學(xué)進(jìn)行檢測。注射84 h后，檢測LNA-miR195以及無關(guān)對照和陰性對照的記憶能力。

1.5 氯胺酮處理對miR-195 蛋白表達(dá)的變化 將6周齡大鼠隨機(jī)分組，生理鹽水為對照，設(shè)定氯胺酮給藥組分別為10、20和40 mg/kg。采用腹腔注射，每日1次，連續(xù)1 w。

1.6 新生期氯胺酮重復(fù)處理動物的行為學(xué)變化 取8日齡的小鼠，分別皮下注射10、20和40 mg/kg的氯胺酮，生理鹽水作為對照，重復(fù)處理14 d，觀察行為學(xué)的變化。在此期間所有小鼠正常哺乳并保持良好的飼養(yǎng)環(huán)境。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 LNA-miR195 抑制內(nèi)源性miR-195的表達(dá) 36 h后，RT-PCR結(jié)果顯示LNA-miR195的表達(dá)水平(1.000±0.202)顯著低于LNA-Scramble(5.226±0.411)；并在6 d后仍然有很強(qiáng)的抑制作用(LNA-miR195:0.705±0.106,LNA-Scramble:4.803±0.306；P<0.01)。

2.2 內(nèi)源性miR-195被抑制后小鼠行為的變化 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，LNA-miR195小鼠潛伏期延長(表1)，記憶檢測階段時(shí)穿越平臺位置的次數(shù)〔(3.2±0.3)次〕也明顯減少〔陰性對照組為(5.6±0.3)次，LNA-Scramble組為(6.3±0.4)次〕。在電跳臺觀察試驗(yàn)中，LNA-miR195的小鼠在72 h時(shí)從平臺上跳下的時(shí)間顯著降低。

2.3 氯胺酮處理對miR-195表達(dá)的影響 10、20、40 mg/kg氯胺酮處理后，miR-195含量(分別為1 324±0.223，1.688±0.235，1.889±0.262)明顯高于鹽水組(1.000±0.183，P<0.05)。

2.4 新生期氯胺酮重復(fù)處理對小鼠體重的影響 與對照組小鼠比較，新生期氯胺酮重復(fù)處理的小鼠體重增長明顯較慢，各氯胺酮重復(fù)處理組〔10、20、40 mg/kg組小鼠體重分別為(38.56±1.22)g、(34.45±1.12)g,(30.18±1.62)g〕與對照組大鼠體重〔(43.32±2.51)g〕差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

2.5 新生期氯胺酮重復(fù)處理在Morris水迷宮試驗(yàn)對大鼠記憶的影響 Morris水迷宮的空間探索實(shí)驗(yàn)期，雄性和雌性小鼠在2 min時(shí)間里與對照組大鼠比較發(fā)現(xiàn)，新生期氯胺酮重復(fù)處理組在目標(biāo)象限停留的時(shí)間沒有明顯的差異；新生期氯胺酮重復(fù)處理組的潛伏時(shí)間延長，40 mg/kg處理的雄性小鼠與生理鹽水差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，20 mg/kg和40 mg/kg處理組的雌性大鼠與生理鹽水差異顯著。見表2。

表1 miR195抑制后的潛伏期(s)

與LNA-Scramble比較：1)P<0.05

表2 新生期氯胺酮重復(fù)處理對大鼠記憶的影響(s)

與0 mg/kg比較：1)P<0.05

3 討 論

精神分裂癥是一種能對心理造成嚴(yán)重影響的病理形式，常伴有感知、語言、行為等方面的障礙和精神活動的不協(xié)調(diào)，經(jīng)常發(fā)生在青春期的后期和成年的早期，男性的平均發(fā)病年齡要早于女性5年左右，病程多出現(xiàn)遷延，隨著時(shí)間推移可發(fā)展為精神活動衰退?；颊邉趧幽芰︼@著喪失，給社會醫(yī)療衛(wèi)生資源和家庭造成長期沉重的負(fù)擔(dān)〔7～9〕。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及RNA干擾技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的有效應(yīng)用，miRNA作為一種與精神分裂癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的小RNA已引起了廣泛關(guān)注〔10〕。miRNA主要是通過與特定的mRNA序列完整的或是不完整的堿基配對，在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。miRNA本身具有高度的保守性、組織特異性及表達(dá)時(shí)序性，它具有2個(gè)明顯的特征：(1)不具有開放閱讀框(ORF)，因此本身不編碼蛋白質(zhì)；(2)其結(jié)構(gòu)5'端為磷酸基團(tuán)3'端為羥基，這使它能夠明顯與大多數(shù)寡核苷酸區(qū)分開來。一些特定miRNA能夠通過對表達(dá)水平的變化對生物造成影響，這一作用的機(jī)制主要是由于不同的蛋白質(zhì)所發(fā)揮的功能不同，所以當(dāng)miRNA表達(dá)水平發(fā)生變化時(shí)會引發(fā)不同的生物學(xué)效應(yīng)。在miRNA調(diào)控生物變化的過程中，它可能存在多種生物學(xué)信號通路，但每一個(gè)miRNA具體通路的作用機(jī)制仍需深入研究。

miRNA-195是microRNA-15/16/195/424/497家族中重要的成員，目前已證實(shí)人類miRNA-195編碼基因存在于17號染色體的基因間隔區(qū)p13.1〔11〕。目前，對miRNA-195的作用已有許多的研究，許踐剛等〔12〕通過莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測48例術(shù)前、術(shù)后2 w乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者及35例健康對照組血漿中miRNA-195的表達(dá)，分析其表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果證實(shí)了miRNA-195的異常表達(dá)可作為乳腺癌診斷的新的腫瘤標(biāo)志物。Lin等〔6〕通過已發(fā)表文章篩選與精神分裂癥有關(guān)的9種miRNA(miR-30e、miR-34a、miR-195、miR-181b、miR-346、miR-132、miR-212、miR-7和miR-432)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量分析，證實(shí)這9種miRNA都可以作為精神分裂癥的生物標(biāo)記物，但目前關(guān)于miR-195與精神分裂癥發(fā)病機(jī)制的研究還比較少。本研究結(jié)果提示miR-195對精神分裂癥具有重要作用。

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〔2016-08-02修回〕

(編輯 滕欣航)

湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ1010)

呂 路(1978-)，男，主治醫(yī)師， 主要從事精神疾病研究。

王 昉(1980-)，女，主治醫(yī)師， 主要從事精神疾病研究。

R749.3

A

1005-9202(2017)14-3411-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.013

1 武漢市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)務(wù)處 2 武漢市中醫(yī)醫(yī)院院辦

3 武漢市精神衛(wèi)生中心綜合科