棘球蚴病防控技術研究與應用

1病原學

棘球?qū)伲‥chinococcus）在分類學上屬于動物界，扁形動物門，絳蟲綱，圓葉目，帶科，就全球范圍來說，目前已經(jīng)確認的種類有細粒棘球絳蟲（E. granulosus）、多房棘球絳蟲（E. multilocularis）、石渠棘球絳蟲（E. shiquicus）、少節(jié)棘球絳蟲（E. oligarthra）、伏氏棘球絳蟲（E. vogeli）和其他從細粒棘球絳蟲種里面新分出來的種。

細粒棘球絳蟲種內(nèi)變異現(xiàn)象突出，最初根據(jù)線粒體cox1和nad1基因核苷酸序列的差異可將細粒棘球絳蟲分為10個基因型（G1～G10）以及獅株。在分子生物學方法廣泛使用之前，人們把細粒棘球絳蟲種內(nèi)的變異體稱為蟲株（strain）。雖然蟲株的概念在分類學屬非正式術語，但是它在實際工作中經(jīng)常被人們所采用。不同蟲株其形態(tài)學特征、宿主特異性、流行范圍、致病性等不盡相同。不同蟲株和基因型之間非常吻合，并且把G1～G10，再加上獅株統(tǒng)稱為細粒棘球絳蟲廣義種（E. granulosus sensu lato）。G1和G6的nad1基因核苷酸序列比較表明，差異性超過10%，差異明顯。根據(jù)線粒體基因組序列構(gòu)建的棘球?qū)俳{蟲分子種系系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）來看，公認的種至少有9個，其中還有可能從加拿大棘球絳蟲（E. canadensis包括G6～G10）中再劃分出1～2新種，這是目前為止棘球?qū)俳{蟲最為完整的分類學情況。因此，有必要對棘球?qū)俳{蟲現(xiàn)有的分類地位進行修正或修訂，即建議將細粒棘球絳蟲G1～G3（分別為普通綿羊株、塔斯馬尼亞綿羊株和水牛株）稱為細粒棘球絳蟲狹義種（E. granulosus sensu stricto），G4（馬株）新設為馬棘球絳蟲（E. equinus），G5（牛株）新設為奧氏棘球絳蟲（E. ortleppi），G6～G10（分別為駱駝株、豬株、鹿株、波蘭株和芬諾斯堪迪亞鹿株）新設為加拿大棘球絳蟲，獅株新設為貓或獅棘球絳蟲（E. felidis）[1-3]。

2診斷技術

2.1中間宿主———棘球蚴感染的診斷

主要是針對中間宿主———棘球絳蟲幼蟲的診斷。目前對患棘球蚴病的中間宿主的生前診斷尚無行之有效的方法，現(xiàn)普遍采用國際公認的剖檢法，對家畜宰后進行棘球蚴感染的調(diào)查，該法取得的調(diào)查結(jié)果為“金標準”，但對可疑病灶或包囊、一種宿主可感染多種棘球蚴等情況下有時無法做出準確鑒定。生前診斷方法包括影像學（如X線透視/B超）和免疫學方法（如皮試、ELISA和IHA等血清學方法），其中影像學技術在篩選實驗動物或針對特別珍貴的動物時才使用。剖檢法包括宰后肉眼觀察、實驗室診斷（如鏡檢和PCR、RFLP-PCR、RPA等分子生物學方法）。

針對中間宿主棘球蚴感染的診斷，筆者所在的研究小組已分離篩選到棘球蚴囊液中極具應用價值的抗原成分，并制備了相應包蟲病檢測試劑盒。檢測表明，試劑盒對200份經(jīng)剖檢和分子生物學確認的包蟲病羊血清檢測時，陽性檢出率為83%；檢測840份陰性羊血清時，陰性檢出率為97.2%。期望該試劑盒能用于羊棘球蚴感染的生前診斷和流行病學調(diào)查。

2.2終末宿主———棘球絳蟲感染的診斷

主要是針對終末宿主（犬科動物）———棘球絳蟲成蟲的診斷。生前診斷方法包括從小腸或糞便中查出成蟲、蟲卵與節(jié)片的顯微鏡檢測法和檳榔堿瀉下法（抽樣調(diào)查），以及糞DNA檢測法（LAMP、RPA、PCR等）、糞抗原ELISA法。剖檢法用于抽樣調(diào)查和作為評價其他方法的“金標準”。對于終末宿主即犬科動物的檢測，現(xiàn)在國際上仍普遍采用氫溴酸檳榔堿瀉法和剖檢法。糞抗原ELISA方法有其優(yōu)點與不足，優(yōu)點是檢測簡便，可以進行批量檢測；不足之處是敏感性低，目前市面上的試劑盒只針對細粒棘球絳蟲（狹義種）的感染，而不能對多房棘球絳蟲感染進行檢測或診斷，另外，對樣品新鮮度要求較高。

中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《動物棘球蚴病診斷技術（修訂）》，增加了一些較為成熟的分子生物學方法與技術，例如PCR、PCR-RFLP、基因型分析等，為棘球絳蟲蟲種與蟲株（基因型）、可疑包囊的準確鑒定、檢測或診斷等提供了新的工具。增加了終末宿主棘球絳蟲感染剖檢方法、糞便檢查方法、糞抗原檢測和糞DNA檢測等方法，為傳染源———犬等終末宿主流行病學調(diào)查與控制效果評價等提供了重要手段。

3流行病學調(diào)查

筆者開展了CE（囊型、單房型）流行病學調(diào)查和AE（泡型、多房型）流行病學調(diào)查。

3.1棘球蚴的宿主分布

細粒棘球絳蟲的終末宿主是犬、狼和豺等食肉動物；中間宿主是羊、牛、駱駝、豬和鹿等偶蹄類動物，偶可感染馬、袋鼠、某些嚙齒類、靈長類和人。多房棘球蚴常見的終末宿主是狐，其次是狗、狼、獾和貓等。多房棘球蚴主要寄生在野生嚙齒類動物如田鼠、麝鼠、旅鼠、倉鼠、大沙鼠、小家鼠以及褐家鼠體內(nèi)。石渠棘球絳蟲的終末宿主是藏狐，中間宿主主要為高原鼠兔，到目前為止，還未在藏狐和高原鼠兔以外的動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有石渠棘球絳蟲（蚴）的寄生。

3.2廣義細粒棘球絳蟲在中國流行情況

G1分布廣泛，家畜和人均可以感染；少量G3、G6、G7、G10人體病例分布在四川、新疆、黑龍江等地。少量G3、G6、G10病例也存在于青藏高原的牦牛和綿羊中。

3.3野生動物棘球蚴感染調(diào)查結(jié)果

野生動物多房棘球蚴感染調(diào)查結(jié)果顯示，中間宿主為田鼠，久治縣的感染率為43.6%（41/94），達日縣的感染率為3.3%（5/151）。野生動物石渠棘球蚴感染調(diào)查結(jié)果顯示，中間宿主為鼠兔，久治縣的感染率為7.5%（3/40），達日縣的感染率為14.3%（20/140）。某些區(qū)域野生動物棘球蚴感染率超過10%，說明棘球蚴的流行嚴重，與這些區(qū)域人棘球蚴病感染率高相吻合，因此，野生動物棘球蚴感染率可以作為人棘球蚴病感染狀況的一個生物指標，或者說野生動物可作為棘球蚴病流行病學調(diào)查的“哨兵”動物而使用。endprint

3.4疫區(qū)犬糞樣品檢測結(jié)果

對疫區(qū)犬糞樣品用LAMP進行棘球絳蟲感染檢測，結(jié)果顯示：①從細粒棘球絳蟲感染檢測結(jié)果來看，達日縣的感染率為12.7%，久治縣的感染率為20.0%；②從多房棘球絳蟲感染檢測結(jié)果來看，達日縣的感染率為12.7%，久治縣的感染率為33.3%。

4防控技術

4.1切斷傳播途徑

切斷病原在犬—家畜之間的傳播鏈，對動物進行驅(qū)蟲和使用疫苗免疫，禁止荷有包蟲的動物臟器隨意拋棄和喂犬，在屠宰場實行嚴格檢疫制度，對廢棄臟器進行無害化處理。

4.2疫苗技術與應用

預防犬的棘球絳蟲感染疫苗研究尚處于初期階段，需要進一步加大研發(fā)力度。預防羊和牛棘球蚴病的疫苗已取得突破性成就，并進入推廣應用階段。

4.3中國國家包蟲病免疫計劃

我國對包蟲病免疫計劃的進程經(jīng)歷了以下幾個階段：①農(nóng)業(yè)部文件（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2014]10號），常見動物疫病免疫推薦方案（試行）首次將包蟲病列為免疫病種之一；②農(nóng)業(yè)部文件（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2016]10號），國家動物疫病強制免疫計劃：在包蟲病重疫區(qū)，由省級畜牧獸醫(yī)主管部門會同有關部門根據(jù)監(jiān)測情況自主選擇免疫的策略；③農(nóng)業(yè)部文件（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017] 8號），國家動物疫病強制免疫計劃，在包蟲病流行區(qū)對新補欄羊進行包蟲病免疫，群體免疫密度常年保持在90%以上，應免疫動物免疫一度達到100%。

5基因工程技術生產(chǎn)EG95重組抗原疫苗

基因工程技術生產(chǎn)EG95疫苗抗原的技術路線主要有兩種表達系統(tǒng)：①大腸桿菌表達系統(tǒng)；②畢赤酵母表達系統(tǒng)。兩種表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組抗原方面的比較如下：①現(xiàn)有的基因工程疫苗，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)EG95保護性抗原，產(chǎn)物為融合蛋白，呈包涵體形式表達，重組抗原不溶，需要復性，抗原難以維持天然蛋白構(gòu)像，無糖基化修飾作用，免疫效果較好，但目的蛋白不易純化，制苗工藝復雜；②正在研制的新型基因工程疫苗，利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)EG95保護性抗原，產(chǎn)物呈分泌性表達，重組抗原可溶，抗原能維持天然蛋白構(gòu)象，有糖基化修飾作用，預期免疫效果更好，培養(yǎng)上清中蛋白表達量可達2g/L，目的蛋白純度在90%以上，無需純化，制苗工藝簡單[3]。

已有大量文獻報道，基因工程亞單位重組疫苗（EG95）在綿羊和牛進行二免后可使免疫動物產(chǎn)生堅強的抵抗棘球蚴感染的保護力（80%以上），基因工程亞單位重組疫苗（EG95）已在中國、阿根廷等國家推廣使用。Gauci等[4]報道，小鼠試驗證明，抵抗多房棘球蚴原發(fā)感染的免疫保護力為78.5%和82.9%。李建秋[5]對小鼠進行His-EM95+常規(guī)免疫，結(jié)果表明抵抗多房棘球蚴繼發(fā)感染的免疫保護力為60.52%～67.38%。

6人用疫苗研發(fā)

包蟲病流行區(qū)約6，000萬人口受到被感染的危險，數(shù)百萬人至近千萬人為高危人群，因此應該考慮在高危人群使用疫苗進行預防。疫苗需要符合人用質(zhì)量標準，通過篩選適宜佐劑、優(yōu)化EG95蛋白純化工藝和糖基化表達條件即可實現(xiàn)。研究EG95+EM95雙價疫苗最為理想。

7小結(jié)

科技部和衛(wèi)計委于2017年6月6日聯(lián)合下發(fā)了“十三五”重點研發(fā)項目申報指南，其中把包蟲病人用疫苗的開發(fā)已列入研發(fā)內(nèi)容，這無疑對推動棘球蚴病疫苗的深入研發(fā)注入了新活力。筆者所在研究小組的工作有幸得到了多個項目資金的大力支持，同時，特別感謝青海、寧夏、甘肅、新疆等省區(qū)動物疫控部門、疾病控制部門、高校等同行對筆者工作的大力支持和幫助。筆者組織國內(nèi)包蟲病知名專家，共同協(xié)作，在2015年出版了《棘球蚴病》專著，把這些年來國內(nèi)外在包蟲病研究和防控工作中所取得的研究成果和經(jīng)驗進行了系統(tǒng)歸納和總結(jié)，期望給包蟲病防控工作提供重要參考資料和強有力支撐。

參考文獻

[1]李立，婁忠子，閆鴻斌，等.棘球?qū)俳{蟲分子種系發(fā)生研究進展[J].中國人獸共患病學報， 2014， 30（1）： 1155-1162.

[2]Thompson RC. Biology and Systematics of Echinococcus [J]. Adv Parasitol， 2017， 95： 65-109.

[3]Lymbery AJ. Phylogenetic Pattern， Evolutionary Processes and Species Delimitation in the Genus Echinococcus [J]. Adv Parasitol， 2017， 95： 111-145.

[4]賈萬忠，婁忠子，李宏民，等.細粒棘球蚴EG95蛋白的修飾及在酵母中的表達[P].中國專利， 102731641B， 2014-12-24.

[5]Gauci C， Merli M， Muller V， et al. Molecular cloning of a vaccine antigen against infection with the larval stage of Echinococcus multilocularis[J]. Infection and Immunity， 2002， 70（7）： 3969-3972.

[6]李建秋.多房棘球蚴Em95基因克隆、原核表達及應用[D].中國農(nóng)業(yè)科學院， 2015.endprint