RNAi沉默Arl4c對結(jié)腸癌細胞株HCT116增殖能力的影響

訾永宏,李小寶,陳紅梅

(1延安大學附屬醫(yī)院普外科,延安 716000;2延安職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學系;*通訊作者,E-mail:ziyonghong2016@163.com)

RNAi沉默Arl4c對結(jié)腸癌細胞株HCT116增殖能力的影響

訾永宏1*,李小寶1,陳紅梅2

(1延安大學附屬醫(yī)院普外科,延安 716000;2延安職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學系;*通訊作者,E-mail:ziyonghong2016@163.com)

目的 探討利用RNA干擾技術(shù)沉默Arl4c基因?qū)Y(jié)腸癌HCT116細胞株增殖的影響。 方法 將Arl4c基因的si-RNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HCT116細胞,采用RT-PCR、Western blot鑒定干擾效果,以HCT116細胞沉默Arl4c基因組為實驗組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為對照組,分別采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法、細胞倍增時間、平板克隆形成實驗、流式細胞術(shù)檢測沉默Arl4c基因后,HCT116細胞生長速度、細胞周期、克隆形成能力的改變。 結(jié)果 沉默Arl4c基因后,實驗組細胞的生長速度明顯下降,G1期細胞增多、S期細胞減少,空白對照、空質(zhì)粒對照組和實驗組細胞平均倍增時間分別為(4.718±0.212)h,(4.981±0.24)h和(6.0±0.137)h;空白對照、空質(zhì)粒對照組和實驗組平均細胞克隆形成數(shù)目分別為121±9.00，117±10.00和80±9.00。實驗組與空白對照、空質(zhì)粒對照組相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論 Arl4c基因的沉默能夠抑制結(jié)腸癌細胞HCT116的增殖,可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

RNA干擾; 基因沉默; Arl4c; 結(jié)腸癌; HCT116

結(jié)腸癌是胃腸道常見的腫瘤,嚴重危害著人類生命健康,隨著診斷技術(shù)及治療的進步,5年生存率僅為50%。結(jié)腸癌的發(fā)生是多基因多階段的過程,現(xiàn)代靶向技術(shù)的不斷進步,使得對結(jié)腸癌相關(guān)基因的探討變得更有意義[1]。ADP-核糖基化樣因子4C(ADP-ribosylation factor-like 4C,Arl4c)是Arl家族的成員,是ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor,Arf)的亞家族成員之一[2],在細胞內(nèi)的囊泡運輸和信號轉(zhuǎn)導過程中具有重要作用。越來越多的研究表明,Arl4c與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3,4]。本實驗前期也發(fā)現(xiàn)Arl4c在結(jié)腸癌中過表達[1],但其對結(jié)腸癌發(fā)生過程中的具體作用目前還不十分清楚。因此,本實驗擬進一步探討Arl4c對結(jié)腸癌細胞株HCT-116生物學表型的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑與儀器

HCT116細胞購自中南大學細胞中心,由本課題組保存。0.25% Trypsino為長沙研科生物科技有限公司產(chǎn)品(中國),RPMI1640培養(yǎng)基為Gibico公司產(chǎn)品(美國),新生小牛血清為Biology Industries公司產(chǎn)品(以色列),pGCsi/U6/GFP載體購自上海吉凱基因有限公司,四甲基偶氮唑藍(MTT)為鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,細胞培養(yǎng)板為Corning公司產(chǎn)品(美國),轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent為上海英維捷基貿(mào)易有限公司產(chǎn)品,Anti-Arl4c McAb、HRP-Rabbit anti Mouse IgG為上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司產(chǎn)品(中國)。細胞培養(yǎng)箱為Thermor公司產(chǎn)品(美國),倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品(日本),酶標儀為Bio-TK公司產(chǎn)品(美國)。

1.2 pGC/U6/GFP/si-Arl4c重組載體構(gòu)建

從基因Bank中提取Arl4c基因(序列號:NM_001282431),設(shè)計、合成Arl4c的干擾序列:5′-GGAGGTTCTTCTACTCGCC-3′,并定向克隆入pGCsi/U6/GFP載體,以空載體pGCsi/U6/GFP(Mock)為對照。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

將待轉(zhuǎn)染的HCT116細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)其密度至80%左右,轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000說明書進行:具體操作如下:將2 μl脂質(zhì)體2000加入48 μl無血清RPMI1640培養(yǎng)基中輕輕混勻,37 ℃靜置5 min;在49 μl RPMI1640無血清培養(yǎng)基中分別加入1 μg重組質(zhì)粒pGC/U6/GFP/si-Arl4c和1 μg對照質(zhì)粒pGC/U6/GFP(Mock),輕輕混勻,室溫靜置5 min;將上述兩種混合液,輕輕混勻,37 ℃溫箱中孵育20 min;D-Hanks液將待轉(zhuǎn)染細胞洗滌1次,加入450 μl無抗生素的無血清RPMI1640培養(yǎng)基,再加入含有重組質(zhì)粒的混合溶液,輕輕混勻,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h;棄上清,并換新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h,棄上清并傳代,加入含400 μg/ml G418的培養(yǎng)基篩選陽性克隆。

1.4 RT-PCR鑒定干擾效果

總RNA抽提及RT-PCR按產(chǎn)品說明書進行。逆轉(zhuǎn)錄按FERMENTAS公司的試劑盒說明書操作。逆轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃ 60 min,70 ℃ 10 min,反應終止后冰上冷卻,-20 ℃保存。PCR條件:95 ℃ 1 min預變性;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。其中人Arl4c的正向引物為:5′-CATCTACGTGGTGGACTCGG-3′,反向引物為:5′-TGAGGGACTTCCTGCGTTTC-3′,產(chǎn)物大小293 bp。其中人GAPDH的正向引物為:5′-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3′,反向引物為:5′-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3′,產(chǎn)物大小231 bp。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 Western blot鑒定干擾效果

根據(jù)細胞蛋白提取說明抽提細胞蛋白質(zhì)。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,分別制備濃度為10%的分離膠和濃度為5%濃縮膠;各取50 μg蛋白樣品,按比例加入適量5%的巰基乙醇,100 ℃煮沸變性5 min。電泳:初始電壓60 V,約30 min,將電壓調(diào)至100 V,約2 h;轉(zhuǎn)膜:100 V轉(zhuǎn)膜約1 h。轉(zhuǎn)膜完成后,NC膜用含5%的脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。封閉后的NC膜經(jīng)PBST洗板3次×5 min,加入含1 ∶400的Anti-Arl4c McAb,搖床上室溫反應2 h,將膜取出PBST洗3次×5 min,加1 ∶3 000稀釋的兔抗小鼠HRP-Rabbit anti Mouse IgG,搖床上室溫下避光反應60 min;PBST洗板3次×5 min,暗室曝光、顯影、定影,掃描。

1.6 MTT法測定細胞生長曲線

以Arl4c基因沉默組的HCT116細胞為實驗組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為對照組,每組細胞均按5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h;每孔再加入MTT至終濃度為5 g/L,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄上清,加入DMSO 200 μl;待藍紫色結(jié)晶顆粒充分溶解后,測OD490值。然后以O(shè)D值為縱軸,時間為橫軸繪制細胞生長曲線,比較實驗組與對照組細胞的生長速度。

1.7 細胞倍增時間測定

以Arl4c基因沉默組的HCT116細胞為實驗組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為對照組,每組細胞均按103/孔接種于24孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h;用胰酶消化并進行細胞計數(shù)。每組設(shè)4個復孔,實驗重復3次。計算每組細胞的平均倍增時間。倍增時間公式如下:TD=t[lg2/(lgNt-lgN0)],其中,TD為細胞倍增時間;t為培養(yǎng)時間;N0,Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時的細胞數(shù)。

1.8 平板克隆形成能力測定

以Arl4c基因沉默組的HCT116細胞為實驗組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為對照組。取對數(shù)生長期細胞接種6孔板,每孔加入1 000個細胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2周;棄上清,PBS洗板2次,甲醇固定15 min;Giemsa染色15 min,水洗,空氣干燥;顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù),細胞數(shù)大于50個的計數(shù)為1個克隆數(shù)。每個濃度組細胞均設(shè)3個平行樣,每個實驗重復3次,計算平均克隆形成數(shù)。

1.9 細胞周期的測定

以Arl4c基因沉默組的HCT116細胞為實驗組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為對照組,每組細胞均按5×l03接種于細胞培養(yǎng)瓶,貼壁后用無血清培養(yǎng)基洗滌2次,再用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h;胰酶消化,離心收集細胞,PBS洗2次,PI染色30 min,流式細胞儀分析,并按以下公式計算其增殖指數(shù)(proliferative index,PI)。公式為PI=(G2M+S)/(G0/1+S+G2M)×l00%。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HCT116/si-Arl4c、HCT116/si-M細胞系的構(gòu)建

結(jié)果顯示,Arl4c mRNA在HCT116/pGC/U6/GFP/si-Arl4c細胞中表達明顯降低,而在HCT116和HCT116/pGC/U6/GFP細胞的Arl4c mRNA水平變化不明顯,分別將HCT116/pGC/U6/GFP/si-Arl4c和HCT116/pGC/U6/GFP細胞系命名為HCT116/si-Arl4c和HCT116/si-M(見圖1A)。進一步采用Western blot方法分別檢測HCT116,HCT116/si-Arl4c和HCT116/si-M細胞中Arl4c蛋白的表達水平,結(jié)果顯示,Arl4c蛋白在HCT116/si-Arl4c細胞中表達明顯降低(見圖1B),結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果相一致。成功建立沉默Arl4c的細胞系,用于后續(xù)實驗。

2.2 細胞生長曲線

以Arl4c基因沉默組的HCT116細胞(HCT116/si-Arl4c)為實驗組,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HCT116細胞(HCT116/si-M)和空白的HCT116細胞為對照組,用MTT實驗檢測其生長速度。結(jié)果表明,與對照組細胞HCT116、HCT116/si-M相比,實驗組細胞HCT116/si-Arl4c的生長速度明顯下降(見圖2)。

2.3 細胞倍增時間

HCT116、HCT116/si-M和HCT116/si-Arl4c細胞平均倍增時間為分別為(4.718±0.212)h、(4.981±0.24)h和(6.0±0.137)h,與對照組HCT116、HCT116/si-M細胞相比,沉默Arl4c基因后,實驗組細胞平均倍增時間明顯延長,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3)。

1.HCT116細胞;2.HCT116/si-M細胞;3.HCT116/si-Arl4c細胞圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGC/U6/GFP/si-Arl4c和pGC/U6/GFP的實驗結(jié)果Figure 1 Identification of cells with stable transfection of pGC/U6/GFP/si-Arl4c and pGC/U6/GFP by RT-PCR and Western blot

圖2 MTT法檢測Arl4c沉默組細胞和對照組細胞的生長曲線Figure 2 Cell proliferation curve of HCT116 with or without Arl4c silencing by MTT assay

與HCT116和HCT116/si-M比較,*P<0.05圖3 沉默Arl4c基因后HCT116細胞的平均倍增時間Figure 3 The cells double times of HCT116 with or without Arl4c knockdown

2.4 克隆形成能力

結(jié)果顯示:HCT116、HCT116/si-M、HCT116/si-Arl4c細胞克隆形成數(shù)目分別為121±9.00，117±10.00、80±9.00,沉默Arl4c基因后,明顯減弱了HCT116細胞的克隆形成能力,與對照組HCT116、HCT116/si-M比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。

圖4 平板克隆形成實驗結(jié)果Figure 4 Results of colony formation

2.5 細胞周期的分布

流式細胞儀檢測細胞周期的分布結(jié)果顯示,實驗組HCT116/si-Arl4c細胞與對照組HCT116、HCT116/si-M相比,實驗組細胞HCT116/si-Arl4c G1期細胞增多,S期細胞減少(見圖5,6),其結(jié)果與細胞生長曲線、平板克隆形成實驗結(jié)果趨勢相一致。

圖5 Arl4c基因沉默后HCT116細胞周期檢測Figure 5 Changes of cells cycle of HCT116 after Arl4c gene silencing

圖6 Arl4c沉默后HCT116細胞的周期分布Figure 6 Distribution of cell cycle of HCT116 cells after Arl4c gene silencing

3 討論

Arl4c也稱為Arl7,是含有192個氨基酸的屬于小GTP酶的蛋白[5]。Arl4c是Arf和Arl家族成員中特殊的成員,其特殊性在于其是唯一mRNA表達由肝臟X受體-類視黃醇X受體激動劑或人巨噬細胞中的膽固醇負載誘導,Arl4c可能在AI(apoA-I)依賴性膽固醇分泌過程中起作用并且可以通過與微管的相互作用調(diào)節(jié)細胞內(nèi)水泡運輸[6]。Arl4c蛋白在其C-末端含有核定位信號,在細胞膜、細胞質(zhì)中都可以存在,其功能和定位取決于它們受控的GTP的結(jié)合和水解[7]。研究顯示Arl4c可能在膽固醇代謝紊亂中起著重要的作用[8]。

前期研究發(fā)現(xiàn)Arl4c在結(jié)腸癌組織中高表達,在結(jié)腸癌細胞株HCT116中高表達,且Arl4c的表達在結(jié)腸癌不同性別、不同年齡、不同臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中差異無統(tǒng)計學意義,而在不同病理分化的患者中差異有統(tǒng)計學意義[4],這提示Arl4c可能在結(jié)腸癌的發(fā)生及早期發(fā)展中起到重要作用。因此,本研究利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)特異性地抑制結(jié)腸癌細胞HTC116中Arl4c基因的表達,通過MTT、細胞倍增時間、平板克隆形成實驗、流式細胞術(shù)實驗研究Arl4c對結(jié)腸癌細胞HTC116增殖的影響,結(jié)果Arl4c表達的降低能明顯地抑制結(jié)腸癌細胞HTC116的增殖,減弱結(jié)腸癌細胞HTC116的克隆形成能力,這說明Arl4c在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。Fujii等[3]研究顯示Arl4c在肺癌中高表達,而在正常肺組織中未見表達,認為Arl4c參與肺癌的發(fā)生,并且可能用于抑制肺癌細胞增殖和侵襲的新的靶向治療,同時認為Arl4c表達的增加是由于APC、β-連環(huán)蛋白及Ras的遺傳改變,使得Wnt和EGF信號通路被活化,促進腫瘤的發(fā)生。由于Wnt/β-catenin和EGF/Ras信號通路的改變引起Arl4c表達異常導致腫瘤的發(fā)生。Arl4c在肺腫瘤和舌腫瘤樣本中高表達,而在相對應的非腫瘤樣本中不表達,且腫瘤樣本中Arl4c基因3′端非翻譯區(qū)DNA甲基化現(xiàn)象明顯減弱。10-11易位甲基胞嘧啶雙加氧酶(TET)可介導DNA去甲基化,在肺癌細胞NCI-H520中高表達,敲除NCI-H520細胞中TET基因可減少5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)的表達水平,并且促進3′端非翻譯區(qū)DNA甲基化,降低Arl4c的表達,同時減弱了Arl4c介導的細胞遷移能力[9]。這說明Arl4c與腫瘤細胞的功能密切相關(guān)。Arend等[10]研究認為Ar14c是通過Wnt/β-連環(huán)蛋白通路參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,這一轉(zhuǎn)化途徑是腫瘤發(fā)生的起始事件。

總之,干擾Arl4c基因表達可引起結(jié)腸癌細胞周期阻滯,從而導致細胞增殖倍增能力的降低,提示Arl4c在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,這為以Arl4c為靶點的結(jié)腸癌的診斷及治療提供理論依據(jù)及靶向策略。

[1] 訾永宏,姬樂,陳紅梅,等.Arl4c在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義[J].山西醫(yī)科大學學報,2017,48(1):44-46.

[2] Gillingham AK, Munro S. The small G proteins of the Arffamily and their regulators[J]. Annu Rev Cell Dev Biol,2007,23:579-611.

[3] Fujii S, Matsumoto S, Nojima S,etal. Arl4c expression in colorectal and lung cancers promotes tumorigenesis and may represent a novel therapeutic target[J]. Oncogene,2015,34(37):4834-4844.

[4] Su D, Katsaros D, Xu S,etal. ADP-ribosylation factor-like 4C (ARL4C), a novel ovarian cancer metastasis suppressor, identified by integrated genomics[J]. Am J Transl Res,2015,7(2):242-256.

[5] Burd CG, Strochlic TI, Setty SR. Arf-like GTPases: not so Arf-like after all[J]. Trends Cell Biol,2004,14(12):687-694.

[6] Wei SM, Xie CG, Abe Y,etal. ADP-ribo-sylation factor like 7 (ARL7) interacts with alpha-tubulin and modulates intracellular vesicular transport[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,384(3):352-356.

[7] Hofmann I, Thompson A, Sanderson CM,etal. The Arl4 family of small G proteins can recruit the cytohesin Arf6 exchange factors to the plasma membrane[J]. Curr Biol,2007,17(8):711-716.

[8] Sun D, Zhang J, Xie J,etal. MiR-26 controls LXR-dependent cholesterol efflux by targeting ABCA1 and ARL7[J]. FEBS Lett,2012,586(10):1472-1479.

[9] Fujii S, Shinjo K, Matsumoto S,etal.Epigenetic upregulation of ARL4C, due to DNA hypomethylation in the 3'-untranslated region, promotes tumorigenesis of lung squamous cell carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(49):81571-81587.

[10] Arend RC, Londono-Joshi AI, Straughn JM Jr,etal. The Wnt/β-catenin pathway in ovarian cancer: a review[J].Gynecol Oncol,2013,131(3):772-779.

Effect of Arl4c gene silencing by RNA interference on cell proliferation of colon cancer cell line HCT116

ZI Yonghong1*,LI Xiaobao1,CHEN Hongmei2(1

DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity,Yan’an716000,China;2DepartmentofMedicine,Yan’anVocationalandTechnicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:ziyonghong2016@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of RNA interference-mediated gene silence of Arl4c on the proliferation of colon cancer cell line HCT116.MethodsColon cancer cell line HCT116 was transfected with Arl4c small interfering RNA(siRNA), and then the expression of Arl4c was determined by RT-PCR and Western blot. HCT116 cells after Arl4c gene knockdown were chosen as experimental group, and HCT116 cells transfected with empty plasmid transfection and HCT116 cells were chosen as control groups. Then the proli-feration of HCT116 was examined by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) assay, the cell doubling time of HCT116 was examined by double time assay, the colony formation ability of HCT116 was examined by colony formation assay, and the cell cycles of HCT116 were examined by flow cytometry assay.ResultsCompared with the blank control group and empty plasmid control group, the growth ability in experimental group was significantly decreased,G1phase cells increased, and S phase cells decreased. The doubling time in blank control group,empty plasmid group and experimental group was (4.718±0.212)h,(4.981±0.24)h,(6.0±0.137)h. The colony number was 121±9.00 in blank control group,117±10.00 in empty plasmid control group, and 80±9.00 in experimental group, and there was significant difference between control groups and experimental group(P<0.05).ConclusionArl4c gene silencing by RNAi can suppress the proliferation of colon cancer cell line HCT116, and it may be involved in colon cancer progression.

RNA interference; gene silencing; Arl4c; colon cancer; HCT116

訾永宏,男,1982-02生,學士,主治醫(yī)師.E-mail:ziyonghong2016@163.com

2017-03-29

R735.35

A

1007-6611(2017)07-0676-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.008