谷胱甘肽對奧尼羅非魚原代肝細(xì)胞增殖及生化功能的影響

陳 標(biāo)，焦彩紅，朱 選，潘 慶

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 海大集團，廣東 廣州 511400)

谷胱甘肽對奧尼羅非魚原代肝細(xì)胞增殖及生化功能的影響

陳 標(biāo)1，焦彩紅1，朱 選2，潘 慶1

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 海大集團，廣東 廣州 511400)

【目的】研究谷胱甘肽(Glutathione, GSH)對奧尼羅非魚Oreochromis niloticus×O. aureus原代肝細(xì)胞增殖和生化功能的影響，探究谷胱甘肽的促生長作用機制?！痉椒ā坑锰砑应諡?0% 胎牛血清和未添加血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)奧尼羅非魚原代肝細(xì)胞48 h，隨后在培養(yǎng)液中分別加GSH至0、30、100、300、900 mg·L–1，每個水平設(shè)6個重復(fù)，培養(yǎng)24、48和72 h后測定奧尼羅非魚原代肝細(xì)胞增殖情況及培養(yǎng)液中胰島素樣生長因子、白蛋白、過氧化氫含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶、γ–谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性?！窘Y(jié)果】谷胱甘肽顯著促進了奧尼羅非魚原代肝細(xì)胞增殖，提高了培養(yǎng)液上清中胰島素樣生長因子、白蛋白的含量和γ–谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性，降低了培養(yǎng)液上清中過氧化氫含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性(P＜0.05)。在無血清培養(yǎng)試驗組中添加谷胱甘肽，對奧尼羅非魚原代肝細(xì)胞增殖及生化指標(biāo)的影響比添加血清培養(yǎng)試驗組效果明顯。【結(jié)論】谷胱甘肽能促進奧尼羅非魚肝細(xì)胞增殖，且具有保護肝臟的作用。

谷胱甘肽；奧尼羅非魚；原代肝細(xì)胞；增殖；生化功能

Key words:glutathione; Oreochromis niloticus×O. aureus; primary hepatocyte; proliferation; biochemical function

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)主要是在肝臟以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸為底物合成[1]，廣泛分布于所有生物細(xì)胞中，其中，動物的肝臟、腎臟含量較為豐富[2]。GSH具有保護機體酶蛋白巰基不被氧化，促進自由基清除，減少自由基對細(xì)胞損傷，調(diào)節(jié)機體免疫機能等作用[3]。GSH作為藥物已廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)療[4]，作為功能性食品添加劑及營養(yǎng)強化劑用于食品生產(chǎn)[5]。

有研究表明，在草魚飼料中添加GSH能夠增強生長激素活性，促進草魚生長[6]。在凡納濱對蝦飼料中添加GSH能夠提高對蝦成活率和飼料轉(zhuǎn)化率[7]。在吉富羅非魚飼料中添加GSH能夠促進生長激素的分泌、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖[8]，提高生長性能和免疫相關(guān)酶活性[9]。在奧尼羅非魚Oreochromis niloticus×O. aureus飼料中添加GSH能促進幼魚生長，提高飼料利用率，促進IGF-I和T3分泌，提高機體抗氧化能力[10]。目前，鮮見在細(xì)胞水平上探討谷胱甘肽的作用及其機理，通過細(xì)胞水平的研究，將從不同層面和水平揭示 GSH 作用機理。因此，本試驗通過奧尼羅非魚肝臟原代細(xì)胞培養(yǎng)，研究GSH對細(xì)胞增殖的影響，初步揭示 GSH 的促生長作用機理，為 GSH 在水產(chǎn)動物飼料中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚和主要試劑

奧尼羅非魚購自廣州白云區(qū)魚苗廠，體質(zhì)量約為30 g，魚體消毒后在水族箱中暫養(yǎng)3周，備細(xì)胞培養(yǎng)用，暫養(yǎng)期間投喂不添加GSH的純化飼料，飼料配方的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：干酪素35%、馬鈴薯淀粉45%、玉米油5%、微晶纖維素5%、羧甲基纖維素鈉2%、礦物質(zhì)預(yù)混物5%、維生素預(yù)混物3%。谷胱甘肽購自AMRESCO公司(φ≥99%)。DMEM/F12培養(yǎng)液和II型膠原酶干粉購自GIBCO公司。

1.2 肝細(xì)胞原代培養(yǎng)

羅非魚用φ為0.01%的高錳酸鉀溶液消毒0.5 h取出毀髓，φ為70%的酒精消毒魚體后移入超凈工作臺。用已消毒好的手術(shù)剪剪開羅非魚一側(cè)腹腔，小心取出肝臟，用預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)液清洗3次，將肝組織剪成約1 mm3左右的組織塊，清洗3次后轉(zhuǎn)入含有 φ 為0.05%膠原酶的培養(yǎng)瓶中，26 ℃水浴中消化10 min，充分吹打，200目濾網(wǎng)過濾去除碎塊，1 500 r·min–1冷凍離心2 min，收集肝細(xì)胞，再以900 r·min–1冷凍離心2 min以去除混雜在肝細(xì)胞中的雜細(xì)胞。細(xì)胞以DMEM/F12培養(yǎng)液重懸后，計數(shù)細(xì)胞密度，使其達到5×105個·mL–1，隨后接種于多個24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning)，在 φ(CO2)為5%的26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 GSH處理

肝細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，吸出培養(yǎng)液并用Hank氏液清洗，分別加入含有φ為10%胎牛血清和不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，在2種培養(yǎng)液中加入GSH，使其終質(zhì)量濃度為30、100、300和900 mg·L–1，不加入GSH組為對照組，每個水平設(shè)6個重復(fù)。在培養(yǎng)24、48和72 h后，分別測定肝細(xì)胞的增殖情況，隨后以1 800 r·min–1離心5 min，取培養(yǎng)液上清，分裝于0.5 mL的離心管中，保存于–20 ℃冰箱中以備分析。

1.4 測定方法

肝細(xì)胞的增殖采用MTT法[11]測定，測得的光密度(D490nm)與活細(xì)胞的數(shù)目具有良好的相關(guān)性；IGF-1的測定采用放射免疫測定法，樣品的前處理采用酸醇提取法[12]，具體操作參照測定試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程公司)說明書進行。由于測定試劑盒為人醫(yī)研制，硬骨魚類的和人類的IGF-1氨基酸序列有近80%的相似性[13]，因此，經(jīng)逐級稀釋羅非魚血清樣品后測定IGF-1含量，得出血清濃度與樣品IGF-1含量的回歸方程為：y=0.122x–1.921 6, R2=0.958 9，確定該試劑盒可用于測定羅非魚樣品IGF-1的含量。上清液中白蛋白含量測定采用溴甲酚綠比色法，谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamate-oxaloacetate transaminase，GOT)活性測定采用賴氏法，γ–谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT)和過氧化氫含量均采用試劑盒測定(南京建成生物工程研究所)。谷草轉(zhuǎn)氨酶和γ–谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性用U表示，其代表1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需的酶量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和方差分析。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后有顯著差異再做Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚肝細(xì)胞的形態(tài)

無血清培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)24和48 h 后經(jīng)GSH處理的肝細(xì)胞生長情況比未經(jīng)GSH處理的細(xì)胞折光性好，但各處理組間肝細(xì)胞形態(tài)沒有明顯差別。在72 h后添加900 mg·L–1GSH的肝細(xì)胞生長狀況最好，未見細(xì)胞連成網(wǎng)狀及從培養(yǎng)板底部脫落的現(xiàn)象，而此時對照組有大量細(xì)胞從培養(yǎng)板底部脫落。添加血清培養(yǎng)條件下，肝細(xì)胞在各時間段生長情況良好，組間形態(tài)差別不明顯。

2.2 羅非魚肝細(xì)胞的增殖

如表1所示，無血清培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)24、48和72 h后，經(jīng)GSH處理的肝細(xì)胞增殖均顯著高于對照組(P＜0.05)；在72 h后，隨著GSH的加入量增加，D490nm顯著增加，且各處理組間均有顯著差異。添加血清培養(yǎng)條件下，在24 h后添加300、900 mg·L–1GSH組肝細(xì)胞增殖顯著高于其他各組，在48 h 后添加300 mg·L–1GSH組肝細(xì)胞增殖顯著高于其他各組，在72 h后添加300、900 mg·L–1GSH組肝細(xì)胞增殖顯著高于對照組。

2.3 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中H2O2含量

如表2所示，無血清培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)24、48和72 h后經(jīng)GSH處理的肝細(xì)胞培養(yǎng)液中H2O2含量顯著低于對照組。添加血清培養(yǎng)條件下，在24 h后添加100、300和900 mg·L–1GSH 組中 H2O2含量顯著低于對照組，在48和72 h 后，各處理組肝細(xì)胞培養(yǎng)液中H2O2含量無顯著差異(P＞0.05)。

表1 不同培養(yǎng)時間羅非魚肝細(xì)胞培養(yǎng)液的光密度(D490nm)1)Tab. 1 D490nmvalue of tilapia hepatocyte culture after culturing for different time

表2 不同培養(yǎng)時間肝細(xì)胞培養(yǎng)液中H2O2的含量1)Tab. 2 H2O2content in hepatocyte culture after culturing for different timemmol·mL–1

2.4 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-1含量

如表3所示，無血清培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)24 h后添加100和300 mg·L–1GSH 組中 IGF-1 含量顯著高于對照組，在48 h后添加300 mg·L–1GSH 組中 IGF-1 含量顯著高于各處理組，在72 h后添加900 mg·L–1GSH 組中 IGF-1 含量顯著高于對照組。添加血清培養(yǎng)條件下，在 24 h 后添加 100、300 和900 mg·L–1GSH 組中 IGF-1 含量顯著高于對照組，在 48 和 72 h 后添加 300、900 mg·L–1GSH 組中IGF-1 含量均顯著高于對照組。隨著培養(yǎng)時間延續(xù)，各處理組培養(yǎng)液中 IGF-1 含量呈現(xiàn)升高的趨勢。

2.5 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中白蛋白的含量

如表4所示，無血清培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng) 24 h后經(jīng) GSH 處理的各處理組間白蛋白含量無顯著差異，在 48 h 后 300 mg·L–1組中白蛋白含量顯著高于對照組，在 72 h 后添加 300 和 900 mg·L–1GSH 組中白蛋白含量顯著高于其他各組。添加血清培養(yǎng)條件下，在 24 和 72 h 后經(jīng) GSH 處理的各組間白蛋白含量無顯著差異，在 48 h 后添加 100 和 300 mg·L–1GSH 組中白蛋白含量顯著高于其他各組。添加血清培養(yǎng)肝細(xì)胞培養(yǎng)液中白蛋白的含量明顯高于無添加血清培養(yǎng)肝細(xì)胞培養(yǎng)液中白蛋白的含量。

表4 不同培養(yǎng)時間肝細(xì)胞培養(yǎng)液中白蛋白含量1)Tab. 4 Albumin content in hepatocyte culture after culturing for different timemg·mL–1

2.6 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中 γ-GT活性

如表5所示，無血清培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)24 和48 h后添加100、300和900 mg·L–1GSH組中 γ-GT活性顯著高于對照組和添加30 mg·L–1GSH組，在72 h后添加300和900 mg·L–1GSH組中 γ-GT活性顯著高于對照組。添加血清培養(yǎng)條件下，在48 h后添加300 mg·L–1GSH組中 γ-GT活性顯著高于對照組。

表3 不同培養(yǎng)時間肝細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-1含量1)Tab. 3 IGF-1 content in hepatocyte culture after culturing for different timeng·mL–1

表5 不同培養(yǎng)時間肝細(xì)胞培養(yǎng)液中 γ-GT的活性1)Tab. 5 γ-GT activity in hepatocyte culture after culturing for different timeU·mL–1

2.7 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中GOT活性

如表6所示，無血清和添加血清培養(yǎng)條件下，經(jīng)GSH處理的試驗組各階段GOT活性均隨GSH增加而下降。

表6 不同培養(yǎng)時間肝細(xì)胞培養(yǎng)液中GOT的活性1)Tab. 6 GOT activity in hepatocyte culture after culturing for different timeU·mL–1

3 討論與結(jié)論

3.1 GSH對體外培養(yǎng)羅非魚肝細(xì)胞增殖的影響

GSH具有促進有絲分裂和調(diào)控細(xì)胞增殖的作用[14]，并可以清除細(xì)胞內(nèi)過多的H2O2，調(diào)控自由基水平，間接影響DNA合成[15-17]。有研究表明，上皮纖維細(xì)胞(GM0868)培養(yǎng)液中加入GSH合成抑制劑能夠降低上皮纖維細(xì)胞增殖，而加入GSH的前體物(氧化四氫噻唑羧基鹽)能降低細(xì)胞自由基水平，促進上皮纖維細(xì)胞增殖[15]。本試驗中，為排除血清中所含GSH的干擾，設(shè)置添加血清和未添加血清試驗組，分析結(jié)果顯示GSH均能促進羅非魚肝細(xì)胞在體外增殖。GSH處理72 h后，無血清培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而此時添加900 mg·L–1GSH 組的細(xì)胞數(shù)目最多，H2O2含量在GSH處理組亦顯著低于對照組，說明GSH本身可以被吸收利用，促進細(xì)胞增殖，且可以降低H2O2含量[18]。因此，本試驗結(jié)果用羅非魚肝細(xì)胞印證了GSH的作用和作用機理。

3.2 GSH對體外培養(yǎng)羅非魚肝細(xì)胞生化功能的影響

肝臟具有合成和分泌IGF-1的功能[19]。本試驗中，在添加血清和未添加血清試驗組中GSH均能顯著促進IGF-1分泌，且IGF-1分泌與肝細(xì)胞增殖表現(xiàn)出一致性。其中，添加血清培養(yǎng)時細(xì)胞的增殖和IGF-1的分泌明顯高于無血清培養(yǎng)時，說明肝細(xì)胞在營養(yǎng)充足的情況下具有較高的IGF-1分泌能力[20]和增殖能力。

白蛋白由肝臟合成，作為脂肪酸運輸載體，是反應(yīng)肝功能的主要指標(biāo)之一。本試驗中未添加血清培養(yǎng)肝細(xì)胞時，肝細(xì)胞具有合成分泌白蛋白的能力，且隨著培養(yǎng)時間延長，較高劑量的GSH處理能促進白蛋白的分泌。在添加血清培養(yǎng)肝細(xì)胞時，分泌的白蛋白的量仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無血清培養(yǎng)時，說明在無血清培養(yǎng)時，肝細(xì)胞合成分泌白蛋白的功能有所下降。

GSH的 γ–谷氨酰基可作為氨基酸轉(zhuǎn)運的載體

，參與小腸吸收的氨基酸從微絨毛細(xì)胞膜外轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，此過程在 γ–谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)催化下完成[21]。本研究表明，無血清培養(yǎng)時，隨著GSH處理劑量增大，培養(yǎng)液中 γ-GT活性顯著升高，說明GSH 可增加肝細(xì)胞中 γ–谷氨?；?，提高細(xì)胞膜基質(zhì)上的 γ-GT的活性，促進氨基酸的吸收。添加血清培養(yǎng)時，γ-GT的活性隨著GSH處理劑量的增加有升高的趨勢，僅GSH處理48 h后300 mg·L–1組γ-GT 活性顯著升高，說明在營養(yǎng)充足時GSH提高γ-GT 活性的作用沒有營養(yǎng)相對不足時強。

3.3 GSH對體外培養(yǎng)羅非魚肝細(xì)胞的保護作用

轉(zhuǎn)氨酶主要存在于細(xì)胞內(nèi)，在氨基酸代謝及蛋白質(zhì)、脂肪、糖三者代謝轉(zhuǎn)化過程中占有重要地位，當(dāng)組織病變引起細(xì)胞膜的通透性增加，或細(xì)胞受到損傷時，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶才會大量釋放出來。研究表明GSH具有保護肝臟的作用，在肝臟受到損傷后，可加快肝組織的恢復(fù)[22]。本試驗中，無論是否有血清添加，羅非魚肝細(xì)胞培養(yǎng)液中GOT活性均隨GSH 處理劑量的增加而下降，表明GSH對肝細(xì)胞有一定的保護作用，能防止肝細(xì)胞膜通透性增加，從而減少GOT釋放到培養(yǎng)液中。

綜上所述，本文從細(xì)胞水平揭示，GSH能夠促進奧尼羅非魚原代肝細(xì)胞分泌IGF-1和白蛋白，提高 γ-GT活性，降低H2O2含量和GOT活性，促進肝細(xì)胞增殖與生長，進一步地驗證了GSH調(diào)控奧尼羅非魚生長代謝的理論數(shù)據(jù)，為GSH在奧尼羅非魚飼料的生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

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【責(zé)任編輯 莊 延】

Effects of glutathione on proliferation and biochemical function of primary hepatocyte in hybrid tilapia (Oreochromis niloticus×O. aureus)

CHEN Biao1, JIAO Caihong1, ZHU Xuan2, PAN Qing1
(1 College of Marine Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2 Haid Group, Guangzhou 511400, China)

【Objective】To investigate the effects of glutathione (GSH) on proliferation and biochemical function of primary hepatocyte in hybrid tilapia (Oreochromis niloticus×O. aureus).【Method】Tilapia primary hepatocytes were cultured in cell culture medium with 0 or 10% fetal calf serum for 48 h. GSH was then added into the two kinds of cell culture medium to the final concentration of 0, 30, 100, 300 or 900 mg·L–1respectively. Each concentration group had six replicates. The proliferation status of the primary hepatocyte, contents of insulin-like growth factor 1 (IGF-1), albumin and H2O2, as well as glutamate-oxaloacetate transaminase (GOT) and γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT) activities of tilapia were detected after cultured for 24, 48 and 72 h, respectively.【Result】GSH significantly increased the proliferation of primary hepatocyte，the contents of IGF-1 and albumin，and γ-GT activity in supernatant，while reduced H2O2content and GOT activity(P＜0.05). Such effects of GSH were more evident in the group without fetal calf serum compared to the group with 10% fetal calf serum.【Conclusion】GSH could enhance the proliferation of primary hepatocyte and has the function of protecting liver in hybrid tilapia.

S963.73

A

1001-411X(2017)05-0007-06

陳標(biāo), 焦彩紅, 朱選, 等. 谷胱甘肽對奧尼羅非魚原代肝細(xì)胞增殖及生化功能的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2017, 38(5): 7-12.

2016-12-06 優(yōu)先出版時間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0855.004.html

陳 標(biāo)(1987—)，男，博士研究生，E-mail: chenbiao11@mails.ucas.ac.cn； 通信作者： 潘 慶(1969—)，女，教授，博士，E-mail: qpan@scau.edu.cn

廣東省科技廳研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化項目(2013B090500028)；廣州市科技計劃項目(2014YZ-00208)