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    意大利蜜蜂6日齡幼蟲腸道內(nèi)球囊菌的差異表達(dá)基因分析

    2017-08-07 09:04:48熊翠玲史秀麗鄭燕珍付中民徐細(xì)建陳大福
    浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2017年7期
    關(guān)鍵詞:意蜂球囊幼蟲

    杜 宇,熊翠玲,史秀麗,鄭燕珍,付中民,徐細(xì)建,陳大福,郭 睿,*

    (1.福建農(nóng)林大學(xué) 蜂學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002; 2.新疆維吾爾自治區(qū)蜂業(yè)發(fā)展中心,新疆 烏魯木齊 830000)

    意大利蜜蜂6日齡幼蟲腸道內(nèi)球囊菌的差異表達(dá)基因分析

    杜 宇1,熊翠玲1,史秀麗2,鄭燕珍1,付中民1,徐細(xì)建1,陳大福1,郭 睿1,*

    (1.福建農(nóng)林大學(xué) 蜂學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002; 2.新疆維吾爾自治區(qū)蜂業(yè)發(fā)展中心,新疆 烏魯木齊 830000)

    為檢測蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)在脅迫意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica,簡稱意蜂)幼蟲后期的基因表達(dá)譜,利用RNA-seq技術(shù)對純培養(yǎng)的球囊菌孢子及球囊菌脅迫的意蜂6日齡幼蟲腸道進(jìn)行深度測序。通過比較處理組和對照組得到21 361個差異表達(dá)基因(DEGs),包括15 306個上調(diào)基因和6 055個下調(diào)基因。GO富集分析結(jié)果顯示,上調(diào)基因富集于39個GO條目(term),基因富集數(shù)最多的為細(xì)胞進(jìn)程(2 416 unigenes)、細(xì)胞(2 408 unigenes)和細(xì)胞組件(2 408 unigenes);下調(diào)基因富集于38個GO term,基因富集數(shù)最多的為代謝進(jìn)程(1 227 unigenes)、細(xì)胞進(jìn)程(1 185 unigenes)和細(xì)胞(1 131 unigenes)。KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示,上調(diào)基因富集在119個通路,其中基因富集數(shù)最多的是核糖體(221 unigenes),其次為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工(190 unigenes)和內(nèi)吞作用(177 unigenes);下調(diào)基因富集在113個通路上,基因富集數(shù)最多的是核糖體(144 unigenes),其次為RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(113 unigenes)和氨基酸生物合成(108 unigenes)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),富集在MAPK信號通路上的64個基因上調(diào)表達(dá),說明該通路在球囊菌脅迫后期被激活。研究結(jié)果不僅為揭示球囊菌在脅迫意蜂幼蟲后期的病原-宿主互作提供了重要信息,也為闡明球囊菌致病的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

    球囊菌;意大利蜜蜂;幼蟲腸道;差異表達(dá)基因;RNA-seq

    蜜蜂是世界范圍內(nèi)最重要的授粉昆蟲,其在經(jīng)濟(jì)創(chuàng)收和生態(tài)保護(hù)等方面均發(fā)揮著重要作用[1]。蜜蜂作為社會學(xué)模式昆蟲,在行為學(xué)、生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和流行病學(xué)等領(lǐng)域具有很高的研究價值[2]。蜜蜂易遭受細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲及農(nóng)藥的危害[3]。其中,白堊病是最具代表性的蜜蜂真菌病,是一種由蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)特異性侵染蜜蜂幼蟲而導(dǎo)致的致死性真菌病。該病最早于1913年由Maassen發(fā)現(xiàn)[4],至1992年該病已經(jīng)遍及我國全部的蜜蜂飼養(yǎng)區(qū)[5]。目前,球囊菌已被我國列入蜜蜂進(jìn)出口檢疫的對象[6]。

    近20年來,人們對球囊菌開展了大量研究,主要集中在培養(yǎng)方法[7-8]、形態(tài)學(xué)[9-10]、流行病學(xué)[11-12]、增殖方式[13-14]、病理學(xué)[15-16]、免疫防御[17-18]以及疾病防治[19-20]等方面。本課題組也在球囊菌的生化和病理等方面開展了較多研究[21-25],如梁勤等[22]從碳源、氮源、維生素、礦質(zhì)元素等方面研究了營養(yǎng)生態(tài)條件對球囊菌生長及產(chǎn)孢的影響,結(jié)果表明,營養(yǎng)生態(tài)條件的變化對球囊菌的影響極大;鄭志陽等[24]對健康及白堊病患病意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica,意蜂)幼蟲的血淋巴進(jìn)行SDS-PAGE電泳和酶學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)健康蜜蜂幼蟲血淋巴中的蛋白含量豐富,主要由4種高分子質(zhì)量的蛋白組成,而患病幼蟲血淋巴中的蛋白含量很少,主要蛋白組分被降解,多種蛋白酶和酯酶的活性在患病幼蟲血淋巴中可檢測到,但在健康幼蟲中檢測不到。隨著二代測序技術(shù)的興起及廣泛應(yīng)用,Qin等[26]完成了A.apis的基因組測序工作,為在分子水平研究球囊菌奠定了重要基礎(chǔ),但作者當(dāng)時并未公布基因的位置和功能注釋信息。2012年Cornman等[27]利用Roche 454焦磷酸測序技術(shù)比較培養(yǎng)基培養(yǎng)的純凈球囊菌菌絲和脅迫西方蜜蜂幼蟲腸道組織內(nèi)的球囊菌菌絲轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況,分析表明,球囊菌的病原差異表達(dá)基因(DEGs)參與了關(guān)鍵分子途徑如應(yīng)激反應(yīng)、交配類型、信號傳導(dǎo)等。由于球囊菌的基因位置及功能注釋信息、參考轉(zhuǎn)錄組信息的缺失,球囊菌的分子研究進(jìn)展極為緩慢。

    目前,球囊菌致病的分子機(jī)理尚不明確。本課題組前期已組裝并注釋了球囊菌參考轉(zhuǎn)錄組[28],可為在分子水平深入研究球囊菌提供重要的參考信息。本研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步對球囊菌脅迫意蜂6日齡幼蟲腸道內(nèi)的DEGs進(jìn)行深入分析,旨在提供球囊菌在脅迫意蜂幼蟲后期的基因表達(dá)譜信息,為闡明球囊菌致病的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試生物材料

    本研究所使用的意蜂幼蟲取自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場;球囊菌菌株由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院蜜蜂保護(hù)學(xué)實驗室保存與活化。

    1.2 球囊菌活化與孢子懸液制備

    將4 ℃保存的球囊菌培養(yǎng)皿置于已紫外滅菌的超凈臺,用酒精燈上灼燒片刻的鑷子夾取少量菌絲在平板中央2 cm左右圓心區(qū)域內(nèi)劃線操作,培養(yǎng)皿封口后置于37 ℃生化箱恒溫培養(yǎng)。接種8~10 d天后,待培養(yǎng)皿上黑色孢子較多時,刮取孢子至干凈的離心管中,充分研磨,按照J(rèn)ensen等[29]的方法離心純化球囊菌孢子,梯度稀釋后用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。

    1.3 意蜂幼蟲的人工飼養(yǎng)及球囊菌接種感染

    按照李江紅等[25]的方法配制意蜂幼蟲的飼料,預(yù)實驗結(jié)果顯示,意蜂7日齡幼蟲的成活率可達(dá)90%以上。從學(xué)院教學(xué)蜂場群勢較強(qiáng)的健康意蜂蜂群(無白堊病癥狀且PCR檢測為陰性)中提取巢脾,將2日齡幼蟲移至已預(yù)置飼料的24孔培養(yǎng)板中,置于35 ℃、70%相對濕度(RH)條件下培養(yǎng)。配制終濃度為1×107cfu·mL-1的飼料,飼喂3日齡幼蟲,24 h后飼喂不含球囊菌孢子的正常飼料。每24 h更換飼料。

    1.4 測序樣品的準(zhǔn)備、cDNA文庫構(gòu)建及Illumina測序

    剖取上述球囊菌感染的6日齡幼蟲腸道,液氮速凍后超低溫保存?zhèn)溆?。本實驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。測序樣品分別為球囊菌的純化孢子(AaCK)和球囊菌脅迫的意蜂6日齡幼蟲腸道。AaCK的3個生物學(xué)重復(fù)分別為AaCK-1、AaCK-2和AaCK-3。cDNA文庫構(gòu)建按照張曌楠等[28]的方法進(jìn)行。上述6個樣品的Illumina測序委托廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行,測序平臺為Illumina HiSeq 2500。

    1.5 差異表達(dá)基因(DEGs)分析

    利用Perl腳本除去測序數(shù)據(jù)原始讀段(raw reads)中未知核苷酸含量大于5%和質(zhì)量低的reads,得到有效讀段(clean reads)。利用短reads比對工具bowtie分別將各測序樣品的有效讀段映射到核糖體數(shù)據(jù)庫,去除mapping上核糖體的reads后,進(jìn)一步mapping西方蜜蜂參考基因組(Amel_4.5,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/48?genome_assembly_id=22683)。利用SOAP aligner/soap2軟件將未mapping上西方蜜蜂基因組的reads(AamT: AamT-1、AamT-2和AamT-3)mapping到球囊菌參考轉(zhuǎn)錄組[28]。通過Pearson相關(guān)性評估樣品的生物學(xué)重復(fù)性。利用FPKM(Fragments per kilobase of transcript per Million mapped reads)法計算基因表達(dá)量。利用R軟件計算各樣品之間的相關(guān)性系數(shù)。DEGS的篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR≤0.05且|log2Fold change|≥1。

    利用WEGO軟件對DEGs進(jìn)行GO富集分析。利用Blastall將DEGs比對KEGG(Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/),進(jìn)行KEGG 代謝通路(pathway)富集分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)控與評估

    球囊菌純化孢子的RNA-seq共產(chǎn)生84 724 576條raw reads,過濾得到80 091 556條clean reads,各樣品clean reads數(shù)均在2 253 412以上,兩端Q20(99%堿基正確率)均在97.05%以上,兩端Q30(99.9%堿基正確率)均在92.55%以上(表1)。為獲得純凈的球囊菌數(shù)據(jù),將測序數(shù)據(jù)先mapping核糖體數(shù)據(jù)庫,再mapping西方蜜蜂參考基因組和球囊菌參考轉(zhuǎn)錄組。上述結(jié)果說明本研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量良好,可用于進(jìn)一步分析。

    Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示AaCK與AamT的各生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性均在0.801以上(0.801 0~0.999 9),說明樣本組內(nèi)重復(fù)性較高。進(jìn)一步對AaCK與AamT進(jìn)行主成分分析(PCA),并進(jìn)行歸一化處理,結(jié)果顯示第1主成分(PC1)與第2主成分(PC2)可分別解釋樣品基因表達(dá)總體差異的67.1%和14.4%,而且各樣品重復(fù)的聚類情況良好,說明本研究中處理組和對照組樣品的基因表達(dá)總體差異明顯(圖1)。

    表1 RNA-seq數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    Table 1 A summary of RNA-seq data

    樣品Samples原始數(shù)據(jù)Rawdata有效讀段CleanreadsQ20Q30AaCK?12734661625880356(9464%)3141471373(9711%)2998660797(9269%)AaCK?22876246227141980(9437%)3292721137(9705%)3139851346(9255%)AaCK?32861549827069220(946%)3287257287(9715%)3138887961(9277%)AamT?132295303178978(9843%)388999973(9789%)378044002(9514%)AamT?223453362253412(9608%)273461324(9708%)263268347(9346%)AamT?330502742942398(9646%)357479492(9719%)344314704(9361%)

    圖1 AaCK與AamT的主成分分析Fig.1 Principal components analysis of AaCK and AamT

    2.2 差異表達(dá)基因(DEGs)分析

    通過比較處理組和對照組,共得到21 361個DEGs,其中包括15 306個上調(diào)基因與6 055個下調(diào)基因(圖2)。上調(diào)基因的數(shù)量遠(yuǎn)多于下調(diào)基因,說明在脅迫意蜂幼蟲腸道的后期,球囊菌的多數(shù)基因被激活表達(dá)。

    GO富集分析結(jié)果顯示,上調(diào)基因富集于39個GO term,其中基因富集數(shù)最多的是細(xì)胞進(jìn)程(2 416 unigenes)、細(xì)胞(2 408 unigenes)、細(xì)胞組件(2 408 unigenes)、代謝進(jìn)程(2 347 unigenes)、催化活性(2 310 unigenes)、結(jié)合(1 870 unigenes)、單組織進(jìn)程(1 852 unigenes)、細(xì)胞器(1 536 unigenes)、大分子復(fù)合物(817 unigenes)和定位(757 unigenes)(圖3-A)。下調(diào)基因富集于38個GO term,基因富集數(shù)最多的是代謝進(jìn)程(1 227 unigenes)、細(xì)胞進(jìn)程(1 185 unigenes)、細(xì)胞(1 131 unigenes)、細(xì)胞組件(1 131 unigenes)、催化活性(1 115 unigenes)、結(jié)合(920 unigenes)、單組織進(jìn)程(859 unigenes)、細(xì)胞器(644 unigenes)、

    圖2 AamT和AaCK的差異表達(dá)基因分析Fig.2 DEGs analysis in AamT and AaCK

    大分子復(fù)合物(384 unigenes)及定位(349 unigenes)(圖3-B)。

    KEGG 代謝通路富集分析結(jié)果顯示,上調(diào)基因富集在119個通路,其中,基因富集數(shù)量最多的是核糖體(221 unigenes),其次為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工(190 unigenes)和內(nèi)吞作用(177 unigenes)(圖4),說明球囊菌在脅迫意蜂幼蟲腸道的后期,通過大幅提高蛋白合成來滿足病原孢子萌發(fā)與菌絲生長的需要。此外,大量DEGs富集在各類物質(zhì)代謝,如碳代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝及氨基酸和核苷酸糖代謝,說明球囊菌在脅迫后期因增殖對蛋白、核酸等物質(zhì)需求大增;也有大量DEGs富集在能量代謝,如氧化磷酸化和糖酵解/糖異生,說明球囊菌在脅迫意蜂幼蟲腸道的過程中,伴隨著物質(zhì)代謝的提升,其能量代謝也相應(yīng)增強(qiáng)。下調(diào)基因富集在113個通路,其中基因富集數(shù)量最多的是核糖體(144 unigenes),其次為RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(113 unigenes)和氨基酸生物合成(108 unigenes)(圖4),說明球囊菌在脅迫后期受到宿主一定程度的抑制,球囊菌—意蜂幼蟲腸道間存在復(fù)雜的互作。

    進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),有64個上調(diào)基因富集在MAPK信號通路(圖5),表達(dá)量聚類分析結(jié)果顯示這些基因的表達(dá)水平上調(diào)程度不同,說明該通路在脅迫后期極為活躍。

    3 討論

    意蜂是我國養(yǎng)蜂生產(chǎn)中的主要蜂種,其幼蟲極易被球囊菌侵染而罹患白堊病。近20年來,人們對球囊菌開展了一系列研究,但由于基因組信息的缺失,其分子研究一直進(jìn)展緩慢。球囊菌基因組信息的公布[26]為在分子水平深入研究該病原奠定了重要基礎(chǔ),但作者當(dāng)時并未公布基因位置及功能注釋信息,以致球囊菌的分子研究舉步維艱。為了對球囊菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,我們在前期研究中denovo組裝了球囊菌的參考轉(zhuǎn)錄組并對其進(jìn)行了功能及代謝通路注釋[28],可為深入開展球囊菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供可靠的參考信息。

    Cornman等[27]曾對純培養(yǎng)的球囊菌菌絲和西方蜜蜂幼蟲感染組織長出的球囊菌菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,但后者是幼蟲腸道內(nèi)萌發(fā)生長的菌絲穿透腸壁后繼而穿透體壁的菌絲,因此時已不再與宿主互作,其轉(zhuǎn)錄組變化并不能精確反映球囊菌在侵染過程中的基因表達(dá)情況。本研究的測序?qū)ο笫羌兣囵B(yǎng)的球囊菌及球囊菌脅迫的意蜂6日齡幼蟲腸道,腸道內(nèi)的球囊菌此時與宿主間存在復(fù)雜的互作。通過對球囊菌脅迫幼蟲腸道測序數(shù)據(jù)的過濾得到腸道內(nèi)球囊菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),進(jìn)而與純培養(yǎng)的球囊菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析,能夠更為精確地反映球囊菌在脅迫后期的基因表達(dá)情況。本研究發(fā)現(xiàn),脅迫后期的球囊菌有15 306個基因上調(diào)表達(dá),說明球囊菌的多數(shù)基因被激活。球囊菌是蜜蜂幼蟲的專性真菌病原,與意蜂幼蟲在長期的協(xié)同進(jìn)化中相互適應(yīng)。本研究中,球囊菌的6 055個基因下調(diào)表達(dá),表明球囊菌—意蜂幼蟲間存在較為復(fù)雜的互作,意蜂幼蟲可通過某種互作機(jī)制對球囊菌的部分基因產(chǎn)生抑制。球囊菌的許多下調(diào)基因富集在物質(zhì)代謝通路和信號通路,如富集在核糖體上的40S核糖體蛋白S8編碼基因(unigene 0015791)和60S酸性核糖體蛋白P1(unigene 0016073),富集在RNA轉(zhuǎn)運(yùn)上的翻譯起始因子eif3亞基編碼基因(unigene 0016266)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體編碼基因(unigene 0039179),富集在mRNA監(jiān)督上的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因(unigene 0005915)和mRNA輸出因子TAP/MEX67編碼基因(unigene 0036972),表明宿主能通過影響球囊菌的物質(zhì)、能量代謝以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對病原產(chǎn)生抑制,二者之間互作機(jī)制的闡明有待于進(jìn)一步研究。球囊菌在侵染過程中需要不斷合成蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)來滿足自身增殖需要。本研究中,大量參與蛋白質(zhì)與遺傳物質(zhì)合成相關(guān)通路的基因表現(xiàn)為上調(diào),如富集在核糖體上的60S核糖體蛋白L18-B編碼基因(unigene 0031257)和40S核糖體蛋白S3編碼基因(unigene 0030940),富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工上的HDEL序列結(jié)合蛋白編碼基因(unigene 0041878)和J結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因(unigene 0001009),富集在DNA復(fù)制上的DNA復(fù)制許可因子MCM5編碼基因(unigene 0029460)和核糖核酸酶H2亞基C編碼基因(unigene 0006716),富集在RNA轉(zhuǎn)運(yùn)上的ATP依賴的RNA解旋酶eIF4A編碼基因(unigene 0018630)和泛素結(jié)合酶9編碼基因(unigene 0042593)。

    A,AamT VS AaCK中上調(diào)基因的GO富集分析;B,AamT VS AaCK中下調(diào)基因的GO富集分析。A: 1,生物附著;2,生物學(xué)調(diào)控;3,細(xì)胞成分組成或生物合成;4,細(xì)胞進(jìn)程;5,發(fā)育進(jìn)程;6,生長;7,定位;8,代謝進(jìn)程;9,多組織進(jìn)程;10,多細(xì)胞生物進(jìn)程;11,生殖;12,生殖進(jìn)程;13,應(yīng)激;14,信號;15,單組織進(jìn)程;16,細(xì)胞;17,細(xì)胞連接;18,細(xì)胞組件;19,大分子復(fù)合物;20,細(xì)胞膜;21,細(xì)胞膜組件;22,膜內(nèi)腔;23,擬核;24,細(xì)胞器;25,細(xì)胞器組件;26,病毒粒子;27,病毒粒子組件;28,抗氧化活性;29,結(jié)合;30,催化活性;31,電子載體活性;32,酶調(diào)節(jié)活性;33,鳥嘌呤核苷酸交換因子活性;34,分子功能調(diào)節(jié)器;35,分子傳感器活性;36,核苷酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;37,蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;38,結(jié)構(gòu)分子活性;39,轉(zhuǎn)運(yùn)器活性B:1,生物學(xué)調(diào)控;2,細(xì)胞成分組成或生物合成;3,細(xì)胞進(jìn)程;4,發(fā)育進(jìn)程;5,生殖;6,定位;7,代謝進(jìn)程;8,多組織進(jìn)程;9,多細(xì)胞生物進(jìn)程;10,生殖;11,生殖進(jìn)程;12,應(yīng)激;13,信號;14,單組織進(jìn)程;15,細(xì)胞;16,細(xì)胞連接;17,細(xì)胞組件;18,大分子復(fù)合物;19,細(xì)胞膜;20,細(xì)胞膜組件;21,膜內(nèi)腔;22,擬核;23,細(xì)胞器;24,細(xì)胞器組件;25,病毒粒子;26,病毒粒子組件;27,抗氧化活性;28,結(jié)合;29,催化活性;30,電子載體活性;31,酶調(diào)節(jié)活性;32,鳥嘌呤核苷酸交換因子活性;33,分子功能調(diào)節(jié)器;34,分子傳感器活性;35,核苷酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;36,蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;37,結(jié)構(gòu)分子活性;38,轉(zhuǎn)運(yùn)器活性A: GO enrichment analysis of up-regulated genes in AamT VS AaCK; B: GO enrichment analysis of down regulated genes in AamT VS AaCK. A: 1, biological adhesion; 2, biological regulation; 3, cellular component organization or biogenesis; 4, cellular process; 5, developmental process; 6, growth; 7, localization; 8, metabolic process; 9, multi-organism process; 10, multicellular organismal process; 11, reproduction; 12, reproductive process; 13, response to stimulus; 14, signaling; 15, single-organism process; 16, cell; 17, cell junction; 18, cell part; 19, macromolecular complex; 20, membrane; 21, membrane part; 22, membrane-enclosed lumen; 23, nucleoid; 24, organelle; 25, organelle part; 26, virion; 27, virion part; 28, antioxidant activity; 29, binding; 30, catalytic activity; 31, electron carrier activity; 32, enzyme regulator activity; 33, guanyl-nucleotide exchange factor activity; 34, molecular function regulator; 35, molecular transducer activity; 36, nucleic acid binding transcription factor activity; 37, protein binding transcription factor activity; 38, structural molecule activity; 39, transporter activityB: 1, biological regulation; 2, cellular component organization or biogenesis; 3, cellular process; 4, developmental process; 5, growth; 6, localization; 7, metabolic process; 8, multi-organism process; 9, multicellular organismal process; 10, reproduction; 11, reproductive process; 12, response to stimulus; 13, signaling; 14, single-organism process; 15, cell; 16, cell junction; 17, cell part; 18, macromolecular complex; 19, membrane; 20, membrane part; 21, membrane-enclosed lumen; 22, nucleoid; 23, organelle; 24, organelle part; 25, virion; 26, virion part; 27, antioxidant activity; 28, binding; 29, catalytic activity, 30, electron carrier activity; 31, enzyme regulator activity; 32, guanyl-nucleotide exchange factor activity; 33, molecular function regulator; 34, molecular transducer activity; 35, nucleic acid binding transcription factor activity; 36, protein binding transcription factor activity; 37, structural molecule activity; 38, ransporter activity圖3 AamT VS AaCK中DEGs的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of the DEGs in AamT VS AaCK

    A,AamT VS AaCK中上調(diào)基因的KEGG代謝通路富集分析;B,AamT VS AaCK中下調(diào)基因的KEGG 代謝通路富集分析A, KEGG pathway enrichment analysis of the up-regulated genes in AamT VS AaCK; B, KEGG pathway enrichment analysis of the down regulated genes in AamT VS AaCK圖4 AamT VS AaCK中DEGS的KEGG 代謝通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of the DEGS in AamT VS AaCK

    圖5 AamT中的MAPK信號通路Fig.5 MAPK signaling pathway in AamT

    真菌可通過復(fù)雜而保守的信號級聯(lián)反應(yīng)以快速響應(yīng)外界環(huán)境變化[30]。通過將相應(yīng)的環(huán)境信號因子級聯(lián)傳遞至細(xì)胞內(nèi),引起特定的基因表達(dá)來調(diào)節(jié)形態(tài)、繁殖和毒力等過程。信號通路中涉及真菌的主要有MAPK信號通路、雙組分信號傳導(dǎo)通路和cAMP-PKA信號通路等[31],其中MAPK信號通路最為關(guān)鍵[32]。MAPK級聯(lián)反應(yīng)均參與了真菌的應(yīng)激反應(yīng)和致病性的關(guān)鍵途徑[33]。本研究發(fā)現(xiàn),球囊菌在脅迫意蜂幼蟲腸道過程中,有64個DEGs在MAPK信號通路中表現(xiàn)為上調(diào),如p38MAP激酶編碼基因(unigene 0012136)和MAP激酶編碼基因(unigene 0001592)等,推測MAPK信號通路在球囊菌脅迫意蜂幼蟲的后期扮演著重要角色,該通路上的基因上調(diào)表達(dá)經(jīng)級聯(lián)反應(yīng)對球囊菌的配合、細(xì)胞周期、滲透物合成及菌絲形成產(chǎn)生重要影響(圖5)。本研究只針對意蜂6日齡幼蟲腸道內(nèi)的球囊菌進(jìn)行分析,該通路在其他日齡幼蟲中表現(xiàn)如何有待于進(jìn)一步研究。下一步我們將通過人工合成siRNA對球囊菌MAPK信號通路上的主要基因進(jìn)行沉默,驗證該通路在球囊菌脅迫過程中的作用,有望為白堊病的治療提供潛在的分子靶點。

    昆蟲的體壁及消化道上皮圍食膜的角質(zhì)層對于保護(hù)昆蟲的體內(nèi)器官和防止病原體的侵害有重要作用,一般由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)形成[34]。而絲狀真菌產(chǎn)生的各種次生代謝產(chǎn)物(包含幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶等)多涉及毒力調(diào)控,對宿主的致死過程具有相當(dāng)重要的輔助作用。陳大福等[35]發(fā)現(xiàn)A.apis的胞外蛋白酶活性與其菌株毒力和蜜蜂幼蟲日累計致死數(shù)量密切相關(guān)。昆蟲病原真菌主要是依靠酶的降解和機(jī)械壓力的作用侵入宿主[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)共有12個DEGs涉及編碼幾丁質(zhì)酶,其中9個基因表達(dá)水平上調(diào),如Ⅴ類幾丁質(zhì)酶編碼基因(unigene 0018355)和幾丁質(zhì)酶3編碼基因(unigene 0028056)等,表明球囊菌在侵染意蜂幼蟲的過程中,可通過分泌幾丁質(zhì)酶協(xié)助其穿透幼蟲腸道的圍食膜,并在疾病后期病原突破宿主體表的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

    本研究利用RNA-seq技術(shù)對意蜂6日齡幼蟲腸道內(nèi)球囊菌進(jìn)行DEGS分析,研究結(jié)果不僅為揭示脅迫后期的球囊菌—意蜂幼蟲互作提供了重要信息和線索,也為闡明球囊菌致病的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。未來的研究方向是通過趨勢分析和基因權(quán)重共表達(dá)(WGCNA)分析進(jìn)一步篩選得到球囊菌的關(guān)鍵致病基因,并對其進(jìn)行分子克隆和功能驗證。

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    (責(zé)任編輯 侯春曉)

    Transcriptome analysis of differentially expressed genes inAscosphaeraapisstressing the 6-day-old larval gut ofApismelliferaligustica

    DU Yu1, XIONG Cuiling1, SHI Xiuli2, ZHENG Yanzhen1, FU Zhongmin1, XU Xijian1, CHEN Dafu1, GUO Rui1,*

    (1.CollegeofBeeScience,F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity,F(xiàn)uzhou350002,China; 2.ApiculturalDevelopmentCentreinXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830000,China)

    The purifiedAscosphaeraapisspores and the 6-day-old larval gut ofApismelliferaligusticaunder the stress ofA.apiswere sequenced using RNA-seq technology to detect gene expression patterns of the fungal pathogen. A total of 21 361 differentially expressed genes (DEGs) were obtained, including 15 306 up-regulated genes and 6 055 down-regulated genes. GO enrichment analysis showed that the up-regulated genes were enriched in 39 terms, among them the mostly enriched ones were cellular process (2 416 unigenes), cell (2 408 unigenes) and cell part (2 408 unigenes); the down-regulated genes were enriched in 38 terms, and the mostly enriched ones were metabolic process (1 227 unigenes), cellular process (1 185 unigenes) and cell (1 131 unigenes). KEGG enrichment analysis displayed that the up-regulated genes were enriched in 119 pathways, and the largest groups were ribosome (221 unigenes), protein processing in endoplasmic reticulum (190 unigenes) and endocytosis (177 unigenes); the down-regulated genes were enriched in 113 pathways, and the mostly enriched ones were ribosome (144 unigenes), RNA transport (113 unigenes) as well as biosynthesis of amino acid (108 unigenes). Furthermore, 64 up-regulated genes were found to be enriched in MAPK signaling pathway, suggesting that it was induced to a large extent. The data not only provided key information for uncovering the pathogen-host interaction during the late stage of the stress ofA.apisonA.m.ligusticalarvae, but also laid some foundation for clarifying molecular mechanisms regulating the pathogenesis ofA.apis.

    Ascosphaeraapis;Apismelliferaligustica; larval gut; DEGs; RNA-seq

    http://www.zjnyxb.cn

    10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.09

    2016-03-08

    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-45-KXJ7);福建農(nóng)林大學(xué)科技發(fā)展資金(KF2015123);國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201610389016)

    杜宇(1994—),男,河北唐山人,本科生,專業(yè)為蜂學(xué),E-mail: 599195720@qq.com

    *通信作者,郭睿,E-mail: ruiguo@fafu.edu.cn

    S895.1

    A

    1004-1524(2017)07-1119-10

    浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis, 2017,29(7): 1119-1128

    杜宇, 熊翠玲, 史秀麗, 等. 意大利蜜蜂6日齡幼蟲腸道內(nèi)球囊菌的差異表達(dá)基因分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2017, 29(7): 1119-1128.

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