Hes1在煙草誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用*

洪 磊， 周繼紅， 李 偉， 陳余清△， 蔣 鵬， 袁娜娜， 王效靜， 朱茂祥， 楊陟華

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽呼吸系病臨床基礎(chǔ)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 蚌埠 233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 安徽 蚌埠 233002； 3軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所， 北京 100850)

·論 著·

Hes1在煙草誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用*

洪 磊1， 周繼紅2， 李 偉1， 陳余清1△， 蔣 鵬1， 袁娜娜1， 王效靜1， 朱茂祥3， 楊陟華3

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽呼吸系病臨床基礎(chǔ)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 蚌埠 233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 安徽 蚌埠 233002； 3軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所， 北京 100850)

目的： 探討轉(zhuǎn)錄因子發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split，Hes1)在香煙煙氣凝集物(cigarette smoke condensate，CSC)誘導(dǎo)永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D惡性轉(zhuǎn)化中的作用。方法: CSC (1L空氣中點(diǎn)燃1支香煙)慢性染毒BEP2D細(xì)胞至第70代，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CSC誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化表型；采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)各代細(xì)胞的Hes1表達(dá)；MTT法、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Notch通路阻斷劑DAPT或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hes1-siRNA對(duì)CSC染毒BEP2D細(xì)胞增殖與凋亡的影響。檢測(cè)吸煙大鼠外周小氣道組織中Hes1的表達(dá)；采用免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織及正常氣道組織中Hes1的表達(dá)。結(jié)果: 第70代BEP2D細(xì)胞具備惡性轉(zhuǎn)化表型；Hes1在CSC染毒BEP2D細(xì)胞中的表達(dá)總體呈逐漸增高的趨勢(shì)；DAPT和Hes1-siRNA均能通過下調(diào)Hes1顯著抑制第70代BEP2D細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡；Hes1在卷煙煙氣暴露大鼠氣道黏膜1月和6月組的表達(dá)較同期對(duì)照組顯著增高；吸煙顯著誘導(dǎo)肺癌組織和正常氣道表達(dá)Hes1。結(jié)論: Hes1可能通過促進(jìn)凋亡與增殖失衡，參與吸煙誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生。

肺癌； 吸煙； 轉(zhuǎn)錄因子Hes1； 香煙煙氣凝集物

肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，全球每年大約有1 600萬新確診肺癌患者[1]。吸煙與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]，香煙煙霧中有69種致癌物，包括尼古丁、尼古丁衍生的亞硝胺酮[nicotine-derived nitrosamine ketone，NNK； 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone]和多環(huán)芳烴等[3]，這些成分可通過多種途徑影響肺癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移[4]。但煙草致癌的具體分子機(jī)制尚未闡明。轉(zhuǎn)錄因子發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split 1，Hes1)是Notch信號(hào)通路中重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與干細(xì)胞自我更新能力的維持，可抑制干細(xì)胞的不對(duì)稱有絲分裂[5]，因此Hes1的異常表達(dá)會(huì)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)與分化產(chǎn)生重要影響。Hes1在包括橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)Hes1高表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中[8]。但其在煙草致癌中的作用目前國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物、細(xì)胞和組織標(biāo)本

1.1 動(dòng)物分組與模型的制備 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠72只，體重(180±20)g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為2組，一組在正常呼吸空氣條件下飼養(yǎng)，注意給予基礎(chǔ)飼料和充足的水；另一組給予煙霧吸入，采用市售某品牌香煙(焦油量 14 mg，煙氣煙堿量 1 mg)，將大鼠置入70 cm×50 cm×50 cm密閉染毒裝置中被動(dòng)吸煙，每日2次，每次連續(xù)燃燒10支香煙，共持續(xù)約30 min，每周7 d，連續(xù)6個(gè)月。2組動(dòng)物分別于飼養(yǎng)1、3、6月各處死12只，取肺組織標(biāo)本石蠟包埋進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞 永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所朱茂祥教授饋贈(zèng)。

1.3 組織標(biāo)本 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2013年6月～2016年1月非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)手術(shù)存檔標(biāo)本(石蠟包埋)50例。所有患者采集標(biāo)本前均未經(jīng)過放療、化療和靶向治療。所有標(biāo)本均有完整的臨床及病理資料。男性占37例，女性占13例；年齡<60歲的14例，≥60歲的36例；肺癌的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2004年WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。按組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)占12例，Ⅱ級(jí)占22例，Ⅲ級(jí)占16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例；詳細(xì)記錄每例患者吸煙時(shí)間、每天吸煙量(包)和戒煙時(shí)間。吸煙指數(shù)(包×年)=每天吸煙的包數(shù)(每包20支)×吸煙年數(shù)。按患者吸煙狀況分類：從不吸煙者21例，重度吸煙29例(從不吸煙者定義為終生吸煙劑量少于100支；重度吸煙的定義為吸煙指數(shù)>20包×年)。篩查2013 年4 月～2015 年12 月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)鏡中心接受氣管鏡檢查的重度吸煙人群，所有患者經(jīng)過病理和隨訪最終確定為非腫瘤患者。最終篩選出10 例重度吸煙患者(病理證實(shí)7 例為中到重度不典型增生，3 例為鱗狀化生)和10 例不吸煙患者(該20例患者中結(jié)核4例，炎癥13例，間質(zhì)性肺炎3例)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行的。

2 主要試劑

RIPA裂解液和BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天)；Trizol和PCR試劑盒(北京天根)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；抗Hes1單克隆抗體、抗Notch1及Notch的活化形式Notch胞內(nèi)段(Notch intracellular domain，NICD)多克隆抗體(Abcam)； HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(博士德)；DAPT(Notch阻斷劑)購于Sigma；超敏即用型二步法免疫組化試劑盒和DBA顯色試劑盒(中杉金橋)；單通道吸煙機(jī)(型號(hào)HRH-SM120，北京慧榮和科技公司)；卷煙煙氣染毒柜(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制)。

3 主要方法

3.1 香煙煙氣凝集物(cigarette smoke condensate，CSC)的制備及細(xì)胞培養(yǎng) 用北京慧榮和科技公司生產(chǎn)的HRH-SM120型單通道吸煙機(jī)制備CSC，用LHC-8培養(yǎng)液稀釋到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度處理細(xì)胞直接進(jìn)行細(xì)胞染毒，CSC在一定程度上代表了主流煙氣中的主要成分。正常對(duì)照組(BEP2D細(xì)胞)、乙醇對(duì)照組及CSC(每升空氣點(diǎn)燃1支香煙)處理后的P10、P20、P30、P40、P50、 P60、P70細(xì)胞組(分別代表第10～70代染毒細(xì)胞)，使用LHC-8無血清培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3.2 軟瓊脂細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 采用LHC-8培養(yǎng)液配制1.4%的瓊脂糖，高溫高壓滅菌后，稍冷卻后放入41 ℃水浴鍋中保溫；加入預(yù)溫的LHC-8培養(yǎng)液稀釋至0.7%，繼續(xù)保溫；以每皿3 mL 0.7%瓊脂糖倒進(jìn)直徑60 mm培養(yǎng)皿中，鋪制底層，待其凝固后備用。將常規(guī)消化呈指數(shù)生長(zhǎng)的9組細(xì)胞，制備相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液懸液與保溫的0.7%瓊脂糖1∶1混勻，稀釋為0.35%細(xì)胞瓊脂混合液，加在含0.7%瓊脂糖膠培養(yǎng)皿上(細(xì)胞密度為每皿1.5×104)，待細(xì)胞瓊脂混合液凝固后，每皿中加入2 mL LHC-8培養(yǎng)液。每組設(shè)5皿；在5% CO2、37 ℃和飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，3 d換液1次；4周后行鏡下計(jì)數(shù)，細(xì)胞多于50個(gè)為1個(gè)集落，按以下公式計(jì)算集落形成率(clony formation efficiency，CFE)：CFE(%)=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

3.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各不同染毒代數(shù)細(xì)胞蛋白，以100 ℃煮沸5 min，使蛋白充分變性，10% SDS-PAGE分離目的蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；裁剪后的膜用封閉液室溫封閉1.5 h，加入稀釋后的 I 抗(Notch1、NICD、Hes1和β-actin抗體分別用 I 抗稀釋液以1∶500、1∶1 000、1∶1 000和1∶400 稀釋)，4 ℃孵育過夜；次日用TBST緩沖液洗膜3次，采用HRP標(biāo)記的 II抗37 ℃ 孵育20 min，繼而室溫下孵育80 min 左右(60 r/min)；再用TBST緩沖液洗膜3次，配置化學(xué)發(fā)光試劑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用AlphaView軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析。數(shù)據(jù)使用目標(biāo)蛋白的灰度值/內(nèi)參照(β-actin)灰度值表示。

3.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 采用Trizol法提取處理后各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔并至少重復(fù)2次。β-actin表達(dá)量作為內(nèi)參照。數(shù)據(jù)使用目標(biāo)基因mRNA/內(nèi)參照(β-actin)灰度值表示。Hes1的上游引物序列為5′-CCCTCCTCCTAAACTCCC-3′，下游引物序列為5′-TCAAACATCTTTGGCATCA-3′。內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物序列為 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。

3.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將CSC染毒的P70細(xì)胞分成4組，分別加入0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L的DAPT，分別處理24 h、48 h和72 h。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107/L；在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至孔底細(xì)胞鋪滿單層，加入200 μL含上述濃度梯度抑制劑的培養(yǎng)液，毎個(gè)梯度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(不含細(xì)胞和藥物，只添加培養(yǎng)基)；37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至設(shè)定時(shí)間后，每孔加入20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h；培養(yǎng)終止，輕輕吸去96孔板內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置于低速搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；測(cè)量各孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度并記錄。同樣方法檢測(cè)Hes1干擾后的細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)設(shè)立3組： 實(shí)驗(yàn)組(siRNA-Hes1組)、陰性對(duì)照組(siRNA-NC組)和空白組(control組)。siRNA合成及轉(zhuǎn)染方法見3.9。

3.6 細(xì)胞集落形成檢測(cè) 準(zhǔn)備感染后的細(xì)胞，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。于6孔培養(yǎng)板中每孔接種400～1 000 個(gè)細(xì)胞(根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況確定)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將接種好的細(xì)胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到14 d或絕大多數(shù)單個(gè)集落中細(xì)胞數(shù)大于50 為止，中途每隔3 d進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)終止前熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行拍照，PBS 洗滌細(xì)胞1 次。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30～60 min，PBS 洗滌細(xì)胞1 次。每孔加入潔凈、無雜質(zhì)Giemsa 染液500 μL，染細(xì)胞10～20 min。ddH2O 洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干，集落計(jì)數(shù)。

3.7 Annexin V-PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)DAPT及DAPT作用不同時(shí)間(24 h、48 h和72 h)后P70細(xì)胞的凋亡。操作步驟參照碧云天公司Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書。同樣方法檢測(cè)Hes1沉默后的細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)分為siRNA-Hes1組、siRNA-NC組和control組。

3.8 免疫組化實(shí)驗(yàn) 所有標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色。60 ℃烤箱烘片4 h，然后脫蠟至水，梯度乙醇脫水，隨后水洗；采用檸檬酸抗原修復(fù)液煮沸10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，其余步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，DAB顯色后，用蘇木精復(fù)染，封片。結(jié)果判定采用雙盲法，由2位病理科醫(yī)師分別觀察切片。Hes1陽性顯色主要定位于細(xì)胞核。采用半定量積分法判定結(jié)果。首先按照著色強(qiáng)度評(píng)分，標(biāo)本無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按照陽性細(xì)胞在所觀察細(xì)胞中所占比例評(píng)分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。每張切片最后的得分為2次評(píng)分的乘積(1～12分)。

3.9 siRNA合成及轉(zhuǎn)染 參考文獻(xiàn)[9]并通過基因BLAST,挑選一條特異性寡核苷酸序列(由上海吉瑪制藥有限公司合成)。同時(shí)合成一條與目的RNA無同源性的片段作為陰性對(duì)照。Hes1序列為5′-CCGGCTTCAGCGAGTGCATGA-3′；陰性對(duì)照序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。以熒光標(biāo)記的siRNA(FAM siRNA)進(jìn)行優(yōu)化。以1.5×108cells/L接種細(xì)胞于含無菌小圓玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔500 μL(保證在轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的匯合度在90%左右)。24 h后按照Lipofectamine 2000說明書的條件轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h，換新鮮培養(yǎng)基。設(shè)立若干個(gè)siRNA濃度組，每組Opti-MEM用量為500 μL。24 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。確定1 μL Lipofectamine 2000配50 nmol/L siRNA為最佳轉(zhuǎn)染濃度。實(shí)驗(yàn)分為siRNA-Hes1組、siRNA-NC組和control 組。

3.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Hes1基因表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)干擾效率。細(xì)胞按照上面優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)染，分組同上；提取細(xì)胞總RNA；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的反應(yīng)步驟及反應(yīng)條件(65 ℃ 5 min， 42 ℃ 60 min， 70 ℃ 5 min)獲得cDNA；熒光定量PCR使用Quantace qPCR Mix的PCR試劑盒，反應(yīng)液配制按說明書操作，建立RT-qPCR反應(yīng)體系，RT-qPCR反應(yīng)條件為： 42 ℃ 60 min； 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 20 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 45次循環(huán)。Hes1上游引物序列為5′-AAGAAAGATAGCTCGCGGCAT-3′，下游引物序列為5′-CCAGCACACTTGGGTCTGT-3′；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。用2-ΔΔCt值表示 Hes1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組之間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)，多組之間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，若總體均數(shù)有差異，進(jìn)行組間的兩兩比較的q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用行×列表資料的χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CSC對(duì)各代細(xì)胞形態(tài)的影響

與對(duì)照組(正常對(duì)照組和乙醇組)相比，CSC誘導(dǎo)P10～P70支氣管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度逐漸加快，以P50和P70細(xì)胞變化明顯，細(xì)胞體積變大，開始呈復(fù)層生長(zhǎng)，排列紊亂，細(xì)胞群體出現(xiàn)無序的團(tuán)塊狀或條索狀生長(zhǎng)，無明顯的密度抑制和接觸性抑制，見圖1。

2 CSC誘導(dǎo)對(duì)各代細(xì)胞軟瓊脂細(xì)胞集落形成的影響

軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞在雙層軟瓊脂中集落形成的能力，是檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的重要指標(biāo)。P10和P20細(xì)胞的集落形成率較低，P30以后細(xì)胞，軟瓊脂細(xì)胞的集落形成顯著升高，且所形成的集落形態(tài)明顯增大，以P70細(xì)胞的集落形成率最高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The images of the cells exposed to CSC in different generations.

圖1 CSC誘導(dǎo)的各代細(xì)胞圖

Figure 2.The images of the soft agar cell colony formation experiment for each group (×200).

圖2 各組細(xì)胞的軟瓊脂細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 Hes1 mRNA在CSC誘導(dǎo)各代細(xì)胞中的表達(dá)

乙醇組、P10、P20、P30、P40、P50、P60和P70細(xì)胞Hes1的mRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組高(P<0.01)；P20、P30、P40、P50、P60和P70細(xì)胞中Hes1的mRNA表達(dá)量較P10細(xì)胞高(P<0.05)。Hes1的mRNA表達(dá)量隨著染毒代數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，見圖3A。

4 Hes1 蛋白在CSC誘導(dǎo)各代細(xì)胞中的表達(dá)

Hes1蛋白在9種不同代數(shù)細(xì)胞中的表達(dá)量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常對(duì)照組相比，乙醇組、P10、P20、P30、P40、P50、P60和P70細(xì)胞中的Hes1 蛋白表達(dá)量升高(P<0.01)；與P10相比，P20、P30、P40、P50、P60和P70細(xì)胞中的Hes1蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。Hes1蛋白表達(dá)量隨著染毒代數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，見圖3B。

Figure 3.The expression of Hes1 at mRNA and protein levels in the BEP2D cells with the malignant transformation at different stages. A: the mRNA expression of Hes1 in the BEP2D cells； B: the results of Western blot and the quantitative analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal；#P<0.05vsP10.

圖3 CSC誘導(dǎo)BEP2D惡性轉(zhuǎn)化不同階段Hes1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化

5 吸煙對(duì)大鼠小氣道黏膜Hes1表達(dá)的影響

如圖4及表1所示，正常1、3、6月組大鼠小氣道組織Hes1表達(dá)陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；煙熏1、3、6月大鼠Hes1表達(dá)陽性率的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Hes1表達(dá)陽性率隨著大鼠煙熏時(shí)間的增加而升高。煙熏1月大鼠Hes1表達(dá)陽性率與對(duì)照組無顯著性差異，而煙熏3、6月大鼠小氣道組織Hes1表達(dá)的陽性率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

Figure 4.The protein expression of Hes1 in small airway epithelial cells of the rats with different smoking levels (×400). A: normal group; B: 1-month smoking group; C: 3-month smoking group; D: 6-month smoking group.

圖4 不同煙熏程度的大鼠小氣道上皮細(xì)胞Hes1表達(dá)

表1 正常及煙熏大鼠不同月份Hes1表達(dá)陽性率的比較

Table 1.The positive rate of Hes1 expression in the normal and smoking rats in different months (n=12)

TimeTreatmentHes1positive(%)1monthNormal0(0)Smoking3(25)3monthsNormal1(8.33)Smoking7(58.33)*6monthsNormal3(25)Smoking10(83.33)*

*P<0.05vsnormal.

6 人氣道黏膜中Hes1的mRNA表達(dá)水平與吸煙程度的關(guān)系

Hes1的mRNA表達(dá)在重度吸煙者明顯高于非吸煙者(P<0.05)，見圖5。

7 Hes1蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者吸煙程度的關(guān)系

非小細(xì)胞肺癌患者中重度吸煙者的Hes1蛋白表達(dá)明顯高于輕度吸煙者，其表達(dá)水平與吸煙程度呈正相關(guān)(2=4.583，P<0.05)，見圖6。

Figure 5.The mRNA expression of Hes1 in the airway mucosa of heavy smokers and non-smokers. M: marker; 1～10: the group of never smoking; 11～20: the group of severe smoking. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsnever smoking group.

圖5 人重度吸煙者和人非吸煙者氣道粘膜Hes1的mRNA表達(dá)

Figure 6.The protein expression of Hes1 in non-small-cell lung cancer patients detected by immunohistochemecal staining and the relationship between the expression level and the degree of smoking. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsnever smoking group.

圖6 Hes1蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與吸煙程度的關(guān)系

8 DAPT及Hes1-siRNA對(duì)CSC誘導(dǎo)的P70細(xì)胞增殖和凋亡的影響

10 μmol/L DAPT作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的存活率降低(88.90%)，且隨著DAPT的濃度升高及作用時(shí)間延長(zhǎng)，下降越明顯，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，50 μmol/L DAPT處理細(xì)胞72 h后，細(xì)胞的存活率僅為45.67%，見圖7A；集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，25 μmol/L DAPT能夠顯著抑制P70細(xì)胞的集落形成能力(P<0.01)，見圖7B。隨著DAPT濃度和作用時(shí)間的增加，P70細(xì)胞的凋亡率均逐漸增加，呈濃度和時(shí)間依賴性(P<0.05)，見圖8。熒光染色結(jié)果顯示，1 μL Lipofectamine 2000配50 nmol/L siRNA的轉(zhuǎn)染效率超過95%，見圖9。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組和siRNA-NC組相比，Hes1基因沉默的BEP2D-P70細(xì)胞增殖在24～72 h范圍內(nèi)均受到明顯抑制(P<0.05)；Annexin V-PI染色結(jié)果顯示，與control組和siRNA-NC組相比，Hes1基因沉默的BEP2D-P70細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)，見圖10。

Figure 7.The effects of DAPT on the BEP2D-P70 cell viability (A) and colony formation rate (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs24 h or 48 h；#P<0.05vscontrol.

圖7 MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DAPT對(duì)BEP2D-P70細(xì)胞增殖的影響

9 DAPT及Hes1基因沉默對(duì)P70細(xì)胞Notch1、Hes1和NICD表達(dá)的影響

根據(jù)上述細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)，為了能夠保持細(xì)胞的增殖及藥物作用很好的發(fā)揮，我們選擇DAPT終濃度為25 μmol/L作用細(xì)胞48 h。DAPT組中Notch1蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，而Hes1和NICD蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖11。與其它處理組比較，siRNA-Hes1組Hes-1的mRNA表達(dá)量顯著下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖12。

Figure 8.The effects of DAPT on the apoptosis of the BEP2D-P70 cells. A: the BEP2D-P70 cells treated with different concentrations of DAPT for 48 h and the apoptotic rates were analyzed by flow cytometry; B: the BEP2D-P70 cells were treated with DAPT at concentration of 25 μmol/L and the apoptotic rates were analyzed by flow cytometry at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L;△P<0.05vs25 μmol/L;#P<0.05vs24 h.

圖8 DAPT對(duì)BEP2D-P70細(xì)胞凋亡的作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性

討 論

香煙煙霧不僅可以通過煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)來調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡，而且可以通過促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、Ca2+通路、Akt信號(hào)通路等途徑發(fā)揮促進(jìn)增殖作用。有研究表明，CSC可誘導(dǎo)正常乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，增加神經(jīng)纖毛蛋白1(neuropilin-1，NRP-1)的表達(dá)[10]。我們前期研究證實(shí)CSC可以誘導(dǎo)IκB激酶ε表達(dá)，促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[11]，但對(duì)于煙草致肺癌的復(fù)雜分子機(jī)制目前還知之甚少。

Figure 9.Transfection efficiency of siRNA (1 μL Lipo fectamine 2000， 50 nmol/L siRNA) of the cells under fluorescence microscope.

圖9 熒光顯微鏡下細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染效率

Hes1基 因 定 位 于 3q28-q29， 屬于前神經(jīng)元堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)基因家族，幾乎表達(dá)于所有的未分化細(xì)胞中[12]，與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)。有研究證實(shí)，在T 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中，Hes1被異常激活后可通過 PTEN/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路阻止細(xì)胞凋亡[13]。Hes1在口腔鱗癌中的表達(dá)高于癌前病變[14]。Hes1能通過抑制cyclin依賴性激酶抑制因子p27Kip1的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。已知Hes1是Notch信號(hào)通路下游的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它與Notch信號(hào)通路相伴隨共同表達(dá)于多個(gè)物種。Notch蛋白由胞外區(qū)(Notch extracellular domain，NECD)和跨膜片段(Notch transmembrane fragment，NTM)2 個(gè)亞單位組成，在通路激活時(shí)腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶切割該蛋白S2 位點(diǎn)，釋放 Notch 蛋白的活化形式NICD，NICD 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，通過連接普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子、CBF1等調(diào)控Hes1基因最初的表達(dá)[16]，Hes1激活后，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲過程[17]。

Figure 10.The apoptosis (A) and proliferation (B) of BEP2D-P70 afterHes1 gene silencing. Control: BEP2D-P70 cells without transfection; siRNA-NC: BEP2D-P70 cells were transfected with plasmid without Hes1-siRNA; siRNA-Hes1: BEP2D-P70 cells were transfected with plasmid with Hes1-siRNA. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssiRNA-NC group.

圖10Hes1基因沉默后BEP2D-P70細(xì)胞的凋亡和增殖情況

Figure 11.The protein expression of Notch1, NICD and Hes1 in the BEP2D-P70 cells before and after treated with DAPT. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖11 DAPT作用前后Notch1、NICD和Hes1蛋白表達(dá)的變化

Figure 12.The mRNA expression of Hes1 after RNA interfe-rence. Mean±SD.n=3.*P<0.01vssiRNA-NC group.

圖12 RNA干擾Hes1后Hes1 mRNA表達(dá)的變化

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M了人類吸煙后支氣管上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞演變的歷程，更能貼近吸煙對(duì)支氣管、肺長(zhǎng)期作用的實(shí)際情況。首次探索進(jìn)行CSC長(zhǎng)期誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)至P70細(xì)胞。顯微鏡下觀察到P70細(xì)胞體積變大，開始呈復(fù)層生長(zhǎng)，排列紊亂，細(xì)胞群體出現(xiàn)無序的團(tuán)塊狀或條索狀生長(zhǎng)，無明顯的密度抑制和接觸性抑制。經(jīng)過軟瓊脂細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)CSC誘導(dǎo)的永生化正常支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化，表明支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型構(gòu)建成功。RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，煙草誘導(dǎo)支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化過程中存在Hes1表達(dá)上調(diào)；煙熏大鼠的氣道粘膜檢測(cè)證實(shí)隨著大鼠煙熏時(shí)間的延長(zhǎng)，Hes1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增高趨勢(shì)；為了進(jìn)一步證實(shí)吸煙對(duì)人氣道Hes1表達(dá)在吸煙誘導(dǎo)肺癌發(fā)生中的作用，我們采用RT-PCR及免疫組化法分別檢測(cè)了重度吸煙程度的正常氣道黏膜組織及NSCLC組織中Hes1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示重度吸煙人群中氣道黏膜Hes1的表達(dá)水平顯著增高，Hes1表達(dá)可能與吸煙導(dǎo)致肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)Hes1可能參與煙草相關(guān)肺癌的發(fā)生。

Hes1是Notch信號(hào)通路下游重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其活化可能與Notch信號(hào)通路的活化相關(guān)，本研究利用Notch通路阻斷劑DAPT及Hes1-siRNA，結(jié)果均顯示染毒P70細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，同時(shí)凋亡增加；進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DAPT能夠使染毒P70細(xì)胞的集落形成率明顯降低，表明DAPT對(duì)細(xì)胞的惡性表型有一定的逆轉(zhuǎn)作用，這種作用與下調(diào)Hes1表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。有研究表明，DAPT特異性較強(qiáng)，治療結(jié)腸癌過程中發(fā)現(xiàn)在有效劑量范圍內(nèi)導(dǎo)致毒副作用的可能性小[18]。同時(shí)有研究證實(shí)，DAPT或Hes1-siRNA能夠抑制胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為DAPT用于肺癌高危人群的早期干預(yù)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但Hes1參與吸煙誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的具體分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Role of Hes1 in malignant transformation of human bronchial epithelial cells induced by tobacco

HONG Lei1, ZHOU Ji-hong2, LI Wei1, CHEN Yu-qing1, JIANG Peng1, YUAN Na-na1, WANG Xiao-jing1, ZHU Mao-xiang3, YANG Zhi-hua3

(1DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,BengbuMedicalCollege，ProvincialKeyLaboratoryofRespiratoryDisease,Bengbu233004,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BengbuMedicalCollege,Bengbu233002,China;3InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China.E-mail:bbmccyq@126.com)

AIM: To investigate the role of transcription factor hairy and enhancer of split 1 (Hes1) in the malignant transformation of human bronchial epithelial cell line BEP2D induced by tobacco. METHODS: The BEP2D cells were chronically exposed to cigarette smoke condensate (CSC) at 1 cigarette per L until the 70th generation. The phenotype of malignant transformation of the cells induced by CSC was detected by soft agar clony formation assay. RT-PCR and Western blot were used to determined the expression of Hes1 at mRNA and protein levels in each generation of the cells. The proliferation and apoptosis of the BEP2D cells exposed to CSC were analyzed with the methods of MTT assay, flow cytometry and cell colony formation assay after treatment with Notch pathway bloker DAPT or liposome transfection with Hes1-siRNA. The expression of Hes1 in the peripheral small airway tissues of the smoking rats was evaluated by immunohistochemical staining. The expression of Hes1 in non-small-cell lung cancer and normal airway tissues was also detected by the methods of immunohistochemistry and RT-PCR. RESULTS: The BEP2D cells in the 70th generation had a malignant transformation phenotype. The expression of Hes1 in the BEP2D cells exposed to CSC for different time showed an increa-sing trend. DAPT and liposome transfection with Hes1-siRNA down-regulated the expression of Hes1, inhibited the cell proliferation and induced cell apoptosis. The expression of Hes1 in the airway mucosa of the rats exposed to cigarette smoke for 1 month and 6 months was significantly higher than that in control group. Cigarette smoking induced the expression of Hes1 in lung cancer and normal airway tissues. CONCLUSION: Hes1 may be involved in smoking-induced lung cancer by promoting the imbalance between apoptosis and proliferation.

Lung cancer; Smoking; Transcription factor Hes1; Cigarette smoke condensate

1000- 4718(2017)07- 1153- 10

2016- 08- 25

2017- 04- 19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81172213)；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 1408085MH14)；安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No. KJ2016A487)；安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室績(jī)效考核補(bǔ)助項(xiàng)目(No. 1506c085013)；安徽高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No. KJ2017A241)

R730.231； R734.2

A

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