MicroRNA-9通過NRP1抑制胃癌SGC-7901細胞上皮-間充質轉化功能*

南壽山， 王玨磊

(天津市第五中心醫(yī)院消化科，天津 300450)

MicroRNA-9通過NRP1抑制胃癌SGC-7901細胞上皮-間充質轉化功能*

南壽山△， 王玨磊

(天津市第五中心醫(yī)院消化科，天津 300450)

目的： 研究微小RNA-9 (microRNA-9，miR-9)對胃癌SGC-7901細胞上皮-間充質轉化(EMT)功能的影響及其相關機制。方法: SGC-7901胃癌細胞株分別轉染miR-9 mimics和陰性對照序列(negative control mi-mic，NCM)，作為miR-9組和NCM組，并設立未轉染對照(control)組，采用RT-qPCR法檢測各組細胞miR-9的含量，Transwell實驗檢測3組細胞遷移能力和侵襲能力，Western blot法檢測3組細胞的N-cadherin、E-cadherin、α-catenin和神經(jīng)纖毛蛋白1(NRP1)表達水平。采用Western blot法檢測NRP1過表達對miR-9抑制EMT的拮抗作用。雙螢光素酶實驗檢測miR-9與NRP1的關系。結果: miR-9組的miR-9 表達水平明顯上調(diào)，為control組的538倍(P<0.05)。miR-9組的遷移細胞數(shù)量明顯低于control組(P<0.05)。miR-9組的侵襲細胞數(shù)量明顯低于control組(P<0.05)。miR-9組細胞的N-cadherin和NRP1蛋白表達量明顯降低，E-cadherin及α-catenin蛋白表達量明顯升高。而NRP1及miR-9均過表達組胃癌細胞中N-cadherin蛋白表達量明顯升高， E-cadherin及α-catenin蛋白表達量明顯降低。雙螢光素酶檢驗結果顯示NRP1為miR-9的下游靶基因(P<0.05)。結論: miR-9可能通過降低下游靶基因NRP1水平影響EMT相關蛋白表達，抑制胃癌SGC-7901細胞的EMT功能。

胃癌； 微小RNA-9； 上皮-間充質轉化

胃癌發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第4位，死亡率居第2位，進展快，預后不良。由于其惡性度高，早期侵襲轉移等特點，5年生存率僅約30%～50%。雖然手術及放化療為主的胃癌綜合治療手段不斷更新，技術長足發(fā)展，但其總體生存率仍沒有明顯提高。所以目前迫切需要開發(fā)可以在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中抑制其侵襲轉移的手段，以提出新的治療策略，提高胃癌的總體療效。因此，尋找和研究在胃癌的上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中可以起到確切抑制作用的關鍵分子具有重要的科學意義。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-9(microRNA-9，miR-9)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系，可能通過多種分子生物途徑發(fā)揮抑癌作用，并其可能通過影響原癌基因神經(jīng)纖毛蛋白1(neuropilin-1，NRP1)等多種細胞功能蛋白的表達實現(xiàn)治療效果，有望成為包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的治療靶點。但在對胃癌進行miR-9含量的靶向干預后，對EMT和侵襲轉移的影響及其機制尚不明確[1]。本研究采用miR-9模擬物(mimics)轉染人胃癌細胞系SGC-7901細胞，觀察其對胃癌細胞EMT過程的影響，并進一步研究其胃癌細胞中對NRP1等功能蛋白表達水平的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

胃癌細胞株SGC-7901由本實驗室凍存。IMDM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；胰酶、PBS液、Trizol液和脂質體2000(LipofectamineTM2000)購自Invitrogen； Transwell小室購自NUNC； real-time PCR試劑盒購自TaKaRa；兔抗人NRP1、兔抗人N-cadherin、兔抗人α-catenin、兔抗人E-cadherin抗體及兔抗人β-actin抗體購自Abcam；miR-9模擬物及其陰性對照序列(negative control mimic，NCM)、miR-9及內(nèi)參照RNU6的PCR引物購自廣州亞科生物科技有限公司；雙螢光素酶檢驗試劑盒、野生型的WT-NRP1 psiCHECKTM-2載體、3’UTR定點突變后的MT-NRP1 psiCHECKTM-2載體和3’UTR定點突變的NRP1過表達質粒載體購自廣州愛科生物技術有限公司。

2 方法

2.1 miRNA轉染和miR-9含量的RT-qPCR檢測 復蘇培養(yǎng)SGC-7901胃癌細胞株，以含有20%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中。細胞融合度達40%時，按照轉染試劑LipofectamineTM2000試劑說明書，以終濃度為45 nmol/L分別轉染miR-9 mimics和NCM 48 h，作為miR-9和NCM組，并設立未轉染對照(control)組，同時進行后續(xù)功能實驗檢測。

Trizol法提取各組總細胞RNA，逆轉錄合成cDNA。以RNU6 作為內(nèi)參照，進行RT-qPCR檢測。miR-9的上游引物為5’-GAGGCAGACAGCCAGACA-3’，下游引物為5’-CAAGGGTCCGAGGTGCGT-3’；RNU6的上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR反應條件按照課題組既往報道方法進行[2-3]，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進行分析計算。

2.2 Transwell實驗檢測細胞遷移能力和侵襲能力 分組轉染后，各組細胞分別取對數(shù)期1×105個細胞150 μL無血清培養(yǎng)基重懸后加入Transwell小室上室，Transwell下室加入500 μL含血清完全培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)箱37 ℃常規(guī)培養(yǎng)48 h，棄去上室培養(yǎng)液，取下上室底膜，清除未穿膜上室細胞，甲醇固定穿膜細胞15 min，PBS沖洗3遍。1%結晶紫染色20 min，PBS沖洗3遍。取下上室底膜，光鏡下觀察并計數(shù)穿過小孔細胞評價細胞遷移能力。將Matrigel膠稀釋后，每個Transwell小室加入50 μL，37 ℃孵育3 h凝固。同前Transwell實驗方法，將分組轉染后的細胞重懸于無血清培養(yǎng)基后，接種入Transwell小室上室，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出小室。擦除未過膜細胞后甲醇固定，1%結晶紫染色，顯微鏡下拍照，光鏡下觀察并計數(shù)穿過小孔細胞評價細胞侵襲能力。

2.3 Western blot法檢測細胞蛋白表達的變化 胃癌細胞分組轉染后48 h，按照既往報道方法收集細胞，提取總蛋白，進行Western blot實驗檢測NRP1蛋白，間充質細胞標志物E-cadherin，上皮細胞標志物α-catenin及E-cadherin，內(nèi)參照β-actin蛋白的表達。

2.4 NRP1過表達對miR-9抑制EMT的拮抗作用 采用NRP1過表達質粒轉染miR-9組細胞系，并通過Western blot檢測NRP1過表達后miR-9組SGC-7901細胞中間充質細胞標志物和上皮細胞標志物的表達情況。

2.5 雙螢光素酶實驗檢測miR-9與NRP1的關系 采用野生型的NRP1 psiCHECKTM-2載體及定點突變后的NRP1 psiCHECKTM-2載體，分別和miR-9 mimics一起通過脂質體共轉染，轉染48 h后行雙螢光素酶檢驗。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SGC-7901細胞中miR-9的水平

miR-9 mimics轉染SGC-7901細胞24 h 后，檢測各組細胞中miR-9 和內(nèi)參照RNU6的表達水平。結果顯示，miR-9組miR-9 的表達水平明顯上調(diào)，其表達水平約是control組的538倍左右(P<0.05)，而NCM組的miR-9表達水平與control組的差異沒有統(tǒng)計學顯著性，見圖1。

Figure 1.Comparison of the miR-9 levels in 3 groups of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1 3組SGC-7901細胞miR-9水平的比較

2 miR-9對SGC-7901細胞遷移能力的影響

Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過48 h培養(yǎng)，miR-9組遷移細胞數(shù)量明顯低于control組，而NCM組的細胞數(shù)量與control組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

3 miR-9對SGC-7901細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過48 h培養(yǎng)，觀察受到染色的穿膜細胞數(shù)量。發(fā)現(xiàn)miR-9組侵襲細胞數(shù)量明顯低于control組，而NCM組的細胞數(shù)量與control組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The effect of miR-9 on the migration ability of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 miR-9對SGC-7901細胞遷移能力的影響

Figure 3.The effect of miR-9 on the invasion ability of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 miR-9對SGC-7901細胞侵襲能力的影響

4 miR-9對SGC-7901細胞EMT相關功能蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示，與control組相比，miR-9組間充質細胞標志物N-cadherin蛋白表達量明顯降低，上皮細胞標志物E-cadherin及α-catenin蛋白表達量明顯升高(P<0.05)，而NCM組與對照組之間的蛋白表達無明顯差異,見圖4。這說明miR-9抑制EMT過程的效果顯著，且同時抑制間充質細胞標志物的表達，促進上皮細胞標志物的表達。

Figure 4.The effect of miR-9 on the expression of EMT-related proteins in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 miR-9對SGC-7901細胞EMT相關功能蛋白表達的影響

5 miR-9對SGC-7901細胞NRP1蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示，與control組相比，miR-9組的NRP1蛋白表達量明顯降低(P<0.05)，而NCM組與對照組之間的NRP1蛋白表達量的差異無統(tǒng)計學顯著性,見圖5。NRP1的蛋白表達量與miR-9的RT-qPCR結果表現(xiàn)出負相關關系。這說明miR-9抑制NRP1蛋白表達的效果顯著。

6 NRP1過表達對miR-9抑制胃癌細胞EMT的拮抗效果

Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，采用NRP1過表達質粒轉染miR-9組細胞，伴隨NRP1表達量的升高，miR-9組胃癌細胞中間充質細胞標志物N-cadherin蛋白表達量明顯升高，上皮細胞標志物E-cadherin及α-catenin蛋白表達量明顯降低(P<0.05)，見圖6。

7 miR-9與NRP1相互作用關系的雙螢光素酶實驗檢測

雙螢光素酶檢驗結果顯示miR-9能明顯抑制野生型WT-NRP1 psiCHECKTM-2載體的螢光強度(P<0.05)，而無法抑制3’UTR定點突變后MT-NRP1 psiCHECKTM-2載體的螢光強度，說明NRP1為miR-9的下游靶基因，見圖7。

Figure 5.The effect of miR-9 on the protein expression of NRP1 in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 miR-9對SGC-7901細胞NRP1蛋白表達的影響

Figure 6.The effect of miR-9 on the expression of EMT-related proteins in SGC-7901 cells with or without NRP1 overexpression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 NRP1過表達拮抗miR-9對SGC-7901細胞EMT相關功能蛋白表達的影響

討 論

MicroRNA是一類在動植物細胞中對多種基因起到廣泛調(diào)控作用的重要非編碼RNA，在細胞的發(fā)育、增殖、分化中發(fā)揮重要的功能。其主要可以與靶蛋白的mRNA 3’ UTR形成互補配對，進而使其降解，從而抑制其翻譯，負性調(diào)控靶基因的表達[4]。miR-9是較早發(fā)現(xiàn)的microRNA之一，最早發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)中具有重要作用，進而研究發(fā)現(xiàn)其在多種類型的腫瘤中發(fā)生表達水平異常，廣泛參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移[5]。本研究采用miR-9 mimics成功實現(xiàn)了對胃癌SGC-7901細胞遷移能力和侵襲能力的抑制，說明miR-9對胃癌細胞具有基因治療效果。

Figure 7.The relative luciferase activity of NRP1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖7 NRP1螢光素酶活性的比較

目前認為，腫瘤遷移和侵襲的發(fā)生是一種多因素多步驟的動態(tài)過程，EMT功能在腫瘤的遷移和侵襲過程中具有決定性作用[6]。本研究結果顯示，miR-9對胃癌細胞遷移能力和侵襲能力的抑制作用，可能是通過影響EMT過程實現(xiàn)的。

miR-9可在腫瘤細胞中，參與調(diào)節(jié)多種靶基因，調(diào)控多種靶蛋白的翻譯和表達，參與對腫瘤細胞生物學過程的調(diào)節(jié)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9參與調(diào)控CXCR4蛋白水平，抑制鼻咽癌細胞的侵襲和轉移。也有研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)CBX7蛋白的表達，抑制膠質瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[7]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，miR-9對卵巢癌細胞的抑制作用是通過NF-κB蛋白實現(xiàn)的[8]。但是目前對miR-9作用于胃癌細胞的靶蛋白仍不明確[9]。有研究認為，miR-9在部分惡性腫瘤細胞中，可能通過降低下游靶基因NRP1水平而影響EMT相關蛋白表達[10]。NRP1是廣泛存在于真核細胞中的一種跨膜信號轉導蛋白，其表達水平與包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細胞的增殖和轉移呈正相關關系。所以，本課題對miR-9作用于胃癌細胞后，細胞中的NRP1蛋白表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)miR-9水平升高后， NRP1水平明顯降低。我們同時發(fā)現(xiàn)，國際上有相關類似研究，報道了miR-9可能在惡性黑色素瘤細胞、神經(jīng)母細胞瘤細胞及人臍靜脈細胞融合細胞等細胞中通過與NRP1的mRNA 3’ UTR形成互補配對，進而使其降解，從而實現(xiàn)抑制其翻譯，負性調(diào)控靶基因的表達。這促使我們對NRP1是否在胃癌細胞是miR-9的靶蛋白進行深入探索。本研究進而通過采用3’ UTR突變的NRP1過表達質粒轉染實驗及雙熒光素酶實驗證實，NRP1在胃癌SGC-7901細胞中為miR-9的下游靶基因，miR-9對NRP1蛋白表達抑制作用的起效途徑是通過與NRP1 mRNA的3’ UTR互補配對產(chǎn)生的。

綜上所述，miR-9可能通過降低下游靶基因NRP1水平影響EMT相關蛋白表達，進而抑制胃癌SGC-7901細胞的EMT功能，有可能成為胃癌基因治療的良好靶點。

[1] Cui Y, Han Z, Hu Y, et al. MicroRNA-181b and microRNA-9 mediate arsenic-induced angiogenesis via NRP1[J]. J Cell Physiol, 2012, 227(2):772-783.

[2] Wang J, Ou J, Guo Y, et al. TBLR1 is a novel prognostic marker and promotes epithelial-mesenchymal transition in cervical cancer[J]. Br J Cancer, 2014, 111(1):112-124.

[3] 南壽山, 靳 榮, 竇廣仙. 胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的病理特征與療效相關性分析[J]. 吉林醫(yī)學, 2013, 34(8):1434-1435.

[4] 譚曉勇, 羅 茂, 盧培林, 等.miR-30c 調(diào)控 PAI-1對血管內(nèi)皮細胞活力和遷移的影響[J]. 中國病理生理雜志， 2016， 32(12):2199-2204.

[5] 鄭朝攀, 韓 靈, 侯偉堅, 等.負向調(diào)控miR-9抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲[J].中國病理生理雜志, 2014, 30(4):640-644.

[6] Yang J, Li T, Gao C, et al. FOXO1 3’ UTR functions as a ceRNA in repressing the metastases of breast cancer cells via regulating miRNA activity[J]. FEBS Lett, 2014, 588(17):3218-3224.

[7] Yang DS. Novel prediction of anticancer drug chemosensitivity in cancer cell lines: evidence of moderation by microRNA expressions[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2014, 2014:4780-4786.

[8] Huang X, Teng Y, Yang H, et al. Propofol inhibits invasion and growth of ovarian cancer cells via regulating miR-9/NF-κB signal[J]. Braz J Med Biol Res, 2016, 49(12):e5717.

[9] Suarez-Arriaga MC, Ribas-Aparicio RM, Ruiz-Tachiquin ME. MicroRNAs in hereditary diffuse gastric cancer[J]. Biomed Rep, 2016, 5(2):151-154.

[10]Xu D, Chen X, He Q, et al. MicroRNA-9 suppresses the growth, migration, and invasion of malignant melanoma cells via targeting NRP1[J]. Onco Targets Ther, 2016,9:7047-7057.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

MicroRNA-9 inhibits epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer SGC-7901 cells by NRP1

NAN Shou-shan, WANG Jue-lei

(DepartmentofGastroenterology，TianjinFifthCentralHospital,Tianjin300450,China.E-mail:nanshoushan@163.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of microRNA-9 (miR-9) on epithelial-mesenchymal transition (EMT) in the gastric cancer SGC-7901 cells and its mechanism. METHODS: The gastric cancer cell line SGC-7901 was transfected with miR-9 mimics or negative control mimic (NCM), as miR-9 or NCM group, respectively. The SGC-7901 cells without transfection were used as control group. The expression level of miR-9 in each group was detected by RT-qPCR. The migration and invasion abilities of the SGC-7901 cells in the 3 groups were detected by Transwell assay. The protein expression of N-cadherin, E-cadherin, α-catenin and neuropilin-1 (NRP1) was determined by Western blot. Antagonistic effect of NRP1 over-expression on miR-9 inhibition of EMT was detected by Western blot. The relationship between miR-9 and NRP1 was analyzed by dual luciferase assay. RESULTS: The expression level of miR-9 in miR-9 group was significantly up-regulated, which was 538 times higher than that in control group (P<0.05). The number of migratory cells in miR-9 group was significantly lower than that in control group (P<0.05). Compared with control group, the protein expression of N-cadherin and NRP1 in miR-9 group was significantly decreased, while the protein expression of E-cadherin and α-catenin protein was significantly increased. Over-expression of NRP1 resulted in the increase in the protein expression of N-cadherin in the gastric cancer cells of miR-9 group, and the decrease in the protein expression of E-cadherin and α-catenin significantly. The result of dual luciferase assay showed thatNRP1 was a downstream target gene of miR-9 (P<0.05). CONCLUSION: miR-9 may inhibit the expression of EMT-related proteins through the downstream target geneNRP1, thus inhibiting the EMT of gastric cancer SGC-7901 cells.

Gastric cancer; MicroRNA-9; Epithelial-mesenchymal transition

1000- 4718(2017)07- 1191- 05

2017- 01- 03

2017- 03- 14

濱海新區(qū)衛(wèi)生局基金資助項目(No.2013BWKY031)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.006

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 022-65665412； E-mail： nanshoushan@163.com