黃羽肉雞心包積水-肝炎綜合征不同組織中病毒含量的比較

盧受昇，孫彥偉，余希堯，高慧敏，鄧國東

（廣東省動物衛(wèi)生監(jiān)督總所，廣東廣州 510230）

黃羽肉雞心包積水-肝炎綜合征不同組織中病毒含量的比較

盧受昇，孫彥偉，余希堯，高慧敏，鄧國東

（廣東省動物衛(wèi)生監(jiān)督總所，廣東廣州 510230）

心包積水-肝炎綜合征（HHS）是雞的一種新發(fā)傳染病，可導(dǎo)致較高的死亡率，對養(yǎng)雞業(yè)構(gòu)成重大威脅。本研究應(yīng)用Taqman熒光PCR檢測方法，對一自然病例中病死雞不同組織樣品相對病毒濃度進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示不同組織平均病毒濃度從高到低依次為：肝＞肺＞脾＞腎＞腸＞氣管＞胸腺＞心＞腦＞心胞液＞胰腺＞咽/肛。不同組織間病毒濃度相差較大。其中，肝臟的病毒濃度最高，較其他組織高出約1～4個數(shù)量級，故肝臟可作為診斷、監(jiān)測及疫苗制備的首選靶組織；心胞液中病毒濃度并不高，僅為肝臟的0.22%；拭子樣品病毒濃度最低，提示若采用拭子樣品進(jìn)行檢測時，漏檢的機(jī)率較大，需通過增加采樣數(shù)量等方法來彌補(bǔ)樣品靈敏度不足的問題。本研究為該病的監(jiān)測、診斷和研究提供了依據(jù)。

心包積水-肝炎綜合征；不同組織；病毒濃度

心包積水-肝炎綜合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS），又稱安卡拉病，是雞的一種危害較大的新發(fā)傳染病。該病由腺病毒科禽腺病毒屬Ⅰ群C種4血清型病毒（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）引起。2011年山東省白羽肉雞首先出現(xiàn)該病[1]。其后，該病在河南、湖北、江蘇、安徵、江西等省流行。除白羽雞外，蛋雞、黃羽雞及地方品種均有發(fā)病的報道[2-4]。對于此新發(fā)傳染病，許多發(fā)病機(jī)理傳播機(jī)制尚待研究，了解病毒的組織嗜性是疫病防控的重要條件之一。當(dāng)前，除有雞胚組織中病毒含量測定的報道外[5]，病死雞各組織中的病毒分布未見報道。本研究應(yīng)用熒光定量PCR方法，對自然病例各組織中的病毒含量進(jìn)行相對定量，旨在明確本病的組織嗜性，為本病的診斷、檢測提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1樣品。病死雞7只，來自某發(fā)病雞場，采集其心、心胞液、肝、脾、肺、腎、胸腺，咽拭子、泄殖腔拭子及十二指腸等組織樣品。

1.1.2試劑。熒光PCR預(yù)混試劑Premix Ex Taq（Probe qPCR），寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA柱式提取試劑盒，北京世紀(jì)元亨產(chǎn)品；FAdV-4引物和探針，自行設(shè)計；定量 PCR儀，Lightcycle 480 羅氏公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1樣品的制備。分3點剪取各種組織共約0.3～0.5 g，電子天平稱重，按1:3加入PBS，用微量振蕩研磨儀研磨1 min，離心備用；心包液按1:3用PBS進(jìn)行稀釋；拭子樣品（加入0.5 mLPBS）浸出液也按1:3用PBS進(jìn)行稀釋。

1.2.2樣品的檢測。檢測用自行建立的熒光PCR方法（另文發(fā)表），反應(yīng)體系與程序為Premix ExTap （2×）10 μL，上、下游引物（10 pmol/ μL）各0.4 μL；探針（10 pmol/μL）1.6 μL；模板3 μL，DEPC水5.6 μL。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性 2 min，94℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5個循環(huán)；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，60 ℃反應(yīng)結(jié)束后收集熒光。每份樣品做3個重復(fù)檢測。

1.3數(shù)據(jù)處理分析

將每份樣品3次重復(fù)檢測的熒光PCR反應(yīng)的CT值取平均值，作為單份樣品的檢測結(jié)果，并計算標(biāo)準(zhǔn)差。為評估不同組織的含毒量差異，對各病死雞同種組織的CT值進(jìn)行平均，并進(jìn)行顯著性檢驗。為更直觀地比較不同樣品間病毒濃度，將CT值最高（即病毒濃度最低）樣品的病毒含量指定為1，以此為基準(zhǔn)，計算其他樣品與該樣品病毒含的比值。因濃度最高樣品與參照樣品比值過大，將數(shù)據(jù)取以10為底的對數(shù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1樣品PCR檢測結(jié)果

羅氏 Lightcycle 480 熒光PCR檢測圖見圖1；各樣品檢測結(jié)果見表1。

圖1 1～3號雞樣品檢測結(jié)果

表1各樣品檢測結(jié)果

2.2不同組織病毒含量排序

從平均CT值分析：含量最高的為肝組織，CT值平均為16.81，含量最低的為咽肛拭子樣品，CT值平均為28.95，差異較大。其他不同組織間也存在病毒含量差異。按平均CT值統(tǒng)計病毒含量，由高到低的排序依次為肝＞肺＞脾＞腎＞腸＞氣管＞胸腺＞心＞腦＞心胞液＞胰腺＞咽/肛拭子（表1）。其中肝中的病毒含量最高；其次為肺、脾；再次為腎、腸、氣管、胸腺、心、腦、心胞液、胰腺等；最低為拭子樣品。

2.3各組織間相對病毒含量分析

2.3.1不同雞只的病毒含量差較大。如圖2所示，該自然發(fā)病病例中，可分為3種類型：一是高病毒含量型，各組織中病毒含量均高，組織間的差異相對較小，例如1、5、6號雞；二是中等病毒含量型，除肝組織中病毒含量較高外，其他組織中的含量相對較低，差異較大，例如2、3號雞；三是低病毒含型，各組織中病毒含量均低，肝組織中的病毒含量也不突出，咽/肛拭子中的病毒含量相對較高，例如4、7號。在自然病例中，由于個體感染的病毒量、感染時間、其他常規(guī)細(xì)菌繼發(fā)感染與否，以及所處病程階段的不同，導(dǎo)致病毒含量的個體差異較大。

2.3.2不同組織間病毒含量差異較大。病毒含量最高的1號雞肝組織樣品是最低的7號雞的胰腺樣品的56.84萬倍（105.75）。就7只雞均值而言，肝較肺、脾高出1～2個數(shù)量級（分別為17.67和27.71倍）；較腎、腸、氣管、胸腺和心等高出2個數(shù)量級（分別為103.82、128.27、142.32、166.01和190.51倍）；較腦、心胞液和胰腺等高出2～3個數(shù)量級（分別為384.37、456.56和508.46倍）；較拭子樣等樣品高3～4個數(shù)量級（分別為4 491.56、4 496.75倍）。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前該病毒分離培養(yǎng)尚無靈敏度高方法。雞胚接種效率較低，對病毒量不高的樣品很難培養(yǎng)成功。普通PCR方法靈敏度亦有限，并且進(jìn)行相對定量難度較大，故本實驗選用自行建立的敏感性較高熒光PCR方法。因個體差異的存在，需對多個個體的均值來對各組織的病毒含量進(jìn)行評估。而樣品數(shù)量較多，每個樣品又有3個重復(fù)，受儀器通量限制無法同時進(jìn)行檢測，因此在確保同一個體的樣品置于同一反應(yīng)中進(jìn)行的基礎(chǔ)上，所有熒光PCR反應(yīng)液是統(tǒng)一配置分裝，并在同一臺儀器上進(jìn)行檢測，這在一定程度上解決了各雞只間的可比性問題。

本檢測結(jié)果表明，肝臟是病毒含量最高的組織，含量分別是排在第2、3位的肺、腎等組織的17.67、27.71倍，較其他組織中的病毒含量高出更多。故本研究說明肝臟是該病診斷采樣組織的首選，也是制備疫苗等其他生物制品的首選組織。本病一大特征為包涵體肝炎，肝臟中有多量病毒聚集成光學(xué)顯微鏡可見的包涵體，在其他器官中未見，這也是肝臟中含毒量高的另一種表現(xiàn)形式。邱麗葉等[5]對接種病毒后雞胚組織中病毒含量進(jìn)行測定，也有類似的結(jié)果，但隨接種途徑不同，組織嗜性有所不同，經(jīng)卵黃囊途徑和尿囊腔途徑，病毒的主要嗜性組織為肝臟，經(jīng)尿囊膜途徑接種，病毒的主要嗜性組織為尿囊膜，其中卵黃囊途徑FAdV增殖能力最強(qiáng)。

圖2各種組織相對病毒濃度

除肝炎外，本病的另一解剖病變特點為心包積液。但心包液中病毒含量并不高，只略高于胰腺和咽/肛拭子樣品，僅為肝臟的0.22%，這一點出乎意料。同時，接種雞胚進(jìn)行病毒分離時，尿囊液中病毒含量也不高，這是否能說明本病毒具有不易進(jìn)入體液的特性，尚有待進(jìn)一步研究。

拭子樣品中的平均病毒含量最低。呼吸道、消化道是病毒排出體外的重要途徑。而咽/泄殖腔拭子樣品采集便捷，無損傷，成為家禽疫病病原學(xué)監(jiān)測的理想樣品。但本研究表明拭子樣品中的病毒含量低，提示用拭子樣品進(jìn)行檢測，出現(xiàn)漏檢的幾率較大。但本研究中發(fā)現(xiàn)個別雞只的拭子樣品病毒含量較高，如7號雞的肛拭子和4號雞的咽/肛拭子樣品，說明檢測過程中可通過擴(kuò)大采樣數(shù)量來解決樣品靈敏度不足的問題。

[1] CHOI K S，KYE S J，KIM J Y，et al. Epidemiological investigation of outbreaks of fowl adenovirus infection in commercial chickens in Korea [J]. Poultry Science，2012，91：2502-2506.

[2] 常維山，王濤. 雞心包積液綜合征（安卡拉?。┎≡蛛x檢測[J]. 中國動物保健，2015，17（12）：25-26.

[3] YE J Q，LIANG G C，ZHANG J J，et al. Outbreaks of serotype 4 fowl adenovirus with novelgenotype，China [J]. Emerging Microbes and Infections，2016，5（5）：50-51.

[4] 羅玲，趙康，張媛，等. 雞心包積水綜合征病原的分離與鑒定[J]. 中國禽業(yè)，2016，38（6）：56-58.

[5] 邱麗葉，李慧昕，王娟，等. 不同接種途徑對禽腺病毒在雞胚中增殖的影響[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2016，38（4）：275-278.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Comparison of Virus Content in Different Tissues of Hydropericardium Hepatitis Syndrome in Yellow Broiler Chickens

Lu Shousheng，Sun Yanwei，Yu Xiyao，Gao Huimin，Den Guodong
（Guangdong Animal Health Supervision Institution，Guangzhou，Guangdong 510230）

Hydropericardium hepatitis syndrome（HHS）is a novel infectious disease，causing huge economic losses in the poultry industry. In this paper，with Taqman real-time PCR method，the relative virus concentrations in different tissue samples of a natural case dead chickens were measured. The results showed that the average concentration of virus in different tissues in order from high to low were：liver＞ lung ＞ spleen ＞ kidney ＞ intestine ＞ trachea ＞ thymus ＞ heart＞ brain ＞ cardiac fl uid ＞ pancreas ＞ throat /anal swab. The virus concentration among different tissues varied greatly，in which the liver virus concentration was the highest，higher than the other tissues of about 1 to 4 in the order of 10 magnitude. So liver can be used as the preferred target tissue of diagnosis，monitoring and vaccine preparation. The virus concentration of heart cytosol was not high，only 0.22% of the livers. Swab samples of virus were the lowest. It was suggested that if the swab samples were monitored，the probability of missed detection was greater，and it was necessary to increase the number of samples and other methods to make up for the lack of sample sensitivity. This paper provides a basis for the monitoring，diagnosis and research of the disease.

Hydropericardium hepatitis syndrome；different tissues；virus concentration

S851.3

B

1005-944X（2017）08-0104-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.027